Αφηρημένο

Ιστορικό

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι ένα από τα πιο συχνά διαγιγνώσκονται καρκίνοι. Οι κυκλοφορούν microRNAs (miRNAs) έχουν προταθεί ως δυνητικά υποσχόμενη δείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση της CRC. Έχουμε ως στόχο να προσδιορίσει και να αξιολογήσει ένα πάνελ των miRNAs που μπορεί να είναι κατάλληλο για CRC έγκαιρη ανίχνευση.

Μέθοδοι

miRNAs έχουν προφίλ από TaqMan microRNA Array και ελέγχονται για διαφορική έκφραση σε 5 ομάδες των δειγμάτων πλάσματος του CRC ασθενείς (n = 50) και 5 πισίνες του νεοπλάσματος χωρίς ελέγχους (Ν = 50). Πρόσθετες miRNAs επιλέχθηκαν από μια ανασκόπηση της βιβλιογραφίας. Προσδιορίζονται οι υποψήφιοι αξιολογήθηκαν σε ανεξάρτητα δείγματα επικύρωσης σε σχέση με τις διακρίσεις των ασθενών CRC (Ν = 80) ή ασθενείς με προχωρημένο αδένωμα (Ν = 50) και νεόπλασμα χωρίς ελέγχους (Ν = 194). Διαγνωστική απόδοση της ομάδας των miRNAs αξιολογήθηκε με πολλαπλή λογιστική παλινδρόμηση, χρησιμοποιώντας bootstrap ανάλυση για τη διόρθωση της υπερβολικής αισιοδοξίας.

Αποτελέσματα

Πέντε miRNAs εντοπίστηκαν να εκφράζονται διαφορικά από TaqMan microRNA Array (miR -29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p), και επτά miRNAs αναφερθεί ότι εκφράζεται διαφορικά στην βιβλιογραφία (mIR-18α, -20a, -21, -92a, -143, -145 , -181b) επιλέχθηκαν για επικύρωση. Εννέα από τους δώδεκα miRNAs (miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145) βρέθηκαν να εκφράζονται διαφορικά σε ασθενείς με CRC και τους ελέγχους στα δείγματα επικύρωσης. Η αισιοδοξία διορθωμένη περιοχή κάτω από την καμπύλη ήταν 0.745 (95% διάστημα εμπιστοσύνης: 0,708 – 0,846). Κανένα από τα επιλεγμένα miRNAs έδειξε σημαντική διαφορική έκφραση μεταξύ των ασθενών με προχωρημένο αδένωμα και νεόπλασμα χωρίς ελέγχους.

Συμπέρασμα

Η εντοπίστηκαν πίνακα των miRNAs θα μπορούσε να είναι πιθανή χρήση στην ανάπτυξη ενός multi-δείκτη δοκιμή βασίζεται αίματος για την έγκαιρη ανίχνευση της CRC. Επιπτώσεις: Η μελέτη υπογραμμίζει το υψηλό δυναμικό των miRNAs πλάσματος για τη βελτίωση της τις τρέχουσες προσφορές της μη επεμβατικής εξέτασης CRC

Παράθεση:. Luo Χ, Χρηματιστήριο C, Burwinkel Β, Brenner Η (2013) Προσδιορισμός και Αξιολόγηση Τα microRNAs πλάσματος για την έγκαιρη διάγνωση του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 8 (5): e62880. doi: 10.1371 /journal.pone.0062880

Επιμέλεια: Antonio Moschetta, Πανεπιστήμιο του Μπάρι & amp? Consorzio Mario Negri Sud, Ιταλία

Ελήφθη: 22 Δεκεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 26 Μαρτίου 2013? Δημοσιεύθηκε: May 14, 2013

Copyright: © 2013 Luo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

με πάνω από 1,2 εκατομμύρια νέα κρούσματα και 608.700 θανάτους ανά χρόνια, ορθοκολικό καρκίνο (CRC) είναι η τρίτη πιο συχνά διαγιγνώσκεται καρκίνος στους άνδρες και η δεύτερη στις γυναίκες, και η τέταρτη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο παγκοσμίως [1]. Λόγω συνήθως πολύ αργή ανάπτυξη της εδώ και πολλά χρόνια, οι προοπτικές για την έγκαιρη διάγνωση είναι πολύ καλύτερη από ό, τι για πολλές άλλες μορφές καρκίνου. Έχει υπολογιστεί ότι πάνω από το 95% των περιπτώσεων του CRC θα ωφεληθεί από τη θεραπευτική χειρουργική επέμβαση, εάν η διάγνωση έγινε σε πρώιμο στάδιο ή προκαρκινικές πολύποδα [2], [3]. Ένας αριθμός διαδικασιών έγκαιρης ανίχνευσης έχουν αναπτυχθεί και εφαρμόζονται όλο και περισσότερο, συμπεριλαμβανομένων των εξετάσεων ενδοσκοπική, stool- και με βάση το αίμα δοκιμές. Οι εξετάσεις αίματος που βασίζονται φαίνεται να είναι ιδιαίτερα ελκυστική, δεδομένου ότι είναι ελάχιστα επεμβατική και μπορεί να λάβει τα υψηλά επίπεδα πρόσφυση όταν εφαρμόζεται ως δοκιμές πρωτοβάθμιας προσυμπτωματικού ελέγχου του πληθυσμού διαλογής με βάση. Ένας μεγάλος αριθμός των δεικτών του αίματος έχουν προταθεί και αξιολογηθεί, συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών, κυτταρολογικές, mRNA, και οι δείκτες του DNA [4], [5], αλλά διαγνωστική απόδοση έχει ως επί το πλείστον ήταν ανεπαρκής για την εφαρμογή ως πρωταρχικό εργαλείο προσυμπτωματικού ελέγχου βάσει πληθυσμού. Επιπλέον, οι περισσότερες μελέτες που επικαλείται μικρά δείγματα ευκολίας από κλινικό περιβάλλον, και μάλλον ελπιδοφόρα αποτελέσματα από μικρές μελέτες έχουν συχνά δεν έχουν επαναληφθεί στις επόμενες μεγαλύτερες επικυρώσεις κλίμακας.

