Αφηρημένο

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι ένας μικρός πληθυσμός των καρκινικών βλαστικών κυττάρων (ΚΕΠ) συμμετέχει στην εγγενή αντίσταση στη θεραπεία του καρκίνου. Το υποξικό μικροπεριβάλλον είναι μια σημαντική θέση βλαστικών κυττάρων που προωθεί την εμμονή των ΚΕΠ σε όγκους. Ο στόχος μας εδώ ήταν για τη διαλεύκανση του ρόλου της υποξίας και ΚΕΠ στην αντίσταση προς gefitinib σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) με την ενεργοποίηση του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μετάλλαξης. κυτταρικές σειρές NSCLC, PC9 και HCC827, τα οποία εκφράζουν τις

EGFR

εξόνιο 19 μεταλλάξεις διαγραφής, είχαν εκτεθεί σε υψηλή συγκέντρωση gefitinib κάτω ορθοξικές ή συνθήκες υποξίας. Επτά ημέρες μετά την έκθεση gefitinib, ένα μικρό κλάσμα των βιώσιμων κυττάρων ανιχνεύθηκαν, και αυτοί αναφέρονται ως «gefitinib ανθεκτικά persisters» (GRPs). CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4 και ALDH1A1-όλα τα γονίδια που εμπλέκονται στην βλαστική ικανότητα, ήταν ιδιαίτερα εκφράζονται σε GRPs σε PC9 και HCC827 κύτταρα, και PC9 GRPs παρουσίασαν υψηλή πιθανότητα καρκινογένεσης

in vivo

. Η έκφραση του ινσουλινοειδούς αυξητικού παράγοντα 1 (IGF1) επίσης ρυθμίζεται αυξητικά και IGF1 υποδοχέα (IGF1R) ενεργοποιήθηκε επί GRPs. Σημαντικά, υποξική έκθεση αυξήθηκε σημαντικά το σχηματισμό σφαίρα, αντανακλώντας την ικανότητα αυτο-ανανέωση, και ο πληθυσμός των CD133- και Oct4-θετικών GRPs. Επιπλέον, υποξία ρυθμίζεται προς τα πάνω έκφραση IGF1 μέσω υποξία παράγοντα 1α (HIF1α), και σημαντικά προώθησε την ενεργοποίηση των IGF1R για GRPs. Knockdown έκφρασης IGF1 μείωσε σημαντικά φωσφορυλιωμένο GRPs IGF1R εκφράζουν υπό συνθήκες υποξίας. Τέλος, η αναστολή της HIF1α ή IGF1R με ειδικούς αναστολείς μειώθηκε σημαντικά τον πληθυσμό των CD133- και Oct4-θετικών GRPs, οι οποίες αυξήθηκαν κατά υποξία σε PC9 και HCC827 κύτταρα. Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η υποξία αύξησε τον πληθυσμό των ΚΕΠ του πνεύμονα ανθεκτικό σε gefitinib στο

EGFR

μετάλλαξη θετικό NSCLC ενεργοποιώντας IGF1R. Στόχευση την οδό IGF1R μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για την υπέρβαση αντίσταση gefitinib στο

EGFR

μετάλλαξη θετικό NSCLC που προκαλείται από ΚΕΠ πνεύμονα και παράγοντες μικροπεριβάλλον όπως υποξία του όγκου

Παράθεση:. Murakami Α, Takahashi F , Nurwidya F, Kobayashi Ι, Minakata Κ, Hashimoto Μ, et al. (2014) υποξία Αυξάνει Gefitinib-Resistant καρκίνο του πνεύμονα Stem Cells, μέσω της ενεργοποίησης του Insulin-Like Growth 1 υποδοχέα του παράγοντα. PLoS ONE 9 (1): e86459. doi: 10.1371 /journal.pone.0086459

