Αφηρημένο

Ιός των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) είναι ο αιτιολογικός παράγοντας για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Ωστόσο, η μόλυνση με HPV δεν είναι επαρκής για να προκαλέσει καρκίνο του τραχήλου, επειδή οι περισσότερες γυναίκες που έχουν μολυνθεί αναπτύσσουν παροδική επιθηλιακά δυσπλασίες που υποχωρούν αυθόρμητα. Πρόοδος σε διηθητικό καρκίνο έχει αποδοθεί σε διάφορους παράγοντες ξενιστή όπως ανοσολογική ή ορμονική κατάσταση, καθώς δεν υπάρχουν επαναλαμβανόμενες γενετικές μεταβολές έχουν ταυτοποιηθεί σε καρκίνους του τραχήλου. Έτσι, το πιεστικό ζήτημα ως προς τη βιολογική βάση του τραχήλου της μήτρας εξέλιξης του καρκίνου έχει παραμείνει άλυτο, εμποδίζουν την ανάπτυξη νέων θεραπειών και προγνωστικές εξετάσεις. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι τουλάχιστον το 20% των καρκίνων του τραχήλου λιμάνι σωματικά, απέκτησε μεταλλάξεις στο LKB1

ογκοκατασταλτικό. Περίπου το ήμισυ των όγκων με μεταλλάξεις έτρεφε απλές υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων ή μικροδιαγραφές αναγνωρίσιμα από αλληλούχιση εξόνιο, ενώ το άλλο μισό έτρεφε μεγαλύτερη μο- νοαλληλική ή διαλληλικούς διαγραφές ανιχνεύσιμη με πολλαπλή ενίσχυση καθετήρα απολίνωση (MLPA). Διαλληλικών μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στα περισσότερα τραχήλου κυτταρικές γραμμές καρκίνου? HeLa, η πρώτη ανθρώπινη κυτταρική σειρά, φιλοξενεί ένα ομόζυγο 25 kb διαγραφή που συνέβησαν

in vivo

.

LKB1

αδρανοποίηση των πρωτογενών όγκων που σχετίζονται με την εξέλιξη της επιταχυνόμενης νόσου. Η διάμεση επιβίωση ήταν μόλις 13 μήνες για τους ασθενείς με

LKB1

ελλιπή ως όγκους, αλλά & gt? 100 μήνες για τους ασθενείς με

LKB1

-wild όγκους τύπου (

P

= 0.015, συνδεθείτε τεστ rank? αναλογία κινδύνου = 0,25, 95% CI = 0,083 έως 0,77).

LKB1

αποτελεί μείζονα καταστολέα του τραχήλου της μήτρας όγκων, αποδεικνύοντας ότι απέκτησε γενετικές μεταβολές οδηγούν την εξέλιξη του ιού HPV που προκαλείται δυσπλασίες σε επεμβατικές, θανατηφόρες μορφές καρκίνου. Επιπλέον,

LKB1

κατάσταση μπορεί να αξιοποιηθεί κλινικά για την πρόβλεψη υποτροπής της νόσου

Παράθεση:. Wingo SN, Gallardo TD, Akbay ΕΑ, Liang M-C, Κοντρέρας CM, Boren T, et al. (2009) Σωματικές

LKB1

Μεταλλάξεις Προώθηση καρκίνο του τραχήλου Εξέλιξη. PLoS ONE 4 (4): e5137. doi: 10.1371 /journal.pone.0005137

Επιμέλεια: Syed A. Αζίζ, Health Canada, Καναδάς

Ελήφθη: 20 Φεβρουαρίου 2009? Αποδεκτές: 10 Μάρτη του 2009? Δημοσιεύθηκε: 2 Απριλίου, 2009

Copyright: © 2009 Wingo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε μέσω του Sidney Kimmel Μεταγραφική Science Βραβεία σε DHC, KKW, NB, και NES, μια ΝΙΗ NRSA F31 υποτροφία για να CMC, μια Νέων Ερευνητών Βραβείο από την αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία /UT Southwestern Simmons Comprehensive Cancer Center στο DHC, και το Εθνικό Κέντρο Ερευνητικού Δυναμικού (K26RR024196) (DHC). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του τραχήλου είναι ένας από τους πιο κοινούς καρκίνους σε όλο τον κόσμο, με πάνω από 500.000 νέα κρούσματα και 250.000 θανάτους κάθε χρόνο. Στον αναπτυσσόμενο κόσμο, ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο στις γυναίκες [1]. Η μόλυνση των επιθηλιακών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας με ένα μεταδοτικό παράγοντα του ιού των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) -είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, όπως HPV DNA αλληλουχίες είναι ανιχνεύσιμα σε & gt? 99% του τραχήλου της μήτρας όγκων [2], [3]. Η μόλυνση με HPV υποτύπους «υψηλού κινδύνου» εκκινεί εξέλιξης του όγκου με την κατάργηση του ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και απόπτωση μέσω των σημείων ελέγχου των ιικών ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7, οι οποίες απενεργοποιούν την ρ53 και RB οδών καταστολέα όγκου αντίστοιχα [2]. Αυτό οδηγεί στον σχηματισμό του μη επιθετικού τραχήλου δυσπλασιών (

in situ

), γνωστό ως Υψηλής ποιότητας πλακωδών Ενδοεπιθηλιακή αλλοιώσεις, ή HSILs) [3], [4], [5]. Ωστόσο, αυτά τα HPV-επαγόμενη δυσπλασίες είναι ασυμπτωματικοί και πλέον υποχωρούν, αποδεικνύοντας ότι η HPV δεν είναι επαρκής για να οδηγήσει σε καρκίνο του τραχήλου [2]. Η εξέλιξη του τραχήλου της μήτρας δυσπλασίες σε επεμβατικές, θανατηφόρα τραχήλου της μήτρας έχει αποδοθεί σε διάφορους παράγοντες, όπως το ανοσοποιητικό, ορμονικό και διατροφική κατάσταση, ή συν-λοίμωξη με άλλους παράγοντες σεξουαλικά μεταδιδόμενες, αλλά υποστηρικτικά στοιχεία έχουν αμφίβολα [2]. Παρεμβολής μεταλλαξογένεση με HPV είναι ένας άλλος προτεινόμενος μηχανισμός προαγωγής όγκων, αλλά πρόσφατες μελέτες δεν έχουν υποστηρίξει αυτή την υπόθεση [6]. Δεν έχουν κοινή, επαναλαμβανόμενες γενετικές αλλοιώσεις που συνεργάζονται με HPV για την προώθηση του τραχήλου της μήτρας εξέλιξης του καρκίνου έχουν ταυτοποιηθεί από το Harald zur Hausen εντοπίστηκε για πρώτη φορά HPV ως αιτιώδης μεταδοτικό παράγοντα του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας πάνω από τριάντα χρόνια [7]. Έτσι, το πιεστικό ερώτημα ως προς τη βιολογική βάση του τραχήλου της μήτρας εξέλιξης του καρκίνου έχει παραμείνει άλυτο.