Τα microRNAs (miRNA) είναι 18~22 νουκλεοτιδίου μη-κωδικοποίησης RNAs ότι μετα-μεταγραφικά ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση και τον έλεγχο των διαφόρων κυτταρικών μηχανισμών [6]. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι miRNAs είναι ευρέως απορρυθμισμένη σε καρκίνο και μπορεί να έχει δυνητική εφαρμογή για τη διάγνωση του καρκίνου, την πρόγνωση και τη θεραπεία [7]. Επιπλέον, πρόσφατη ανάπτυξη των μικροσυστοιχιών miRNA έχει κάνει μεγάλες μελέτες προφίλ σε ασθενείς με καρκίνο είναι δυνατόν.

Η σταθερότητα του ελεύθερου κυττάρων miRNAs στα σωματικά υγρά επιτρέπει κυκλοφορεί miRNAs να είναι πιθανοί βιοδείκτες για μη επεμβατική διάγνωση του καρκίνου και άλλες ασθένειες [8 ]. Αρκετές πρόσφατες μελέτες βρέθηκε κάποια κυκλοφορούσα miRNAs, όπως miR-29a, miR-92a και miR-221, για να εκφράζονται διαφορικά σε ασθενείς CRC και ως εκ τούτου να έχουν πιθανή χρήση ως μη-επεμβατική βιοδείκτες για CRC έλεγχο [9] – [11 ].

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να εντοπίσει και να αξιολογήσει ένα πάνελ των miRNAs πλάσμα που θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση της CRC.

Υλικά και Μέθοδοι

μελέτη και μελέτη πληθυσμού

Θήκες με σποραδικές CRC προσελήφθησαν πριν από την έναρξη της θεραπείας στην Πανεπιστημιακή Κλινική της Χαϊδελβέργης, στο πλαίσιο της Dachs + μελέτη, η οποία είναι ένα δορυφορικό μελέτη για Dachs, μια συνεχιζόμενη μελέτη ασθενών-μαρτύρων διεξάγονται στην περιοχή του Ρήνου-Neckar της Γερμανίας [12], [13].

οι ασθενείς με προχωρημένο ορθοκολικό αδενώματα και τους ελέγχους χωρίς παχέος νεοπλάσματα επιλέχθηκαν τυχαία από τους συμμετέχοντες του προσυμπτωματικού ελέγχου κολονοσκόπηση προσλαμβάνονται στη μελέτη BLITZ, μια συνεχής μελέτη σχεδιάστηκε για να αξιολογήσει τα νέα ελπιδοφόρα δείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση του CRC και περιγράφηκε προηγουμένως λεπτομερώς αλλού [14] – [16]. Εν συντομία, οι ασθενείς είχαν προσληφθεί, και ελήφθησαν δείγματα αίματος στα γραφεία Γαστρεντερολόγοι «σε προπαρασκευαστική επίσκεψη, συνήθως περίπου μία εβδομάδα πριν από την εξέταση της κολονοσκόπησης.

Τόσο η Dachs + και η μελέτη BLITZ εγκρίθηκαν από τις επιτροπές δεοντολογίας των ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου της Χαϊδελβέργης και των ιατρικών τμημάτων της Βάδης-Βυρτεμβέργης και της Ρηνανίας-Παλατινάτου. . Γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε συμμετέχοντα

Η έρευνά μας εμπλέκονται δύο κύριες φάσεις, μια φάση αναγνώρισης δείκτη και μια φάση επικύρωσης δείκτη:

Στη φάση της αναγνώρισης του δείκτη, υποσχόμενος miRNAs σαρώθηκαν με TaqMan microRNA Array σε ομαδοποιημένα δείγματα πλάσματος από 50 ασθενείς και 50 CRC νεόπλασμα χωρίς μάρτυρες, χρησιμοποιώντας πέντε δεξαμενές δειγμάτων πλάσματος από δέκα ασθενείς CRC η κάθε μία, και πέντε δεξαμενές δειγμάτων πλάσματος από δέκα νεόπλασμα χωρίς ελέγχους η κάθε μία. Επιπλέον, επτά miRNAs που περιγράφεται στο να εκφράζονται διαφορικά σε CRC περιπτώσεις και τους ελέγχους σε προηγούμενες εκδόσεις είχαν εντοπιστεί από μια συστηματική ανασκόπηση της βιβλιογραφίας (miR-18a, -20a, -21, -92a, -143, -145, -181b) [17 ].