Συντάκτης: Stephanie Filleur, Texas Tech University Κέντρο Επιστημών Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Ιουλίου 2013? Αποδεκτές: 13 Δεκ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Murakami et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την Grant-in-Ενισχύσεις για την Επιστημονική Έρευνα Νο 23591906 (Φουμιγιούκι Takahashi) από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η απόκτηση ανθεκτικότητας σε αντικαρκινικά φάρμακα παραμένει βασικό εμπόδιο για τη βελτίωση της πρόγνωσης των ασθενών με καρκίνο. Η αντοχή στα φάρμακα μπορεί να προκύψει μέσω ποικιλίας μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης εκροής φαρμάκου από τα καρκινικά κύτταρα, επαυξημένης μεταβολισμό των φαρμάκων, δευτεροβάθμια μεταλλάξεις στο φάρμακο στόχο, και την εμπλοκή των εναλλακτικών οδών επιβίωσης [1]. Οι μηχανισμοί αυτοί της επίκτητης αντοχής προκαλείται γενικά από γενετικές μεταβολές εντός των κυττάρων του όγκου, τα οποία επιμένουν κατά τη διάρκεια της θεραπείας του καρκίνου. Ωστόσο, πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης αποκαλύψει μη μεταλλακτική μηχανισμών αντοχής φαρμάκου, συμπεριλαμβανομένης της ύπαρξης μικρού πληθυσμού των καρκινικών βλαστοκυττάρων (ΚΕΠ) [2]. ΚΕΠ, τα οποία είναι επίσης γνωστά ως ογκογενή κύτταρα και βλαστικά όπως τα καρκινικά κύτταρα, οι δείκτες εκφράζουν βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων CD133, ABCG2, Bmi-1, και Oct4, και μπορεί να σχηματίσει επιπλέοντα σφαίρες σε μέσο χωρίς ορό, μια ιδιότητα που σχετίζεται με τα βλαστικά κυττάρων [3] – [5]. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι μικροί πληθυσμοί του ΚΕΠ είναι εγγενώς πιο ανθεκτικοί σε μια ποικιλία αντικαρκινικών φαρμάκων και είναι υπεύθυνοι για την αντίσταση στη θεραπεία του καρκίνου, που συχνά συνοδεύει υποτροπή του όγκου [6]. Έτσι, ΚΕΠ στόχευσης μπορεί να βελτιώσει τα αποτελέσματα της θεραπείας και να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών για ασθενείς με καρκίνο.

Stem «κόγχες» κύτταρο ορίζονται ως συγκεκριμένες τοποθεσίες ή μικροπεριβάλλοντα που διατηρούν τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων αυτο-ανανέωση και πολυδυναμικότητα [ ,,,0],7], [8]. Συμπαγείς όγκοι συχνά περιέχουν περιοχές με ανεπαρκή παροχή οξυγόνου, μια κατάσταση γνωστή ως υποξία, και αρκετές πρόσφατες εκθέσεις έχουν προτείνει ότι η υποξία προάγει την επιμονή του ΚΕΠ σε όγκους [9]. Αυτό υποξική θέση είναι υπεύθυνος για τη συντήρηση CSC και παίζει ένα ρόλο στην προώθηση της θεραπευτικής αντίσταση [10]. Έτσι, με στόχο την υποξική μικροπεριβάλλον μπορεί να είναι μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τον αποτελεσματικό έλεγχο των ΚΕΠ [9].

Για προχωρημένους μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [11]. Σωματικές μεταλλάξεις στο γονίδιο του υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR), όπως ένα εντός πλαισίου διαγραφή μετάλλαξη στο εξόνιο 19, συνδέονται με ευνοϊκή ανταπόκριση στους αναστολείς τυροσίνης κινάσης του EGFR (EGFR-ΤΚΙδ), gefitinib και erlotinib [12]. EGFR μεταλλάξεις της περιοχής της κινάσης συμβαίνουν σε σημαντικά υψηλότερη συχνότητα σε όγκους από την Ανατολή Ασιάτες ασθενείς σε σύγκριση με μη-Ασιάτες [13]. Ωστόσο, στις περισσότερες εκθέσεις, επιβίωση χωρίς εξέλιξη των ασθενών δεν υπερβαίνει τους 12 μήνες, και οι περισσότεροι ασθενείς ανέπτυξαν επίκτητης αντοχής [14]. Επιπλέον, το 25-30% των ασθενών είναι εγγενώς ανθεκτικοί σε EGFR-TKIs καθώς οι όγκοι τους διαγνωστεί ως φιλοξενεί ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

EGFR

[15], [16]. Οι κύριοι μηχανισμοί αντίστασης εντοπιστεί μέχρι σήμερα συμπεριλαμβάνονται οι δευτερογενείς μεταλλάξεις και ένα «διακόπτη ογκογονίδιο κινάσης.» Το