μεταλλάξεις βλαστικής σειράς στο αποτέλεσμα

LKB1

ογκοκατασταλτικό γονίδιο (γνωστός και ως

STK11

) σε Σύνδρομο Peutz-Jeghers (PJS), μια κληρονομική πάθηση που χαρακτηρίζεται από καλοήθεις πολύποδες του γαστρεντερικού και αυξημένα (& gt? 15 ×) κίνδυνο κακοήθους επιθηλιακών καρκίνων σε διάφορες ανατομικές περιοχές [8]. Η

LKB1

γονίδιο δείχθηκε πρόσφατα να υποβληθεί σε σωματική μετάλλαξη σε & gt? 30% των μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα [9], [10], υποδηλώνοντας ότι

LKB1

μπορεί να παίζει ένα ευρύ όγκο καταστολέα ρόλο. Αυτό, σε συνδυασμό με τα πρόσφατα ευρήματα μας ότι

LKB1

αδρανοποίηση στη μήτρα ή επιδερμίδα ποντίκι προωθεί την επιθετική του ενδομητρίου και καρκινώματα πλακωδών κυττάρων [11], [12], μας ώθησε να διερευνήσει το ρόλο του

LKB1

στην του τραχήλου της μήτρας εξέλιξης του καρκίνου.

Αποτελέσματα

σωματικά-Επίκτητης

LKB1

μεταλλάξεις είναι κοινή στον καρκίνο του τραχήλου της Μήτρας σε όλη ιστολογική υπότυποι

αλληλουχίας του

LKB1

γονίδιο σε πρωτογενείς όγκους του τραχήλου της μήτρας που προσδιορίζονται σωματικώς-επίκτητη (μη-βλαστικής γραμμής) μεταλλάξεις σε 8/86 δείγματα (9%) (Πίνακας 1, Πίνακας S1, Σχήμα 1Α). Εκτός από τα άλλα ευρήματα που παρουσιάζονται παρακάτω, αρκετές παρατηρήσεις υποστηρίζουν ότι αυτές οι μεταλλάξεις είναι ως απενεργοποίησης ομάδα,

καλόπιστους

καρκινογόνες μεταλλάξεις. Πρώτον, 4/8 όγκους έτρεφε μεταλλάξεις χωρίς νόημα, διαγραφές ή παρεμβολές με αποτέλεσμα μετατόπιση πλαισίου και πρόωρο τερματισμό. Τα υπόλοιπα τέσσερα όγκοι harbored μεταλλάξεις της περιοχής της κινάσης στα υπολείμματα συντηρημένα σε είδη σπονδυλωτών, και δύο από αυτούς τους όγκους harbored μία γνωστή μετάλλαξη PJS (p.Arg304Trp) που καταργεί δραστικότητα LKB1 κινάσης [13], [14], [15]. Τέλος, μόνο το 1/9 κωδικοποίησης παραλλαγές ήταν της βλαστικής σειράς προέλευσης, έναντι 7/7 παραλλαγές μη κωδικοποιητικές, μια διαφορά που είναι στατιστικά σημαντική (p = 0,0014, ακριβής δοκιμασία Fisher), δεδομένου ότι η ενιαία βλαστική κωδικοποίησης παραλλαγή

c.2077C & gt? G

(p.Phe354Leu) είναι ένα γνωστό μη παθολογική ουδέτερη παραλλαγή υπάρχει σε φυσιολογικά άτομα [16]. Αλληλουχίας εντόπισε επίσης ομόζυγο

μετάλλαξη τομέα LKB1

κινάσης στον καρκίνο του τραχήλου κυτταρική σειρά C4I (Εικόνα 1Β, Πίνακας S1).

(Α) Εκπρόσωπος χρωματογραφήματα των πρωτογενών όγκων. κυτταρική σειρά (Β) C4I. Κάτω πάνελ, δείγματα ελέγχου DNA από κάθε ασθενή (για C4I, ανθρώπινα περιφερικά λευκοκύτταρα DNA). Οι αλληλουχίες φυσικού τύπου που φαίνεται παρακάτω. Χρωματογραφήματα αντιπροσωπεύουν τα εμπρός σκέλος εκτός από την περίπτωση # 41, όπου αντίστροφο συμπλήρωμα φαίνεται να απεικονίζουν με μεγαλύτερη σαφήνεια τη διαγραφή. Οι μεταλλάξεις είναι ετερόζυγα εκτός όπου υποδεικνύεται. (C)

LKB1

διαγραφές στην πρωτοβάθμια τραχήλου της μήτρας όγκους από MLPA. Μπαρ = σχετική ένταση του σήματος ανά ανιχνευτή. Δεκαέξι ανιχνευτές (μαύρο) αντιστοιχούν στο

LKB1

τόπο στο χρωμόσωμα 19. αναγνωριστικά Probe φαίνεται παρακάτω. Ανιχνευτές 0.9M5 »και 0.6M5» είναι περίπου 900 και 600 kb 5 ‘του τόπου (τελομερικού), ενώ 10m3 »είναι ~10000 kb 3’ (κεντρομερική)? υπόλοιπο 13 ανιχνευτές αντιστοιχούν σε

LKB1

μη κωδικοποιητική /κωδικοποίηση εξώνια. Λευκές μπάρες αντιστοιχούν σε τυχαία επιλεγμένα ανιχνευτές από άλλα χρωμοσώματα.