στη φάση της επικύρωσης δείκτη, η έκφραση των miRNAs που προσδιορίζονται αξιολογήθηκε σε ανεξάρτητα δείγματα (i) 80 περιπτώσεις CRC και 144 ελέγχους χωρίς παχέος νεοπλασμάτων και (ii) 50 ασθενείς με προχωρημένο αδενώματα και 50 έλεγχοι χωρίς παχέος νεοπλάσματα.

Εργαστήριο Διαδικασίες

(i) Η προετοιμασία των δειγμάτων και RNA εκχύλισης.

Τα δείγματα αίματος συλλέχθηκαν σε σωλήνες EDTA. Τα δείγματα αίματος από ασθενείς με καρκίνο ελήφθησαν πριν την εγχείρηση ή οποιαδήποτε άλλη θεραπεία και λαμβάνονται δείγματα αίματος από τους συμμετέχοντες οι οποίοι υποβλήθηκαν σε διαλογή κολονοσκόπηση ελήφθησαν πριν από την κολονοσκόπηση. Τα δείγματα αίματος φυγοκεντρήθηκαν στα 2123g για 10 λεπτά στους 4 ° C και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε νέους σωλήνες. Τα δείγματα πλάσματος αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Ολικό RNA που περιέχουν μικρές RNA εκχυλίστηκε από 200 μΙ (δείγματα που χρησιμοποιούνται στη φάση αναγνώρισης) ή 115 μΐ (δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν στη φάση επικύρωσης) πλάσματος χρησιμοποιώντας ένα συνδυασμό αντιδραστηρίου ΤπζοΙ LS (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) και miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Γερμανία) καθώς και 5 fmol /μl cel-miR-39 ως εξωτερικός έλεγχος παρασκεύασμα όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Δείγματα εκλούσθηκαν σε ένα τελικό όγκο 30 μΙ.

(ii) microRNA προφίλ από δείγματα πλάσματος.

χαρακτηρισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Array (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) η οποία επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό της ανθρώπινης 667 microRNAs. (Πίνακας S1) Megaplex αντίστροφη αντίδραση μεταγραφής και αντίδραση προ-ενίσχυσης διεξήχθησαν με G-Storm GS2 Thermal Cycler (G-Storm, UK). Σε πραγματικό χρόνο αλυσιδωτής αντίδρασης ποσοτικής πολυμεράσης (qRT-PCR) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση 7900HT γρήγορο σύστημα PCR Πραγματικού χρόνου (Applied Biosystems). Το κατώφλι κύκλου (Ct) ορίζεται ως ο αριθμός των κύκλων που απαιτούνται για την φθορίζον σήμα να διασχίσει το κατώφλι σε qRT-PCR. τιμές των πρώτων Ct υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση του λογισμικού SDS 2.2 εφαρμογή αυτόματες ρυθμίσεις βασική γραμμή και το όριο των 0,1 ορίστηκε. Μόνο miRNAs του οποίου η τιμή Ct ήταν ίση ή μικρότερη από 33 σε τουλάχιστον είτε την υπόθεση ή την ομάδα ελέγχου ελήφθησαν υπόψη για την περαιτέρω ανάλυση των δεδομένων. ομαλοποίηση των δεδομένων έγινε όπως περιγράφεται από Kroh et al. [19].

(iii) σε πραγματικό χρόνο ποσοτική επαλήθευση PCR.

Επιλεγμένα miRNAs μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Αναλύσεις (Applied Biosystems) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εις τριπλούν qRT-PCR κάθε δείγματος πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση LightCycler 480 πραγματικού χρόνου σύστημα PCR (Roche Applied Science, Germany). ΔCt υπολογίστηκε αφαιρώντας τις τιμές Ct των εσωτερικών ελέγχων από τις τιμές Ct των miRNAs ενδιαφέροντος, και μέσες τιμές ΔCt συγκρίθηκαν μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Multiplex ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση προκαθορισμένων δεξαμενές RT-εκκινητές (Πίνακας S2). Η αποτελεσματικότητα της δοκιμασίας κάθε miRNA που προσδιορίστηκε με την κατασκευή μίας πρότυπης καμπύλης χρησιμοποιώντας μια σειρά από ολικό RNA αραιώσεις. Όλες οι αναλύσεις έδειξαν καλή γραμμικότητα (R

2 & gt? 0,96) μεταξύ των τιμών Ct και το ημερολόγιο της ποσότητας εκκίνησης του ολικού RNA από κάθε αραίωση (τα δεδομένα δεν φαίνονται)

Στατιστικές Αναλύσεις

τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs συγκρίθηκαν μεταξύ ασθενών CRC και νεόπλασμα χωρίς ελέγχους, καθώς και μεταξύ ασθενείς με προχωρημένο αδένωμα και νεόπλασμα χωρίς ελέγχους χρησιμοποιώντας το Wilcoxon-Mann-Whitney-Test (εφεξής: δοκιμή Wilcoxon). Η σύγκριση των επιπέδων έκφρασης miRNA μεταξύ των ασθενών CRC και νεόπλασμα χωρίς ελέγχους στη φάση αναγνώρισης του δείκτη διεξήχθη χρησιμοποιώντας την ακριβή εκδοχή της δοκιμασίας Wilcoxon. Όλες οι δοκιμασίες ήταν δύο όψεων και Ρ τιμές 0,05 ή λιγότερο θεωρήθηκαν ότι είναι στατιστικά σημαντική.