EGFR

λογαριασμούς μετάλλαξη Τ790Μ για το 50% των περιπτώσεων, και

ΚΟΑ

ενίσχυσης μπορεί να ανιχνευθεί σε 20 % των ασθενών με

EGFR

μεταλλαγμένου ΤΚΙ-ανθεκτική NSCLC [17]. Ωστόσο, οι υπεύθυνοι για την εγγενή αντοχή και άλλες επίκτητη ανθεκτικότητα σε EGFR-ΤΚΙ μηχανισμών, καθώς και το ζήτημα του εάν ΚΕΠ και υποξική κόγχες συμβάλλουν στην αντίσταση του EGFR ΤΚΙ, δεν είναι πλήρως κατανοητοί.

IGF1R είναι μια διαμεμβρανική κινάσης τυροσίνης υποδοχέα υπεύθυνο για τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [18]. IGF1R εκφράζεται σε πολλούς τύπους καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των NSCLC [18], και αυξημένη ενεργοποίηση του IGF1R εμπλέκεται στην αντίσταση στη χημειοθεραπεία και στοχευμένες θεραπείες όπως EGFR-TKIs [19], [20]. Αρκετές πρόσφατες αναφορές έχουν προτείνει ότι IGF1R διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην επιβίωση ορισμένων ΚΕΠ [21]. Στη χημειοθεραπεία καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα εμπλουτίστηκαν για ΚΕΠ και αυξημένη ευαισθησία σε αναστολή IGF1R [21]. Σύμφωνα με Sharma et al., Το φάρμακο-ανεκτική υποπληθυσμός εξής θανατηφόρο έκθεση στο φάρμακο φάνηκε να έχει το φαινότυπο CSC και εξέφρασε φωσφορυλιωμένο IGF1R σε αρκετά μοντέλα δοκιμάστηκαν κυτταρική γραμμή, συμπεριλαμβανομένου του NSCLC κυτταρική γραμμή PC9. Ταυτόχρονης θεραπείας του PC9 κυττάρων με EGFR-ΤΚΙ συν IGF1R αναστολέα εμπόδισε την εμφάνιση του φαρμάκου ανεκτική φαινότυπο CSC [2]. Συλλογική ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ένα πιθανό ρόλο για IGF1R σηματοδότησης στην ανοχή του φαρμάκου ΚΕΠ σε EGFR-TKIs. Ωστόσο, η συσχέτιση μεταξύ της υποξίας, ΚΕΠ, και IGF1R σηματοδότησης στην αντίσταση EGFR-ΤΚΙ δεν έχει διευκρινιστεί.

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε το ρόλο της υποξίας στην επιμονή των ΚΕΠ του πνεύμονα στην αντίσταση gefitinib σε NSCLC με την ενεργοποίηση

EGFR

μεταλλάξεις. Η NSCLC κυτταρικές σειρές PC9 και HCC827, που φέρει ένα ενεργοποίησης

EGFR

μετάλλαξη, εκτέθηκαν σε μία υψηλή συγκέντρωση του gefitinib υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες. Βρήκαμε ότι η υποξία αυξημένη gefitinib ανθεκτικά ΚΕΠ του πνεύμονα σε

EGFR

της με θετικό στη μετάλλαξη NSCLCs ενεργοποιώντας IGF1R. Η βιολογική σημασία της υποξίας για την επιμονή του gefitinib ανθεκτικά ΚΕΠ και αυξημένη ενεργοποίηση των IGF1R ερευνήθηκαν.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture και αντιδραστήρια

Οι κυτταρικές σειρές NSCLC PC9 και HCC827, τα οποία εκφράζουν

EGFR

εξόνιο 19 μεταλλάξεις διαγραφής (ΔE746-A750), χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. κύτταρα PC9 καθορίστηκαν στο Τόκιο Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Τόκιο, Ιαπωνία), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], και ευγενικά από τον Dr. Kazuto Nishio (Τμήμα Genome Biology, της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου Κίνκι, Οζάκα). HCC827 κύτταρα ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Οι κυτταρικές γραμμές επιβεβαιώθηκαν να είναι μυκόπλασμα-free. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Wako, Osaka, Japan) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), πενικιλλίνη και στρεπτομυκίνη (100 U /ml και 100 μg /mL, αντίστοιχα), και αναπτύχθηκαν σε υγροποιημένο 5% CO

2 ατμόσφαιρα στους 37 ° C σε ένα επωαστή, στην οποία η τάση οξυγόνου κρατήθηκε σε είτε 21% (νορμοξία) ή 1% (υποξία). Gefitinib αγοράστηκε από τον JS Research Chemicals Trading (Wedel, Γερμανία). YC-1 και AEW541 αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ, USA) και Σέλεκ Chemicals (Houston, ΤΧ, USA), αντίστοιχα.