Η

Παρά το γεγονός ότι ένα μικρό (26 bp)

LKB1

διαγραφή αντιπροσωπεύει μια πλήρη απώλεια-του-λειτουργία ταυτοποιήθηκε με ανάλυση της αλληλουχίας (Πίνακας S1, Σχήμα 1Α), μεγαλύτερες διαγραφές θα είχαν χαθεί. Για διαλογή συστηματικά για τις διαγραφές, πολλαπλή ενίσχυση καθετήρα απολίνωση-εξαρτώμενη (MLPA) για όλες τις 10

LKB1

εξώνια και τρία συνοδευτικά ανιχνευτές εργαζόταν. Ενώ φυσιολογικά δείγματα ελέγχου ανθρώπινου DNA (n = 3) έδειξε σταθερά ισοδύναμες δυνάμεις σήμα για όλες τις ανιχνευτές, MLPA εντοπίζονται διακριτές

LKB1

διαγραφές σε 10/86 όγκους (Πίνακας S1, Εικόνα 1Γ). Σε πέντε όγκους, διαγραφές φάνηκε να είναι ομόζυγο επειδή σήματα από γειτονικά ανιχνευτές μειώθηκαν κατά & gt? 50% (Σχήμα 1 C, περιπτώσεις 60 και 22)? υπολειμματικό σήμα σε αυτές τις περιπτώσεις ενδέχεται αντικατοπτρίζει μόλυνση του στρώματος. Των όγκων με εμφανή ετερόζυγο διαγραφές, ένας περιείχε επίσης μια σημαντική μετάλλαξη που προσδιορίζονται με αλληλούχηση (υπόθεση 41, που φιλοξενεί μία διαγραφή 26 bp, Πίνακας S1). Αυτά τα ευρήματα είναι συνεπή με τις μελέτες ανθρώπου και ποντικού που δείχνουν ότι, αν και η απώλεια του δεύτερου αλληλόμορφου μπορεί να επιταχύνει την εξέλιξη του όγκου, η μετάλλαξη ενός μόνο

LKB1

αλληλόμορφο είναι από μόνη της ογκογονικό (δηλαδή

LKB1

μπορεί να είναι haploinsufficient ) [9], [17]. Ωστόσο, είναι επίσης πιθανό ότι ορισμένες μεταλλάξεις πήγε απαρατήρητα, ή ότι η μόλυνση των στρωματικών οδήγησε σε μια υποτίμηση της ομοζυγωτία. Συνοπτικά, βιολογικώς σημαντικών

LKB1

μεταλλάξεις που περιλαμβάνουν διαγραφές χαρακτηρίζουν τουλάχιστον 20% (17/86) του διηθητικού καρκίνων του τραχήλου. Μόνο μία περίπτωση στη μελέτη μας (υπόθεση 20, η οποία έτρεφε ένα σωματικά, απέκτησε

LKB1

μετάλλαξη) διαγνώστηκε ως ελάχιστη-απόκλιση αδενοκαρκίνωμα (MDA), ένα σπάνιο, εξαιρετικά καλά διαφοροποιημένο παραλλαγή του αδενοκαρκινώματος του τραχήλου της μήτρας που σχετίζονται με Σύνδρομο Peutz-Jeghers [18]. Έτσι,

LKB1

μεταλλάξεις στους καρκίνους του τραχήλου ήταν να περιορίζεται σε αυτό το σπάνιο ιστολογική υποτύπο αλλά ήταν παρόντα σε όλες τις κύριες ιστολογικούς υποτύπους του τραχήλου της μήτρας καρκίνου αδενοκαρκίνωμα, καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, και καρκίνωμα αδενοχοληδωτό (Σχήμα 2, Πίνακας S1) [ ,,,0],4]

(Α) Ιστολογία του αντιπροσωπευτικές περιπτώσεις με

LKB1

μεταλλάξεις (καρκίνωμα SCC = πλακωδών κυττάρων? αδενοϊό = αδενοκαρκίνωμα? AdenoSq = αδενοχοληδωτό καρκίνωμα? MDA = ελάχιστη απόκλιση αδενοκαρκίνωμα).. μπαρ κλίμακας = 20 μm. (Β) Σχετική κατανομή των τριών βασικών ιστολογικών υποτύπων μεταξύ των

LKB1

μεταλλαγμένου (κόκκινο) έναντι

LKB1

-wild τύπου (μαύρο) περιπτώσεις (σύνολα = 100%) δείχνει ότι η ιστολογική φάσματος είναι σχεδόν πανομοιότυπη σε

LKB1

null εναντίον όγκων άγριου τύπου.

Η

διαγραφές των

LKB1

χαρακτηρίζουν περισσότεροι καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές γραμμές

Πρωτογενής όγκοι είναι κλωνικώς ποικίλα και περιέχουν μεταβλητούς αριθμούς κυττάρων όπως οι ινοβλάστες και τα λεμφοκύτταρα που μπορεί να συγκαλύψει αυτές και άλλες αναλύσεις. Για να ξεπεραστεί αυτός ο περιορισμός και να αποκτήσουν περαιτέρω γνώσεις σχετικά με το ρόλο του

LKB1

στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, μια ομάδα επτά καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές (HeLa, ΗΤ3, SiHa, MS751, CaSki, C33A, και C4I) αναλύθηκε. Εντυπωσιακά, πέντε από αυτές τις επτά κυτταρικές σειρές harbored

LKB1

διαγραφές, όπως έκανε και η HeLa παράγωγο HeLaS3 (Σχήμα 3Α). Μόνο το CaSki (Σχήμα 3Α) και C33A (δεν φαίνεται) κυτταρικές σειρές δεν παρουσίασαν

LKB1

διαγραφές. Η πλειοψηφία (4/7) έτρεφε ομόζυγη διαγραφές, ενώ η μία κυτταρική σειρά με ετερόζυγο διαγραφή (C4I) έτρεφε επίσης μια σημειακή μετάλλαξη (Εικόνα 1Β, Πίνακας S1) τον εξορθολογισμό της απώλειας της ετεροζυγωτίας για αυτήν την μετάλλαξη στο C4I. Η ανάλυση Southern επιβεβαίωσε την απώλεια του

LKB1

αλληλουχίες (Σχήμα 3Β) και όπως αναμένεται, η πρωτεΐνη LKB1 ήταν ανιχνεύσιμη στις κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν ομόζυγη εξαλείψεις (Σχήμα 3C). Αυτή η συχνή ομοζυγωτία του