Πολλαπλές λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει την κοινή χρήση του εντοπίστηκαν πίνακα των miRNAs στην πρόβλεψη CRC στη φάση της επικύρωσης δείκτη . λειτουργούν χαρακτηριστικό (ROC) καμπύλη δέκτη κατασκευάστηκαν και περιοχές υπό τις καμπύλες ROC (AUCs) υπολογίστηκαν τόσο από αδιόρθωτη (φαινομενική) και ρυθμίζεται ( «αισιοδοξία διορθωμένη») εκτιμά για την αξιολόγηση των διακρίσεων του μοντέλου πρόβλεψης μεταξύ των ασθενών με και χωρίς CRC. The.632 + bootstrap μέθοδο (με 1000 επαναλήψεις) χρησιμοποιήθηκε για την προσαρμογή για υπερπροσαρμογής της εμφανούς σφάλματος ταξινόμησης και υπερεκτίμηση των AUC από τις μη προσαρμοσμένες εκτιμήσεις [20], [21]. διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (CI) για τις ρυθμίζεται και αδιόρθωτη εκτιμήσεις ελήφθησαν από τους απλούς αναλύσεις εκκίνησης (με 1000 επαναλήψεις).

Η συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης των miRNAs στο πλάσμα κατά μήκος των 324 συμμετεχόντων της φάσης επικύρωσης αξιολογήθηκε από Spearman συντελεστές συσχέτισης.

SAS έκδοση 9.2 (SAS Institute Inc., Cary, Βόρεια Καρολίνα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής) χρησιμοποιήθηκε για τη διεξαγωγή Wilcoxon τεστ και R έκδοση 2.15.0 (R Ίδρυμα για στατιστικούς υπολογισμούς, Βιέννη, Αυστρία) χρησιμοποιήθηκε να διεξάγει όλες τις άλλες αναλύσεις. Τα R-πακέτα «Daim» και «boot» χρησιμοποιήθηκαν για να εκτελέσει εκκίνησης αναλύσεις [22], [23].

Αποτελέσματα

Πληθυσμός μελέτης

Ένα σύνολο 424 άτομα συμπεριλήφθηκαν (130 ασθενείς CRC, 50 ασθενείς με προχωρημένο αδένωμα και 244 νεόπλασμα χωρίς ελέγχους) στη μελέτη. Τα δημογραφικά χαρακτηριστικά του πληθυσμού και την κατανομή των σταδίων του όγκου της μελέτης συνοψίζονται για τη φάση της αναγνώρισης του δείκτη και τη φάση της επικύρωσης δείκτη στον πίνακα 1.

Η

Αναγνώριση των διαφορικά εκφρασμένων miRNAs στο CRC ασθενείς και νεοπλασμάτων χωρίς Έλεγχοι

μικροσυστοιχιών αναλύσεις, πέντε miRNAs βρέθηκαν να είναι στατιστικά σημαντικά υπερ-εκφράζεται στο πλάσμα ασθενών CRC σε σύγκριση με νεόπλασμα χωρίς ελέγχους (miR-29a: ρ = 0.016, miR-106b: p = 0,008, miR -133a: p = 0,032, miR-342-3p: p = 0.008, miR-532-3p: p = 0,016, ακριβής δοκιμή Wilcoxon)

Αξιολόγηση Εσωτερικού Ελέγχου για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

.

σε δεδομένων μικροσυστοιχιών μας παρατηρήθηκε καμία σημαντική διαφορά όσον αφορά τις τιμές Ct του miR-188-5p (p = 0,83, Wilcoxon τεστ) και miR-16 (p = 0.40, Wilcoxon test) μεταξύ CRC και νεόπλασμα χωρίς ελέγχους. RNU6B και miR-16 ήταν οι πιο ευρέως χρησιμοποιούμενες ενδογενούς miRNA ελέγχου για qRT-PCR στις μελέτες miRNA [8]. Ως εκ τούτου, οι ονομάστηκε τρία miRNAs θεωρήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι για miRNA ποσοτικοποίηση. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης του RNU6B και miR-188-5p στο πλάσμα ήταν πολύ χαμηλά για να ποσοτικοποιηθεί με ανάλυση TaqMan microRNA (μέσες τιμές Ct ήταν μεγαλύτερες από 35). Ως εκ τούτου, επιλέχθηκε miR-16 ως εσωτερικού ελέγχου, όπως έδειξε μεγάλη αφθονία και λιγότερη μεταβλητότητα στην έκφραση. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά όσον αφορά τις τιμές Ct του miR-16 (p = 0.40, Wilcoxon test) μεταξύ CRC και τα δείγματα νεόπλασμα χωρίς.