Δημιουργία Gefitinib ανθεκτικών Persisters (GRPs)

Ένα σύνολο 2 × 10

5 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 10-cm τρυβλία δέκα και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με gefitinib σε συγκέντρωση 1 μΜ, η οποία είναι 30-50 φορές το καθιερωμένο IC

50 τιμές, και επωάστηκαν υπό φυσιολογική οξυγόνωση (21% O

2) ή υποξία (1% O

2). Το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο που περιέχει gefitinib κάθε 3 ημέρες. Βιώσιμα κύτταρα που παρέμεινε προσκολλημένη στο πιάτο την ημέρα 7 υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες θεωρήθηκαν ως gefitinib ανθεκτικά persisters (GRPs) ή υποξικά gefitinib ανθεκτικά persisters (υποξική GRPs), αντίστοιχα, και συλλέχθηκαν για ανάλυση. Η γενετική ταυτότητα των GRPs με τα γονικά κύτταρα επιβεβαιώθηκε με τη χρήση της GenomeLab Ανθρώπινα STR Primer ρυθμιστεί από Beckman Coulter (Fullerton, CA, USA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

Ολικά RNAs εκχυλίσθηκαν από κυτταρικές γραμμές με χρήση του κιτ απομόνωσης mirVana miRNA (Ambion, Austin, ΤΧ, USA). cDNA παράχθηκε από 1 ή 2 μg RNA χρησιμοποιώντας το κιτ First-Strand cDNA Synthesis (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qPCR) εκτελέστηκε με τη χρήση ταχείας SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) όπως περιγράφεται προηγουμένως [22]. Το ακόλουθο πρόγραμμα διεξήχθη: διατήρηση στους 95 ° C για 20 δευτερόλεπτα, ενίσχυση μέσω 40 κύκλων (μετουσίωση στους 95 ° C για 3 δευτερόλεπτα, ανόπτηση, και επέκταση στους 60 ° C για 30 sec), με ταυτόχρονη ανάλυση τήξη καμπύλη. Αξιολογήσαμε έντεκα γονίδια καθαριότητας (

ACTB, GAPDH, UBC, Β2Μ, YWHAZ, SF3A1, 28S rRNA, EIF4A2, SDHA, TOP1,

και

ATP5B

) σε πειραματικά δείγματα για τον προσδιορισμό της πιο σταθερά εκφραζόμενα γονίδια ελέγχου χρησιμοποιώντας το λογισμικό geNorm (https://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/). Ακτίνη βήτα (

ACTB

) και ηλεκτρική αφυδρογονάση συγκρότημα, υπομονάδας Α φλαβοπρωτεϊνη (

SDHA

) προσδιορίστηκαν ως οι πιο σταθερό γονίδια καθαριότητας στο κελί μοντέλα μας με ανάλυση qPCR? Ως εκ τούτου,

ACTB

ή

SDHA

χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικοί έλεγχοι

Οι εκκινητές που ήταν ειδικά για τα γονίδια είχαν ως εξής:.