LKB1

μεταλλάξεις σε κυτταρικές σειρές υπογραμμίζει περαιτέρω την παθογενετικός σημασία του

LKB1

απώλεια στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Αν και ο αριθμός των διαθέσιμων και ως εκ τούτου σειρές που αναλύθηκαν ήταν μικρό, είναι αξιοσημείωτο ότι η πλειοψηφία των αυχενικών καρκινικές κυτταρικές γραμμές που φιλοξενούνται οριστικός bialleleic

LKB1

μεταλλάξεις. Είναι επίσης πιθανό ότι η δημιουργία πρωτογενών καλλιεργειών του τραχήλου της μήτρας όγκου ωθείται προς

LKB1

ελλιπή ως όγκοι

(Α) MLPA.? βλέπε Εικόνα 1 για λεπτομέρειες ανιχνευτή. HeLa, MS751, SiHa και ΗΤ3 (και HeLa υποκλώνος HeLaS3) περιέχουν διακριτικό ομόζυγη διαγραφές. C4I φιλοξενεί ένα μο- νοαλληλική διαγραφή, όπως αποδεικνύεται από συνεχόμενα ανιχνευτές με σήματα μισή ένταση. (Β) ανάλυση Southern του DNA ελέγχου, πάνω από κυτταρικές σειρές, C33 (καμία διαγραφή από MLPA) και HPV16 /E6E7-απαθανάτισε ενδοτραχηλικά κύτταρα από ένα φυσιολογικό ασθενή (Endo = End1 /E6E7? ATCC # CRL-2615). (Γ) ανάλυση Western. πρωτεΐνη LKB1 είναι ανιχνεύσιμη σε γραμμές που φιλοξενούν ομόζυγη διαγραφές και μειώθηκαν κατά -50% το C4I, σύμφωνα με μο- νοαλληλική απώλεια.

Η

Η απουσία της πρωτεΐνης LKB1 σε HeLa και HeLaS3 έχει ήδη σημειωθεί [19]. Η

LKB1

γονιδίου σχετίζεται με έναν εξέχοντα νησί CpG, και η έλλειψη της πρωτεΐνης LKB1 και mRNA σε κύτταρα HeLa είχε προηγουμένως αποδοθεί στην υπερμεθυλίωση προαγωγού [20]. Ωστόσο, βρήκαμε κανένα στοιχείο του

LKB1

υπερμεθυλίωση από μεθυλίωσης-ειδική PCR σε κάθε κυτταρική σειρά ή δείγματα πρωτογενούς όγκου. Αντίθετα, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι HeLa και άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου του τραχήλου της μήτρας δεν εκφράζουν

LKB1

εξαιτίας ομόζυγη διαγραφών, και όχι ως αποτέλεσμα των επιγενετικών σιγαστήρα. Σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που πραγματοποιούνται σε HeLa [19] και άλλες κυτταρικές γραμμές [9], εκτελούνται έκφραση του άγριου-τύπου LKB1 οδήγησε σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου και την αναστολή της ανάπτυξης, καταδεικνύοντας ότι

LKB1

απώλεια σε αυτές τις κυτταρικές σειρές είναι λειτουργικά σημαντική (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα).

για τον καθορισμό σημείων διακοπής διαγραφή, PCR αντιδράσεις παράγουν μικρές αμπλικόνια (100-200 bp) σχεδιάστηκαν ώστε να καλύπτουν τον τόπο (Σχήμα 4Α, Β). Βαθμολόγησης (+/-) ενίσχυση του κάθε προϊόντος που ακολουθείται από πρόσθετες αντιδράσεις PCR για την προοδευτική στενό χρονικά διαστήματα με βάση τα αποτελέσματα της αρχικής σάρωσης μας επέτρεψε να χαρτογραφήσει σημεία διακοπής σε μέσα σε λίγα kb (Σχήμα 4C). Κάθε μία από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές έτρεφε μια διακριτή διαγραφή (~20-110 kb) την αφαίρεση τμημάτων του

LKB1

και το πολύ ένα άλλο συνοδευτικά τόπο (

SBNO

2).

(Α)

LKB1

τόπου (χρωμόσωμα 19p13.3). (Β) 140 περιοχή kb (Ensembl50? 1.050.000 – 1.190.000) που εκτείνονται σε

LKB1

και αμέσως συνοδευτικά τόπους? διαστήματα = 10 kb. (Γ) Κατάργηση όρια ευαισθησίας για κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν ομόζυγη διαγραφές. Σε MS751, διαγράφονται οι αλληλουχίες είναι ασυνεχής όπως φαίνεται, σύμφωνα με μια πιο σύνθετη αναδιάταξη. Βέλη = εκκινητές PCR για HeLa ειδική PCR (400 bp). (D) HeLa ειδική PCR (400 bp) επιβεβαιώνει την παρουσία της διαγραφής σε HeLaS3. (Ε) HeLa ενδογονικοί

LKB1

διαγραφή συνέβη

in vivo

. Αρχειακό μπλοκ πυρήνα για την προετοιμασία του DNA. Οι λωρίδες έχουν ως εξής: (-) = έλεγχος κανέναν έλεγχο εκμαγείο? όγκου = μεταστατικό επινεφριδίων κατάθεση? μη-όγκου = κανονική επινεφριδίων (ίδιο μπλοκ ιστού)? (+) Ελέγχου = HeLa κυτταρική σειρά DNA.

Η

Μοριακή κλωνοποίηση του HeLa

LKB1

Διαγραφή Junction και

In Vivo

Προέλευση της διαγραφής

για την κλωνοποίηση σε όλη τη διασταύρωση HeLa, εκκινητές που πλευρίζουν τις ‘και 3’ σημεία διακοπής 5 χαρτογραφηθεί από τη στρατηγική σάρωσης παραπάνω PCR σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν ένα ειδικό σημείο διακοπής προϊόν. Ένα θραύσμα 2,8 kb συνδετικό κλωνοποιήθηκε και προσδιορίστηκε η αλληλουχία, επιβεβαιώνοντας την παρουσία ενός διαγραφής (24.662 bp, Εικόνα S1, Σχήμα 4C). Και τα δύο σημεία διακοπής βρίσκονται εντός Alu επαναλήψεις (Σχήμα S1), γεγονός που υποδηλώνει ότι μεταξύ Alu ομόλογο ανασυνδυασμό παράγεται τη διαγραφή. Για να δημιουργήσετε μια αποτελεσματική δοκιμασία PCR για αυτή την απαλοιφή, αστάρια αμέσως πλευρίζουν τις επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες Alu σε κάθε σημείο διακοπής σχεδιάστηκαν (400 bp) (Σχήμα S1).