Εκκαθάριση σε μια ανεξάρτητη Δείγμα της CRC ασθενείς και νεοπλασμάτων χωρίς Έλεγχοι

Για να επιβεβαιώσετε τις πέντε miRNAs (miR-29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p) εντοπίστηκαν στην ανάλυση μικροσυστοιχιών και άλλα επτά miRNAs (miR-18a, -20a, -21 , -92a, -143, -145, -181b) τα οποία είχαν προηγουμένως αναφερθεί ότι εκφράζεται διαφορικά σε CRC (εκτός miR-92a, ήταν όλα από μελέτες που βασίζονται σε δείγματα ιστού) [17], qRT-PCR πραγματοποιήθηκε για να αναλύσει η έκφραση των επιλεγμένων miRNAs στο σύνολο επικύρωσης μας (224 δείγματα πλάσματος συνολικά από 80 ασθενείς με CRC και 144 νεόπλασμα χωρίς ελέγχους).

(i) έκφραση των miRNAs.

Εννέα miRNAs ( miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145) έδειξε υψηλότερη έκφραση στο πλάσμα των ασθενών CRC σε σχέση με το νεόπλασμα χωρίς ελέγχους (miR-18a: p & lt? 0,0001, miR-20a: p = 0,001, miR-21: p & lt? 0,0001, miR-29a: p = 0,001, miR-92a: p = 0,004, miR-106b: p = 0,028, miR-133a: p = 0,0002, miR-143 & lt? 0,0001, miR-145: p = 0,0004, δοκιμασία Wilcoxon). Δεν miRNA βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω. Τα αντίστοιχα επίπεδα έκφρασης σε πλάσμα ασθενών CRC και νεόπλασμα χωρίς ελέγχους (κανονικοποιημένη σε miR-16) φαίνεται στο Σχήμα 1.

οικόπεδα Κουτί με μικρότερη παρατήρηση, κατώτερο τεταρτημόριο, διάμεσο, ανώτερο τεταρτημόριο και μεγαλύτερη παρατήρηση είναι απεικονίζεται. Τα μουστάκια επεκτείνει τις παρατηρήσεις που δεν είναι πάνω από 1,5 φορές το μήκος του κουτιού (διατεταρτημοριακό εύρος) μακριά από το παράθυρο. Οι πιο ακραίες παρατηρήσεις θεωρούνται ακραίες τιμές. Οι τιμές P βασίζονται σε Wilcoxon τεστ.

Η

(ii) Σχέση μεταξύ των miRNAs και κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά των ασθενών CRC.

Εξετάσαμε τη συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων έκφρασης των miRNAs και μερικές κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά. επίπεδο έκφρασης MiR-181β ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με μετάσταση λεμφαδένα από ότι σε ασθενείς χωρίς λεμφαδένα μετάσταση (ρ = 0,024, δοκιμή Wilcoxon). Κανένα από τα miRNAs έδειξε καμία σχέση με την περιοχή του όγκου ή το στάδιο του όγκου. Ομοίως, δεν ενώσεις παρατηρήθηκαν με την ηλικία, ούτε σε περιπτώσεις ούτε σε νεόπλασμα χωρίς ελέγχους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs ερευνήθηκαν συνδέονται με την ανάπτυξη του CRC, οι ασθενείς ήταν στρωματοποιημένη από AJCC στάδια. Γενικά, τα επίπεδα έκφρασης ήταν πολύ παρόμοιες σε πρώιμη και όψιμη καρκίνους σταδίου. MiR-18α, 20α, 21, 29α, 133α, 143 και 145 βρέθηκαν να είναι υπερ-εκφράζεται σε πλάσμα ασθενών CRC στα πρώτα στάδια σε σύγκριση με νεόπλασμα χωρίς ελέγχους. MiR-18α, -20a, -21, -92a, -133a, -143, -145 και -181b έδειξε υψηλότερα επίπεδα έκφρασης σε πλάσμα ασθενών CRC στα όψιμα στάδια σε σύγκριση με νεόπλασμα χωρίς ελέγχους. MiR-181β έδειξε υψηλότερη έκφραση στο πλάσμα των ασθενών σταδίου CRC αργά από ό, τι οι ασθενείς πρώιμο στάδιο CRC (Πίνακας 2).

Η

(iii) Η πολυπαραγοντική ανάλυση.

Με τον πίνακα των 12 miRNAs (miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145, -181b, -342-3p, -532-3p), η ROC αναλύσεις απέδωσε αδιόρθωτη AUC του 0,803 (95% CI: 0,774 – 0,888) και ρυθμίζεται, δηλαδή αισιοδοξία διορθωμένη, AUC των 0.745 (95% CI: 0,708 – 0,846). Οι καμπύλες ROC απεικονίζεται στο Σχήμα 2. Για κάθε miRNA, οι καμπύλες ROC απεικονίζεται στο Σχήμα S1.