CD133

Προώθηση, 5′-GGCCCAGTACAACACTACCAA-3 ‘

Αντίστροφη, 5′-CGCCTCCTAGCACTGAATTGATA-3′

Oct4

Προώθηση, 5′-GAGTGAGAGGCAACCTGGAG-3 «

Αντίστροφη, 5′-GCCGGTTACAGAACCACACT-3 ‘

Sox2

Προώθηση, 5′-TACAGCATGTCCTACTCGCAG-3′

Αντίστροφη, 5′-GAGGAAGAGGTAACCACAGGG -3 ‘

Nanog

Προώθηση, 5′-TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT-3′

Αντίστροφη, 5′-AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG-3 ‘

CXCR4

Προώθηση, 5′-ACGCCACCAACAGTCAGAG-3 ‘

Αντίστροφη, 5′-AGTCGGGAATAGTCAGCAGGA-3′

ALDH1A1

Προώθηση, 5′-GCACGCCAGACTTACCTGTC-3 ‘

Η αντίστροφη, 5′-CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG-3 ‘

IGF1

Προώθηση, 5′-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3′

Αντίστροφη, 5′-CGACTGCTGGAGCCATACC-3 «

ανοσοφθορισμού

PC9 ή HCC827 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Lab-Tek θάλαμο II διαφάνειες (Nunc, Rochester, NY, USA) με ή χωρίς 1 μΜ ή 2 μΜ gefitinib και κάτω ορθοξικές ή υποξικό συνθήκες για 72 ώρες, σταθεροποιήθηκαν με 8% παραφορμαλδεΰδη για 20 λεπτά, και διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 για 3 λεπτά. Μετά από αποκλεισμό με 10% ορό κατσίκας σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, τα κύτταρα επωάστηκαν στους 4 ° C όλη τη νύκτα με τα ακόλουθα πρωτογενή αντισώματα: CD133 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Γερμανία), Oct4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), IGF1 (Abcam, Cambridge, UK), και pIGF1R (Sigma-Aldrich). Οι πρωτεΐνες έγιναν ορατές με επώαση με δευτερογενές αντίσωμα επισημασμένο με Alexa Fluor 488 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG ή Alexa Fluor 594 αντι-ποντικού κατσίκας IgG (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Διαφάνειες τοποθετήθηκαν χρησιμοποιώντας Vectashield Τοποθέτηση Μεσαίο με DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Εικόνες ελήφθησαν σε Axioplan 2 απεικόνισης (Zeiss, Oberkochen, Germany) με λογισμικό AxioVision (ZEISS). Εικόνες που χρησιμοποιούνται για τις συγκρίσεις διαφορετικών κυττάρων ή /και θεραπείες αποκτήθηκαν με τις ίδιες ρυθμίσεις των οργάνων και οι χρόνοι έκθεσης και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με παρόμοιο τρόπο. Μετρήθηκαν ο αριθμός των CD133-, Oct4-, και φωσφορυλιωμένη IGF1R-θετικά κύτταρα? η αναλογία των θετικών κυττάρων υπολογίστηκε σε πέντε πεδία για κάθε πείραμα.

Σφαίρα δοκιμασίας σχηματισμού

καλλιέργειες εναιωρήματος Single-κυττάρων παρασκευάστηκαν σε πυκνότητες 2.5 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο σε μέσου DMEM /F12 άνευ ορού (Gibco, Grand Island, ΝΥ, USA) συμπληρωμένο με εμπορικές Β27 μείγμα ορμόνης (Gibco), EGF (20 ng /mL? Gibco), FGF (20 ng /mL? Invitrogen), και ηπαρίνη ( 2 μg /mL), και εμβολιάστηκαν σε 6-φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως (Corning, Corning, ΝΥ, USA). γονικά κύτταρα PC9 και GRPs επωάστηκαν υπό συνθήκες ορθοξικές, ενώ GRPs PC9 υποξικές επωάστηκαν υπό συνθήκες υποξίας. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε κάθε 3 ημέρες? ο αριθμός και το μέγεθος των σφαιρών καταγράφηκαν και αναλύσεις ανοσοφθορισμού έγιναν 7 ημέρες μετά την έναρξη της περιόδου καλλιέργειας [23].

Παρέμβαση RNA

Μικρές παρεμβαλλόμενα RNA (siRNA που) με στόχο IGF1 ( stealth Επιλέξτε RNAi siRNA) συντέθηκαν κατά παραγγελία από την Invitrogen. Ένας αρνητικός μάρτυρας αγοράστηκε επίσης από την Invitrogen. PC9 ή HCC827 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με 2 διαφορετικά ειδικά siRNAs και 1 μη ειδικό έλεγχο χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη RNAiMAX (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα κύτταρα αποκολλήθηκαν και αραιώνονται σε πλήρες μέσο ανάπτυξης χωρίς αντιβιοτικά και στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε κάθε ένα από τα φρεάτια. RNAi duplex και Lipofectamine RNAiMAX αναμίχθηκαν σε Opti-MEM®I (Gibco) μέσο μειωμένο ορό και επωάστηκαν για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. RNAi duplex-Lipofectamine ™ RNAiMAX σύμπλοκα προστέθηκαν στα φρεάτια που περιέχουν κύτταρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για 48 ώρες στους 37 ° C

Οι αλληλουχίες του siRNA κατά IGF1 έχουν ως εξής:.