HeLaS3, μια κλωνική παράγωγο HeLa αναφέρθηκε για πρώτη φορά το 1955 [21 ], έτρεφε η ταυτόσημη

LKB1

διαγραφή (Σχήμα 4D), για την ίδρυση το 1955 ως

terminus ante quem

για την προέλευση της διαγραφής. Ωστόσο, παρέμεινε επίσημα πιθανό ότι το

προέκυψε LKB1

διαγραφή

in vitro

μετά την ίδρυση της HeLa από ένα πρωτεύον του τραχήλου της μήτρας αδενοκαρκίνωμα το 1951 [22]. Για την επίλυση του ζητήματος αυτού, HeLa καρκινικά DNA απομονώθηκε από ένα αρχειακό μπλοκ ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη παρασκευάζεται κατά τη διάρκεια της αυτοψίας του ασθενούς στο Νοσοκομείο Johns Hopkins το 1951. Ένα 400 bp HeLa-ειδικό PCR προϊόν ενισχύθηκε από τον όγκο (Σχήμα 4Ε ), όπου ορίζεται ότι η

συνέβη LKB1

διαγραφή

in vivo

.

η εμφάνιση του

LKB1

HeLa διαγραφή ενώ ο ασθενής να ήταν ζωντανός πρότεινε ότι

LKB1

αδρανοποίηση μπορεί να συνέβαλαν στην εμφανώς επιθετική ανάπτυξη του όγκου της

in vivo

και

in vitro

(βλέπε παρακάτω και συζήτηση). Να διερευνήσει τη δυνατότητα που

LKB1

μεταλλάξεις επηρεάζουν την πορεία της νόσου, οι καμπύλες επιβίωσης χωρίς εξέλιξη δημιουργήθηκαν για τους ασθενείς των οποίων οι όγκοι έτρεφε

LKB1

μεταλλάξεις που προσδιορίζονται από αλληλουχίας ή MLPA (ετερόζυγη ή ομόζυγη) και ασθενείς των οποίων η όγκοι ήταν άγριου τύπου για

LKB1

. Εντυπωσιακά, η διάμεση επιβίωση ήταν μόνο 13 μήνες για τους ασθενείς με

LKB1

ελλιπή ως όγκους, αλλά & gt? 100 μήνες για τους ασθενείς με

LKB1

-wild όγκους τύπου (Εικόνα 5) (Ρ = 0,015 , δοκιμασία log-rank? αναλογία κινδύνου = 0,25, 95% CI = 0,083 έως 0,77).

LKB1

ελλιπή ως όγκοι δεν ήταν πιο προχωρημένη κατά το χρόνο της στάσης, π.χ., το 28% των

LKB1

όγκους -wild τύπου αρχικά το στάδιο Ι (περιορίζεται στη μήτρα), έναντι 43 % για

LKB1

ελλιπή ως όγκους, ούτε ανώτερο βαθμό (δηλαδή πιο φτωχά διαφοροποιημένο). Έτσι,

LKB1

μεταλλάξεις σε τραχήλου της μήτρας όγκους προσδίδουν ένα στάδιο προς στάδιο αυξημένο κίνδυνο υποτροπής, γεγονός που υποδηλώνει ότι αναλύσεις του

LKB1

κατάσταση θα είναι κλινική χρησιμότητα στον εντοπισμό των ασθενών που διατρέχουν αυξημένο κίνδυνο για τη νόσο εξέλιξης.

καμπύλες

Kaplan-Meier δείχνουν το ποσοστό των ασθενών με εξέλιξη της νόσου πάροδο του χρόνου. Οι καμπύλες συγκρίνετε ασθενείς των οποίων οι όγκοι ήταν ετερόζυγο ή ομόζυγο για μεταλλάξεις /διαγραφές (

LKB1

) εναντίον ασθενείς χωρίς μεταλλάξεις /διαγραφές (κ.β.). Ασθενείς με & gt? 1 επίσκεψη παρακολούθησης συμπεριλήφθηκαν στην ανάλυση. P αξία ανά δοκιμασία log-rank.

Η

Συζήτηση

Η μελέτη μας είναι η πρώτη που αποδεικνύει ότι επαναλαμβανόμενες γενετικές μεταλλάξεις συμβαίνουν σε καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Μια προηγούμενη μελέτη που εξέτασε το ζήτημα αυτό δεν είχε εντοπίσει

LKB1

μεταλλάξεις σε σποραδικές καρκίνους του τραχήλου, αλλά μόνο ελάχιστα αδενοκαρκινώματα απόκλιση αναλύθηκαν, όπως ο στόχος της μελέτης ήταν να διαπιστωθεί

συχνότητες LKB1

μετάλλαξη στο κακοήθειες γυναικολογικών είναι γνωστό ότι σχετίζονται με PJS. Ωστόσο, αυτή η προηγούμενη μελέτη, πραγματοποιείται πριν από την έλευση του MLPA, εντοπίστηκαν ΑΕ από το

LKB1

19p13.3 περιοχή σε 3/8 περιπτώσεις, γεγονός που υποδηλώνει ότι

LKB1

διαγραφές μπορεί να ήταν παρόντες [ ,,,0],23]. Μια άλλη μελέτη όπου 26 του τραχήλου της μήτρας όγκους αναλύθηκαν με μονή έλικα ανάλυση διαμορφωτική πολυμορφισμού προσδιορίζονται

LKB1

μεταλλάξεις μόνο σε μία περίπτωση [24]. Ωστόσο, η μελέτη αυτή επίσης υποτιμηθεί σε μεγάλο βαθμό τη συχνότητα των

LKB1

μεταλλάξεις στον καρκίνο του πνεύμονα, τώρα είναι γνωστό ότι συμβαίνουν σε & gt? 20% των περιπτώσεων. Η έλευση του MLPA διευκολύνει τώρα την οριστική ταυτοποίηση του

LKB1

διαγραφές, οι οποίες αντιπροσωπεύουν περίπου 50% των μεταλλάξεων σε πνεύμονα και καρκίνο του τραχήλου (αυτό και άλλες μελέτες) [9]. Ένας άλλος παράγοντας που ενδεχομένως να επισκιάζεται προηγούμενη σειρά αναλύσεων είναι η ασυνήθιστα υψηλή περιεκτικότητα σε GC του

LKB1

εξονικό περιοχές. Σύμφωνα με την εμπειρία μας, αυτοματοποιημένο λογισμικό βάσης κλήση έβλεπε ένα υψηλό ποσοστό μεταλλάξεων, που απαιτούν άμεση επιθεώρηση του χρωματογραφήματα.