Προσαρμογής

για υπερ-αισιοδοξία έγινε με the.632 + bootstrap μέθοδο. Συντομογραφίες:. AUC, περιοχή κάτω από δέκτη καμπύλης

Η

Η έκφραση των miRNAs in Advanced Adenoma ασθενείς και νεοπλασμάτων χωρίς Έλεγχοι

Για προχωρημένους του παχέος αδενώματα αντιπροσωπεύουν ένα πρόδρομο στάδιο της CRC. Για να εκτιμηθεί πιθανή χρήση για την έγκαιρη ανίχνευση ακόμη και των προηγμένων αδενωμάτων, οι προσδιορισθείσες 12 miRNAs προσδιορίστηκαν με qRT-PCR σε δείγματα πλάσματος από 100 συμμετέχοντες στη μελέτη (50 με προηγμένες αδενώματος και 50 νεόπλασμα χωρίς μάρτυρες). Δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στα επίπεδα έκφρασης των miRNAs παρατηρήθηκαν στο πλάσμα των ασθενών με προχωρημένο αδένωμα και νεόπλασμα χωρίς ελέγχους.

Οι συσχετίσεις των επιπέδων έκφρασης των miRNAs Plasma

Μεταξύ των συμμετεχόντων της φάσης επικύρωσης, ισχυρή συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ των επιπέδων έκφρασης του miR-18a και miR-20a (r = 0,800, ρ & lt? 0.001), που και οι δύο κωδικοποιούνται στη συστάδα miR-17-92? miR-143 και miR-145 (r = 0,762, p & lt? 0.001), το οποίο και οι δύο κωδικοποιούνται στο σύμπλεγμα miR-143/145? και miR-29a και miR-106b (r = 0.694, p & lt? 0.001), δύο στενά κατοικούν miRNAs στο χρωμόσωμα 7q. Τα επίπεδα έκφρασης ορισμένων άλλων miRNAs που δεν συνδυασμένες στο γονιδίωμα επίσης υψηλή συσχέτιση. Από την άλλη πλευρά, miR-92a η οποία είναι επίσης κωδικοποιούνται σε miR-17-92 συμπλέγματος δεν είχε υψηλή συσχέτιση με miR-18a ή miR-20a (r = 0,340 και 0,251 αντίστοιχα) (Πίνακας S3).

συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε τα επίπεδα έκφρασης των δώδεκα miRNAs σε δείγματα ασθενών CRC και νεόπλασμα χωρίς ελέγχους πλάσματος. Για τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη έκθεση σχετικά κυκλοφορούν miRNA για την ανίχνευση CRC χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA γεννήτριας για miRNA προφίλ. Πέντε miRNAs (miR-29a, -106b, -133a, -342-3p, -532-3p) εντοπίστηκαν από την μικροσυστοιχιών αναλύσεις και επτά επιλέχθηκαν από τη βιβλιογραφία (miR-18a, -20a, -21, -92a, -143, -145, -181b) για περαιτέρω διερεύνηση [17]. Στη μελέτη επικύρωσης μας, τα επίπεδα έκφρασης του miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145 και βρέθηκαν να είναι σημαντικά υψηλότερη σε ασθενείς CRC σε σχέση με neoplasm- δωρεάν ελέγχους. ROC ανάλυση των προσδιορισμένων miRNAs προσαρμοσμένο για υπερβολική αισιοδοξία από bootstrap απέδωσε την AUC του 0,745 (95% CI: 0,708 – 0,846). Το αποτέλεσμα αυτό συγκρίνεται ευνοϊκά με τα αποτελέσματα άλλων δοκιμών με βάση το αίμα για CRC ανίχνευση [5].

Διαγνωστικά χαρακτηριστικά των κυκλοφορούντων miRNAs για CRC αξιολογήθηκαν προηγουμένως σε δύο πρόσφατες μελέτες. Ng et al. αναφερθεί 0.89 ευαισθησία και ειδικότητα 0,70 σε ένα ορισμένο σημείο αποκοπής του miR-92a, και μια AUC των 0.885 (95% CI: 0,83 – 0,94) βασισμένο σε 90 ασθενείς CRC (στάδιο TNM I /II /III /IV: 6 /34/23/27) και 50 μάρτυρες [10]. Huang et al. αναφερθεί 0.830 ευαισθησία και ειδικότητα 0.847, και μια AUC των 0,883 (95% CI: 0,830 – 0,937) που λαμβάνεται σε μια πολυπαραγοντική ανάλυση, συμπεριλαμβανομένων των miR-29a και miR-92a βασίζονται σε 100 ασθενείς CRC (στάδιο TNM I /II /III /IV : 27/25/38/10) και 59 ελέγχους [9]. Έτσι, οι δύο μελέτες διαπιστώθηκε υψηλότερη AUC εκτιμήσεις από εκείνα που λαμβάνονται στην παρούσα μελέτη. Αυτές οι μελέτες δεν είχε προσαρμοστεί για υπερβολική αισιοδοξία. Ενώ το διάστημα εμπιστοσύνης 95% (0,774 – 0,888) της μη διορθωμένη AUC στη μελέτη μας περιελάμβανε τις AUCs αναφερθεί από Ng et al. και Huang et al., προσαρμογή για υπερβολική αισιοδοξία εξασθενεί την AUC κατά περίπου 6 μονάδες τοις εκατό. Παρ ‘όλα αυτά, ακόμη και μη διορθωμένη AUC εκτίμησή μας ήταν ελαφρώς χαμηλότερη από ό, τι τα προηγούμενα αναφέρθηκαν αυτά, παρά το μεγαλύτερο αριθμό περιλαμβάνονται miRNAs. Παράγοντες που θα μπορούσαν εν μέρει ευθύνονται για τις διαφορές αυτές περιλαμβάνουν τη διανομή στάδιο του ΚΕΣ και τύχης. Το ποσοστό των ασθενών CRC πρώιμο στάδιο (AJCC στάδιο Ι και II) ήταν υψηλότερη στη μελέτη μας (59%) από ό, τι στα προηγουμένως αναφερθεί μελέτες (44% και 52%, αντίστοιχα) και πιθανώς πιο κοντά στη διανομή στάδιο αναμένεται σε μια ρύθμιση διαλογής [5]. Ωστόσο, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά των επιπέδων έκφρασης από το στάδιο παρατηρήθηκε στη μελέτη μας.