IGF1 # 1:5′-ACACCAUGUCCUCCUCGCAUCUCUU-3 ‘

IGF1 # 2:5′-UGCUGCUUCCGGAGCUGUGAUCUAA-3 ‘

Colony Δοκιμασία Αναστολή

κύτταρα PC9 (2 × 10

5) ή HCC827 κύτταρα (4 × 10

5) τοποθετήθηκαν σε πλάκες των 10 cm και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν με 1 μΜ ή 2 μΜ gefitinib, και με ή χωρίς 0,01 μΜ, 0,1 μΜ, ή 1 μΜ AEW541 υπό συνθήκες υποξίας 18 ημέρες για τα κύτταρα PC9 ή 11 ημέρες για την HCC827 κύτταρα. Μετά την επώαση, μετρήθηκαν οι αριθμοί των αποικιών.

In vivo

Ογκογονικότητα Μελέτη

NOD /Shi-scid /IL-2Rcnull (NOG) ποντικοί (7-εβδομάδα- παλιά, θηλυκό) αγοράστηκαν από την Κεντρικό Ινστιτούτο πειραματόζωα (Kanagawa, Ιαπωνία). Όλα τα ποντίκια απεστάλησαν στο Πανεπιστήμιο Juntendo και διατηρήθηκαν υπό συνθήκες χωρίς παθογόνα. Οι ποντικοί στεγάστηκαν σε ένα δωμάτιο υπό ελεγχόμενη θερμοκρασία (25 ° C), υγρασία, φωτισμός και (12-h φως /σκοτάδι κύκλο).

κατά βούληση

πρόσβαση σε τροφή και νερό βρύσης αφέθηκε καθ ‘όλη τη διάρκεια της μελέτης. Για να αξιολογηθεί η

in vivo

ογκογόνο δυναμικό, 1 × 10 κύτταρα ή 1 × 10

2 κύτταρα των γονικών κυττάρων και νορμοξικές PC9 και υποξικές GRPs PC9 αναμίχθηκαν με Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA) και εγχύθηκε σε αμφότερες τις πλευρές ποντικών NOG. σχηματισμός όγκου αξιολογήθηκε 22-50 ημέρες μετά την ένεση.

Ηθική

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις βασικές κατευθύνσεις για την ομαλή διεξαγωγή του πειράματος των ζώων και των συναφών δραστηριοτήτων Ακαδημαϊκά Ιδρύματα Ερευνών με η διεθνής δικαιοδοσία του Υπουργείου Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας (Σημείωση Νο 71, 2006) και εγκρίθηκαν από την επιτροπή για τα πειράματα σε ζώα του Πανεπιστημίου Juntendo με την έγκριση Νο 240182.

Στατιστική Ανάλυση

οι τιμές συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας ένα δύο-ουρά του Student

t-test

. Για να συγκρίνετε πολλές ομάδες, εφαρμόστηκε μια μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης δοκιμής (ANOVA). Η στατιστική ανάλυση του μεγέθους σφαίρας διεξήχθη χρησιμοποιώντας το τεστ Kruskal-Wallis. Οι διαφορές μεταξύ των μέσων θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν ρ & lt?. 0.05

Αποτελέσματα

Απομόνωση και Gene Expression Ανάλυση Gefitinib ανθεκτικά Persisters (GRPs) Προέρχεται από NSCLC Lines κύτταρο που φιλοξενεί ένα Ενεργοποίηση