Η ανακάλυψη ενός ομόζυγο

LKB1

διαγραφή στο HeLa είναι αξιοσημείωτο, λόγω της ιστορικής σημασίας της Αυτή η κυτταρική γραμμή με τη βιοϊατρική έρευνα. HeLa προήλθε το 1951 από μια τραχήλου της μήτρας αδενοκαρκίνωμα. Δεδομένου ότι η πρώτη απαθανάτισε ανθρώπινη κυτταρική γραμμή απομονωθεί και διαιωνίζεται με επιτυχία

in vitro

, HeLa επιτάχυνε σημαντικά την πρόοδο της βιοϊατρικής έρευνας στο δεύτερο μισό του 20

ου αιώνα [25]. κύτταρα HeLa ήταν ασυνήθιστο στην καλλιέργεια τόσο γρήγορα σε καλλιέργεια, αλλά ο πρωτογενής όγκος ήταν επίσης επιθετική. Η πρωτογενής όγκος περιορίστηκε στον τράχηλο κατά τη στιγμή της διάγνωσης, αλλά μετάσταση νωρίς και ευρέως παρά την επιθετική θεραπεία συμπεριλαμβανομένης της επεξεργασίας ακτινοβολίας, που οδηγούν στο θάνατο του ασθενούς μόλις έξι μήνες μετά την αρχική διάγνωση [26], [27], [28] . Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ομόζυγη διαγραφή έχουμε τεκμηριώνεται μέσα σε

LKB1

συνέβαλαν σε αυτή την επιθετική φαινότυπο ανάπτυξη, τον εξορθολογισμό μερικά από τα ασυνήθιστα χαρακτηριστικά του πρωτοπαθούς όγκου HeLa και κυτταρική σειρά. Συνεπής με αυτή την ιδέα, επιβάλλεται η έκφραση του

LKB1

cDNA σε HeLa και άλλα HeLa ανεπάρκεια κυτταρικές σειρές προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης (αδημοσίευτα στοιχεία, βλέπε επίσης [9], [19]).

Αυτή η είναι επίσης η πρώτη έκθεση που

LKB1

μεταλλάξεις παρέχουν μια χειρότερη πρόγνωση για ένα συγκεκριμένο ανθρώπινο καρκίνο. Ωστόσο, αυτό παρατηρήσεις είναι σύμφωνη με γενετικά τροποποιημένα μοντέλα ποντικών του

LKB1

ανεπάρκεια που έχουν επανειλημμένα διαπιστώσει ότι LKB1 απώλεια προωθεί επεμβατικές /μεταστατικής ανάπτυξης. Σε

K-ras

γνώμονα μοντέλα ποντικών από καρκίνο του πνεύμονα,

LKB1

αδρανοποίηση παρέχεται η ισχυρότερη συνεργασία όσον αφορά την λανθάνουσα κατάσταση του όγκου και της συχνότητας των μεταστάσεων (σε σύγκριση με το κλασικό καταστολείς των όγκων, όπως

p53

και

ΙΝΚ4 & /ΤΑΠ

). Είναι επίσης αξιοσημείωτο ότι

LKB1

απώλεια στον πνεύμονα σχετίζεται με ένα ευρύ φάσμα ιστολογική (πλακωδών κυττάρων καρκινώματα σε αδενοκαρκινώματα), υπενθυμίζοντας ότι

LKB1

αδρανοποίηση χαρακτηρίζει τραχήλου της μήτρας καρκινώματα διαφόρων ιστολογικών υποτύπων [9 ]. Παρομοίως, τα ποντίκια με στοχευμένες αδρανοποίηση του

LKB1

στο ενδομήτριο επιθήλιο αναπτύξει ιδιαίτερα επεμβατική (ακόμα παραδόξως εξαιρετικά καλά διαφοροποιημένο) ενδομητρίου αδενοκαρκινώματα [11]. Στο σύνολό τους, αυτά και άλλα αποτελέσματα [12], [29] υποστηρίζουν ότι LKB1 καταστέλλει την εισβολή και τη μετάσταση και δείχνουν ότι δοκιμασίες που βασίζονται στις LKB1 μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη για την πρόγνωση σε ποικιλία καρκίνων. Θα είναι ενδιαφέρον να προσδιοριστεί εάν

LKB1

μεταλλάξεις είναι επίσης χρήσιμα προγνωστικά σε άλλους καρκίνους [9].

Το γεγονός ότι το 99% των καρκίνων του τραχήλου περιέχουν HPV DNA [2], όπως είναι η ισχύει για τις περισσότερες από τις καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές στις οποίες αποδεικνύεται ομόζυγη

LKB1

διαγραφές (π.χ. HeLa φιλοξενεί ολοκληρωμένο HPV-18 σειρές) [30] δείχνουν ότι

LKB1

και HPV συνεργάζονται με κάποιο τρόπο . HPV λοίμωξη προωθεί το σχηματισμό του

in situ

βλάβες, μας οδηγεί να προτείνει ότι οι πρόσθετες μεταλλάξεις σε γονίδια συμπεριλαμβανομένων των