παχέος αδενώματα αντιπροσωπεύουν ένα πρόδρομο στάδιο του αδενοκαρκινώματος. Μια προηγούμενη μελέτη είχε αναφέρει ότι η διαφορική έκφραση του πλάσματος miR-29a και miR-92a θα μπορούσε επίσης να διακρίνουν ασθενείς με προχωρημένο αδένωμα από νεόπλασμα χωρίς ελέγχους, ακόμη και αν διακρίσεων ήταν λιγότερο έντονη από ό, τι για τους ασθενείς CRC [9]. Στη μελέτη μας, καμία από τις miRNAs διερευνήθηκαν βρέθηκε σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο στους ασθενείς με προχωρημένο αδένωμα σε σύγκριση με τα νεόπλασμα χωρίς ελέγχους. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι οι miRNAs έρευνας δεν μπορεί να είναι χρήσιμα για τη διάγνωση των προηγμένων αδενωμάτων. Ωστόσο, η έλλειψη σημαντικών διαφορών μπορεί επίσης να οφείλεται σε περιορισμένη ισχύ για την ανίχνευση μέτρια διαφορές με το μέγεθος του δείγματος των υπομελέτη μας συγκρίνοντας τους μεταφορείς των προηγμένων αδενωμάτων και νεόπλασμα χωρίς υποκείμενα δεδομένη την παρατηρούμενη έλλειψη διαφορικής έκφρασης των ατομικών miRNAs, ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο για την πρόβλεψη των προηγμένων αδενωμάτων δεν εφαρμόστηκε.

Αν και η διαφορική έκφραση του πλάσματος miR-18a, -20a, -21, -106b, -133a, -143, -145 και -181b σε ασθενείς CRC εξετάστηκε ορισμένες μελέτες που βασίζονται δείγμα ιστού [24] – [27], αυτό είναι, εξ όσων γνωρίζουμε, η πρώτη μελέτη εκθέσεων σχετικά με την έκφραση αυτών των miRNAs σε δείγματα από ένα μεγάλο αριθμό ασθενών με CRC και νεόπλασμα χωρίς ελέγχους πλάσματος. Στατιστικά σημαντικές διαφορές στην έκφραση όλων αναλύονται miRNAs εκτός miR-181β, miR-342-3p και miR-532-3p παρατηρήθηκαν. Περιέργως, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-133α -143, -145 και ήταν σημαντικά υπερ-εκφράζεται στο πλάσμα ασθενών CRC σε σύγκριση με τα νεόπλασμα χωρίς ελέγχους, η οποία φαίνεται να έρχεται σε αντίθεση δεδομένα που δείχνουν σταθερά λιγότερη έκφραση από αυτά τα τρία μελέτες miRNAs σε καρκίνο σε δείγμα ιστού με βάση [28] – [34]. Περαιτέρω μελέτες με μεγαλύτερο αριθμό ασθενών και ταυτόχρονες μετρήσεις της έκφρασης των miRNAs στο πλάσμα και στους ιστούς μπορεί να δικαιολογηθεί, να διευκρινιστεί αυτό το θέμα.

Ένα κοινό πρόβλημα στον τομέα της έρευνας σχετικά κυκλοφορεί miRNAs είναι ότι δεν υπάρχει συναίνεση εσωτερικός έλεγχος έχει αποδειχθεί. Αξιολογήσαμε miR-16, miR-188-5p και RNU6B, και οφείλεται στη συνεπή, σταθερή και υψηλή έκφραση σε όλα τα δείγματα πλάσματος, επιλέχθηκε miR-16, όπως του εσωτερικού ελέγχου στο πλαίσιο των δοκιμών με βάση δείγμα πλάσματος, αλλά περισσότερο εμπειρική επικυρώσεις είναι ακόμα που απαιτείται για μια συναίνεση σχετικά στιβαρό και ακριβές εσωτερικών ελέγχων.