EGFR

μετάλλαξη

Ο NSCLC κυτταρική σειρά PC9, που μεταφέρουν μια ενεργοποίησης

EGFR

μετάλλαξη, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1 μΜ gefitinib. Όπως περιγράφεται στην προηγούμενη έκθεση [2], ένα μικρό κλάσμα των βιώσιμων κυττάρων θα μπορούσε να επιβιώσει και να παραμείνει 7 ημέρες αργότερα, ενώ τα περισσότερα κύτταρα ήταν νεκρά μέσα σε λίγες ημέρες (Σχήμα 1Β). Εμείς που αναφέρονται σε αυτά τα κύτταρα ως gefitinib ανθεκτικά persisters (GRPs). Αν και GRPs ήταν εξαιρετικά ηρεμίας, GRPs επαναλαμβάνεται πολλαπλασιαζόμενα υπό την υψηλή συγκέντρωση του gefitinib (Σχήμα 1 C) και τελικά έδειξε την κανονική πολλαπλασιασμού (Σχήμα 1 D). Μια ανάλογη πληθυσμός GRPs ανιχνεύθηκε στο άλλο NSCLC κυτταρική γραμμή δοκιμάστηκε, HCC827 φιλοξενούν ένα ευαίσθητο

EGFR

μετάλλαξη, με κατεργασία με 1 μΜ gefitinib (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Κατ ‘αρχάς, 2 × 10

5 κύτταρα PC9 απλώθηκαν σε πλάκες των 10 cm και αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες (Α). Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ gefitinib. Φρέσκα gefitinib μέσων που περιέχουν αντικαταστάθηκε κάθε 3 ημέρες. Επτά ημέρες μετά την έκθεση gefitinib, ένα μικρό κλάσμα των βιώσιμων κυττάρων παρέμειναν (Β), επαναλαμβάνεται πολλαπλασιαζόμενα 18 ημέρες αργότερα (C), και συνέχισαν να πολλαπλασιάζονται ακόμη και 30 ημέρες αργότερα (D). Α Εκπρόσωπος μικροσκοπική εικόνα των γονικών κυττάρων PC9. Β, Γ, Δ Εκπρόσωπος εικόνες το GRP PC9 εκτίθενται σε 1 μΜ gefitinib για 7, 18, και 30 ημερών φωτογραφήθηκαν, αντίστοιχα.

Η

Η γενετική ταυτότητα το GRP με τα μητρικά κύτταρα επιβεβαιώθηκαν χρησιμοποιώντας μια ανάλυση που βασίζεται στην PCR (GenomeLab Ανθρωπίνων STR Primer ρυθμιστεί από Beckman Coulter) που ανακρίνει ένα σύνολο από 12 σύντομες διαδοχικές επαναλήψεις. Ανάλυση του γονιδιωματικού DNA από γονικά κύτταρα και GRPs του PC9 και HCC827 κύτταρα παρουσιάζονται στο Σχήμα S1 σε πληροφορίες S1. STR προφίλ των πατρικών κυττάρων και GRPs είναι ίδιες. Επιπλέον, GRPs από PC9 και HCC827 κύτταρα διατηρηθεί η

EGFR

εξόνιο 19 μετάλλαξη διαγραφής (ΔE746-A750), όπως αξιολογήθηκε με άμεση ανάλυση αλληλουχίας (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώνουν ότι GRPs δεν προκύπτουν από μολυσματικά κύτταρα. Ούτε η

EGFR

μετάλλαξη Τ790Μ ούτε

MET

γονιδιακή ενίσχυση παρατηρήθηκε σε GRPs τόσο PC9 και HCC827 κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Η κινάση της τυροσίνης Src δεν ενεργοποιήθηκε σε GRPs τόσο PC9 και HCC827 κύτταρα σε σύγκριση με μη γονικών κυττάρων (Σχήμα S2 στα Πληροφοριακά S1). EGFR και HER3 ενεργοποιήθηκαν για τη γονική PC9 και HCC827 κύτταρα, αλλά εκφράσεις κατεστάλησαν σημαντικά στις GRPs των δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα S2 με πληροφορίες S1).