LKB1

απαιτούνται για τη μετατροπή

in situ

δυσπλασίες σε διηθητικά καρκινώματα, μια ιδέα συνεπής με τις ποικίλες ζωικά μοντέλα που συζητήθηκαν παραπάνω. Περαιτέρω μελέτες δηλαδή με γενετικά παραγόμενα ζωικά μοντέλα θα πρέπει να κατανοήσουν τη βιολογική βάση της αλληλεπίδρασης μεταξύ του HPV και LKB1. Η βιολογική και βιοχημική βάση του LKB1 μεσολάβηση καρκινογένεση παραμένει να διευκρινιστεί πλήρως. Η απορρύθμιση της οδού ΑΜΡΚ-mTOR πιθανόν συμβάλλει στο ρόλο LKB1 ως καταστολέας όγκου, αλλά πιθανώς δεν λαμβάνει υπόψη εξ ολοκλήρου για το ρόλο της στη διαμεσολάβηση εισβολή [31]. Παρ ‘όλα αυτά, απορρύθμιση του mTOR στην LKB1 ανεπάρκεια όγκοι μπορεί να παρουσιάσει ευκαιρίες για στοχευμένη θεραπεία (π.χ. μέσω της χρήσης μετφορμίνης ή ραπαμυκίνης ανάλογα) σε γυναίκες των οποίων οι όγκοι του τραχήλου της μήτρας έχουν επιβεβαιώσει

LKB1

μεταλλάξεις /διαγραφές, μια ιδέα που αξίζει περαιτέρω έρευνα στο μέλλον.

Η βιολογική βάση της προόδου του HPV-επαγόμενης προκαρκίνοι έχει απροσδιόριστο. Η μελέτη αυτή παρουσιάζει την πρώτη οριστική απόδειξη ότι επαναλαμβανόμενες μεταλλάξεις σε διακριτά γονίδια υποδοχής συμβαίνουν σε διηθητικό καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Αν και άλλοι παράγοντες που είναι πιθανόν επηρεάζουν την εξέλιξη, η μελέτη αυτή καταδεικνύει ότι η διαδικασία ενδέχεται να είναι στοχαστική-δηλαδή η απόκτηση των διακριτών γενετικών μεταλλάξεων δίσκους εξέλιξη της αυχενικής δυσπλασιών σε επεμβατικές θανατηφόρα καρκινώματα και ότι αυτές οι μεταλλάξεις έχουν τη δυνατότητα να χρησιμεύσουν ως χρήσιμα prognosticators.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review των νοσοκομείων UT Southwestern και Johns Hopkins.

Τα δείγματα ασθενών και κυτταρικές γραμμές

Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε μια υποομάδα ασθενών που έχουν διαγνωστεί με πρωτοπαθή καρκίνο του τραχήλου της μήτρας στο UT Southwestern Πανεπιστημιακά Νοσοκομεία μεταξύ 2000-2007 και οι οποίοι παρείχαν ενημερωμένη συγκατάθεση. Ιστοπαθολογικές διαγνώσεις έγιναν σύμφωνα με το πρότυπο κριτήρια [4]. Επαρκείς ποσότητες του ιστού από τον πρωτογενή όγκο έπρεπε να είναι διαθέσιμα για να επιτραπεί η απομόνωση του DNA για αλληλούχιση και MLPA? Αλλιώς δεν υπήρχαν κριτήρια αποκλεισμού. Για τους περισσότερους ασθενείς, ελέγχουν DNA παρασκευάστηκε από αίμα? για ένα μικρό αριθμό ασθενών για τους οποίους το αίμα δεν ήταν διαθέσιμο, DNA παρασκευάστηκε από ιστούς ελέγχου ενσωματωμένες σε παραφίνη. το στάδιο του όγκου καθορίστηκε ανά κριτήρια ΦΥΓΩ. Τα στοιχεία για την ανάλυση της εξέλιξης της νόσου ανά κριτήρια RECIST ελήφθησαν από τις επισκέψεις παρακολούθησης. Έχουμε συνιστάται ότι οι ασθενείς έχουν επισκέψεις παρακολούθησης κάθε 3 μήνες για 2 χρόνια και στη συνέχεια κάθε 6 μήνες για 3 χρόνια, και στη συνέχεια ετησίως. Για επιβίωση χωρίς εξέλιξη, την ώρα από την ολοκλήρωση της πρωτογενούς θεραπείας για υποτροπή ή θάνατος καταγράφηκε. Τα δεδομένα για τους ασθενείς χωρίς υποτροπή του όγκου περικόπηκαν κατά το χρόνο της τελευταίας επίσκεψης παρακολούθησης. Για τη μελέτη του όγκου HeLa, ένα μπλοκ παραφίνης λήφθηκε από τα αρχεία του Johns Hopkins Hospital. Οι κυτταρικές γραμμές αγοράστηκαν από την ATCC.

DNA Sequencing

DNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας στήλες Qiagen γονιδιωματικό DNA. Ένα δύο σταδίων «φωλιά ώθηση /» στρατηγική PCR χρησιμοποιήθηκε όπου η αντίδραση ώθηση που δημιουργείται ένα μεγαλύτερο θραύσμα που χρησιμοποιείται ως πρότυπο για την αντίδραση φωλιά. Τα προϊόντα φωλιά ήταν αμφίδρομα αλληλουχία σε ΑΒΙ 3730 XL sequencers με ΑΒΙ Big Dye Terminator 3.1 χημεία. Βάση κλήση έγινε με το σύστημα Agent (Πάρασελ). χαράξεις αλληλουχίας επιθεωρείται οπτικά για να επιβεβαιώσει την ακριβή ανίχνευση παραλλαγή από το λογισμικό βάσης-κλήση. αλληλουχίες των εκκινητών PCR /συνθήκες είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. Κωδικοποίηση παραλλαγές επιβεβαιώθηκαν σε επανάληψη αντιδράσεις PCR να αποκλείσει αντικείμενα PCR. Genbank NM_000455 χρησιμοποιήθηκε ως cDNA αναφοράς για τις θέσεις νουκλεοτιδίων.