Οι εννέα miRNAs βρέθηκε να είναι υπερ-εκφράζεται σε πλάσμα ασθενών CRC στη μελέτη μας έχουν επίσης ερευνηθεί σε σχέση με τις άλλες ασθένειες στις προηγούμενες έρευνες [9] , [10], [33], [35] – [48]. (Πίνακας 3) Για παράδειγμα, το πλάσμα miR-21 βρέθηκε να είναι υπερ-εκφράζεται σε μια ευρεία ποικιλία κακοηθειών περιλαμβανομένων ηπατοκυτταρικού καρκινώματος, καρκίνου του προστάτη, και γαστρικό καρκίνο [35], [36], [42], [46] – [49]. Αυτά τα κοινά σημεία στο πρότυπο έκφρασης του miR-21 σε διαφορετικούς καρκίνους suggestes ότι η λειτουργία θα μπορούσε miR-21 ως ογκογονίδιο. Λειτουργικές έρευνες έδειξαν ότι miR-21 στόχων όγκου γονίδια καταστολής όπως φωσφατάση και tensin ομόλογο (ΡΤΕΝ) και αντιστρόφως ρυθμίζει την έκφραση του [50]. PTEN έχει κατετάγη η δεύτερη πιο συχνά μεταλλαγμένο ογκοκατασταλτικό γονίδιο p53 μετά. Μπορεί να αδρανοποιηθεί με μετάλλαξη με απώλεια της ετεροζυγωτίας, μεθυλίωση προαγωγού, miRNA παρεμβολές και μερικές άλλες μηχανισμών σε έναν αριθμό καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων του εγκεφάλου, του προστάτη, του καρκίνου της μήτρας [51]. Διαφορική έκφραση ορισμένων miRNAs σε πολλαπλές καρκίνους υποστηρίξει τις προτάσεις ότι θα πρέπει κατά κανόνα να συνδυαστεί με επιπλέον miRNAs όταν χρησιμοποιείται για την ανίχνευση των συγκεκριμένων μορφών καρκίνου.

Η

Υπάρχουν κάποιοι περιορισμοί που πρέπει να λαμβάνονται υπόψη κατά την ερμηνεία του αποτελέσματα αυτής της μελέτης. Πρώτον, το μέγεθος του δείγματος είναι ακόμη μικρή, ιδιαίτερα στη φάση της επιλογής δείκτη. Δεύτερον, πολλοί αφθονία miRNAs »στο πλάσμα είναι πολύ χαμηλές για να ποσοτικοποιηθεί με ακρίβεια από qRT-PCR, ως εκ τούτου, δεν θα μπορούσε να θεωρηθεί κάποια ενδεχόμενη σχετική δείκτες. Τρίτον, απομένει να καθοριστεί σε ποιο βαθμό τροποποιημένα επίπεδα έκφρασης των miRNAs που βρέθηκαν μεταξύ CRC ασθενείς σε αυτή τη μελέτη είναι CRC συγκεκριμένες.

Συμπεράσματα

miRNAs πλάσμα φαίνεται να είναι δυνητικά χρήσιμο βιοδείκτες για την έγκαιρη ανίχνευση και τη διάγνωση του CRC. Ενώ η έρευνα για το πλάσμα που βασίζεται miRNA προφίλ είναι ακόμη σε πολύ πρώιμο στάδιο σε σχέση με την έρευνα για την βάση του ιστού miRNA προφίλ, θα μπορούσε να έχει τη δυνατότητα να συμβάλει στην ανάπτυξη νέων προσεγγίσεων της μη επεμβατικής, το αίμα προσυμπτωματικό έλεγχο CRC. Παρ ‘όλα αυτά, η διαγνωστική απόδοση του εντοπίστηκαν πίνακα των miRNAs μπορεί να μην είναι ακόμη αρκετή για να ανταγωνιστεί με την απόδοση κάποιων άλλων μη επεμβατικές εξετάσεις, ιδίως ανοσοχημικές στα κόπρανα εξετάσεις αίματος [52]. Περαιτέρω έρευνα σε μια δοκιμή που βασίζεται στο αίμα multi-δείκτη, συμπεριλαμβάνοντας ενδεχομένως και τον πίνακα των miRNAs που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την ενίσχυση της ρεπερτόριο για μη-επεμβατικό έλεγχο του καρκίνου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1 .

Δέκτης καμπυλών με χρήση 12 επιλεγμένων microRNAs (miR-18a, -20a, -21, -29a, -92a, -106b, -133a, -143, -145, -181b, -342-3p και ΜΙΚ 532-3p) για τις διακρίσεις των 80 ασθενών καρκίνο του παχέος εντέρου και 144 νεόπλασμα χωρίς ελέγχους. Συντομογραφίες: FPR, ποσοστό ψευδώς θετικών. TPR, αλήθεια θετικό ρυθμό. . AUC, περιοχή κάτω από δέκτη καμπύλης

doi: 10.1371 /journal.pone.0062880.s001

(DOC)

Πίνακα S1.

667 ανθρώπινη microRNAs δοκιμαστεί χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Array

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062880.s002

(DOC)

Πίνακας S2.

RT-αστάρι πισίνες που χρησιμοποιούνται για την πολλαπλή Real-Time PCR ποσοτική

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062880.s003

(DOC)

Πίνακα S3.

Spearman συντελεστές συσχέτισης των επιπέδων microRNAs έκφρασης μεταξύ των 324 συμμετεχόντων της επικύρωσης (p & lt? 0.001, αν δεν σχολιασμένη)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0062880.s004

(DOC)