Multiplex Ligation Εξαρτημένη Probe Amplification (MLPA) και Southern /Ανάλυση Western

MLPA διεξήχθη όπως περιγράφεται [9]. Για την ανάλυση Southern, 10 μg γονιδιωματικού DNA ήταν

XbaI

που είχε υποστεί πριν από την γέλη ηλεκτροφόρησης, μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη και υβριδοποιήθηκε με ραδιοσημασμένο-ανιχνευτές (1-2 kb) που δημιουργείται με PCR και επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση των τελικών. Η μεμβράνη υβριδοποιήθηκε για την ανίχνευση Α, υποβάλλεται σε αυτοραδιογραφία, απογυμνώθηκε σε βραστό 0.1% SDS, και επαναυβριδοποιήθηκαν για την ανίχνευση B. Για την ανάλυση Western, πρωτεϊνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από προσκολλημένα κύτταρα με ομογενοποίηση σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης αναστολείς πρωτεάσης + σε πάγο, υποβλήθηκε σε SDS -PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με ένα αντίσωμα LKB1 (# 3047, Cell Technology σηματοδότηση) σύμφωνα με τις υποδείξεις του κατασκευαστή.

Tissue χρώσης και ανοσοϊστοχημεία

Παραφίνη μπλοκ 5 μm τομές αποπαραφινώθηκαν /ενυδατωμένο σε μια σειρά αιθανόλης . Τα πλακίδια χρωματίστηκαν με Η &? Ε και mucicarmine ανά τυποποιημένα πρωτόκολλα. Για ανοσοϊστοχημεία, τα πλακίδια υποβλήθηκαν σε αντιγόνο ανάκτηση σε βρασμό σε 10 mM κιτρικού νατρίου? αντίσωμα p63 (# MS1081, LabVision) χρησιμοποιήθηκε σε 1:400 με το σύστημα ανίχνευσης Immpress (Vector).

PCR Σάρωση Ορίστε διαγραφές και HeLa-ειδική PCR

εκκινητών PCR (που παράγουν 100 -200 αμπλικόνια bp) που καλύπτουν το

LKB1

περιοχή σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας Primer3. Ζεύγη εκκινητών παράγουν προϊόντα σωστού μεγέθους όταν φυσιολογικό ανθρώπινο DNA χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα, χρησιμοποιήθηκαν για τη χαρτογράφηση διαγραφών με τη σημείωση παρουσία /απουσία ενίσχυσης με κυτταρική γραμμή DNAs ως εκμαγείο. Επιπρόσθετες αντιδράσεις για να δώσει τα προϊόντα που αντιστοιχούν σε προοδευτικά μικρότερες διαστήματα σχεδιάστηκαν όπως απαιτείται. Primer ακολουθίες και οι συνθήκες της PCR είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος. Αρχειακή DNA μπλοκ ιστός παρασκευάστηκε όπως περιγράφεται [32]. Primer αλληλουχίες για HeLa-ειδική PCR (400 bp) Για (5′-GGTTGCGATCAAGGCCCCGA-3 ‘) και Rev (5′-GCCTGTGGATGCCACACATG-3’). Οι συνθήκες PCR ήταν 95C × 10 ‘? 94C × 30 «, 58C χ 30», 72 ° C χ 30 «(38 κύκλοι)? 72C × 7 ».

Στατιστική Ανάλυση

Για τη σύγκριση των μεταλλαγμένων συχνοτήτων, του Fisher (two-tailed) αταίριαστα ακριβή δοκιμή χρησιμοποιήθηκε. Οι καμπύλες επιβίωσης παρήχθησαν στο GraphPad Prism5, με σύγκριση των καμπυλών γίνεται με την δοκιμασία Log-rank (Mantel-Cox). Η αναλογία κινδύνου και διάστημα εμπιστοσύνης του ήταν υπολογίζονται βάσει της μεθόδου Mantel-Haenszel. Οι τιμές Ρ μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκαν δείχνουν στατιστική σημαντικότητα.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Κλωνοποίηση και χαρακτηρισμός του

LKB1

ενδογονικοί σημεία διακοπής διαγραφή σε HeLa /HeLaS3. Ένα θραύσμα 2,8 kb που εκτείνεται το σημείο διακοπής διαγραφή κλωνοποιήθηκε από HeLa DNA με PCR, όπως περιγράφεται στο κείμενο? 974 bp αυτής της αλληλουχίας δείχνονται. Ακολουθία με έντονα κόκκινα γράμματα αντιστοιχεί στην επανάληψη Alu στην οποία συνέβη το υποθετικό γεγονός ομόλογου ανασυνδυασμού με αποτέλεσμα τη διαγραφή HeLa. πολυμορφισμοί νουκλεοτιδίων στις δύο φυσικές αλληλουχίες ΑΙυ (δεν φαίνεται) ήταν σύμφωνα με ένα συμβάν ανασυνδυασμού που λαμβάνουν χώρα στην εγκιβωτίζονται αλληλουχία 5 bp (δηλαδή, οι πλευρικές βάσεις G ήταν πολυμορφικές και κατατοπιστική). Ακολουθία σε μπλε αντιστοιχεί σε μία μοναδική αλληλουχία στο ανθρώπινο γονιδίωμα (Ensembl 50 19: 1145482 έως 1145865). Αυτή η ακολουθία είναι ~ 11 kb από το άκρο 5 ‘του

LKB1

γονίδιο (έναρξης της μεταγραφής). Ακολουθία στο πράσινο (Ensembl 50 19: 1.170.845 με 1.171.115) βρίσκεται μέσα στο

LKB1

ιντρόνιο 3-4. Τα βέλη δείχνουν τη θέση των εκκινητών σχεδιασμένων για HeLa-ειδική PCR (400 bp αμπλικόνιο). Η γονιδιωματική θέση αυτών των εναρκτήρων στο γονιδιωματικό χάρτη παρουσιάζεται στο Σχήμα 4C

doi:. 10.1371 /journal.pone.0005137.s001

(0,01 MB PDF)

Πίνακα S1.

Πλήρης κατάλογος των μεταλλάξεων LKB1 ανιχνεύεται με αλληλούχιση ή MLPA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0005137.s002

(0.01 MB PDF)

Ευχαριστίες

οι χρεωμένες σε Grover Hutchins (Johns Hopkins University School of Medicine) και Juanita Valenciana (UT Southwestern) για βοήθεια σχετικά με τις δημόσιες συμβάσεις του δείγματος και τεχνικές συμβουλές. Μπορούμε επίσης να ευχαριστήσω Jennifer Sayne και το UT Southwestern ιστών Διαχείρισης Πόρων του Simmons Περιεκτική Κέντρο Καρκίνου για βοήθεια σχετικά με τις δημόσιες συμβάσεις του δείγματος και την κλινική διαχείριση των πληροφοριών.