Για να προσδιορίσει τον μηχανισμό που διέπουν την αντίσταση gefitinib στο μοντέλο των κυττάρων μας, αναλύσαμε πρώτα την έκφραση του γονιδίου σε γονικά κύτταρα και GRPs χρησιμοποιώντας qPCR. Η υποθετική πνεύμονας CSC δείκτη CD133 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε GRPs σε PC9 και HCC827 κύτταρα (Σχήμα 2Α), προτείνοντας έναν φαινότυπο βλαστική ικανότητα. Για να καθοριστεί περαιτέρω εάν GRPs θα μπορούσε να αποκαλύψει τα χαρακτηριστικά των ΚΕΠ σε μοντέλα κυττάρων μας, αξιολογήσαμε την έκφραση των γονιδίων που ρυθμίζουν και τη διατήρηση του φαινοτύπου των βλαστικών κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, η γονιδιακή έκφραση του Oct4, Sox2, και Nanog, τα οποία είναι επίσης γνωστό ότι εμπλέκονται σε επαναπρογραμματισμό ποντικού ή ανθρώπινων σωματικών κυττάρων σε αδιαφοροποίητα, πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα, αυξήθηκαν σημαντικά σε GRPs σε κύτταρα PC9, δείχνοντας αυξήσεις 3,4-φορές, 5,4 φορές σε, και 6,9 φορές, αντίστοιχα, πάνω από γονικά κύτταρα PC9 (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, η έκφραση της CXCR4 και ALDH1A1, φαίνεται επίσης να σχετίζεται με το φαινότυπο CSC, ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω (Σχήμα 2Α). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για HCC827 GRPs (Σχήμα 2Α). Άλλα γνωστά γονίδια των βλαστικών κυττάρων όπως ABCG2, Bmi-1, και CD117 (c-Kit), δεν ρυθμίζεται προς τα πάνω σε GRPs (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

A. Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε με εκκινητές ειδικούς για CD133, Oct4, Sox2, Nanog, CXCR4 και ALDH1A1, τα οποία είναι βλαστική ικανότητα γονίδια σε PC9 ή HCC827 γονικών κυττάρων και GRPs. Β Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε με εκκινητές ειδικούς για IGF1 και IGF1R σε PC9 ή HCC827 γονικών κυττάρων και GRPs. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν προς ακτίνη έκφρασης. * P & lt? 0,01, ** p & lt? 0.001, *** p & lt?. 0.0001

Η

Μια προηγούμενη έκθεση έδειξε επίσης ότι IGF1R ήταν φωσφορυλιωμένη και δραστηριοποιείται στον EGFR-ΤΚΙ-ανεκτική κυττάρων σε κύτταρα PC9 και ότι ένας αναστολέας IGF1R, AEW541, θα μπορούσε να αποτρέψει την εμφάνιση αυτών των ανεκτική κυττάρων [2]. Εξετάσαμε την έκφραση IGF1 και IGF1R χρησιμοποιώντας qPCR στο μοντέλο των κυττάρων μας. έκφραση IGF1 δραματικά ρυθμίζεται αυξητικά σε PC9 GRPs σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα PC9, παρουσιάζοντας αύξηση κατά 49,8-φορές (Σχήμα 2Β). έκφραση IGF1R αυξήθηκε ελαφρά στην GRPs (Εικόνα 2Β). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για GRPs σε HCC827 κύτταρα (Εικόνα 2Β).

Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το μικρό πληθυσμό κυττάρων NSCLC που είχαν υψηλού βαθμού εμπλουτισμού για γονιδιακή έκφραση βλαστική ικανότητα και IGF1 επέζησε και θα μπορούσε να επαναλάβει πολλαπλασιάζονται κάτω επεξεργασία υψηλή συγκέντρωση της gefitinib.

Σφαίρα-ικανότητα σχηματισμού και ογκογονικότητα το GRP είχαν προς τα πάνω ρυθμισμένη και Σφαίρα Σχηματισμός από GRPs Αυξημένη μετά από έκθεση σε συνθήκες υποξίας

για να αξιολογηθεί περαιτέρω η βλαστική ικανότητα το GRP, sphere- σχηματίζοντας δοκιμασίες που αντανακλά τη δραστηριότητα αυτο-ανανέωσης και

in vivo

μελέτες ογκογένεσης πραγματοποιήθηκαν. Η ικανότητα να σχηματίζουν σφαίρες ήταν σημαντικά υψηλότερη σε PC9 GRPs ό, τι σε γονικά κύτταρα (Σχήμα 3Α). Σημαντικά, υποξία αυξηθεί σημαντικά ο αριθμός των σφαιρών PC9 GRPs (Σχήμα 3Α). μέγεθος Σφαίρα του PC9 GRPs υπό συνθήκες υποξίας ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των γονικών κυττάρων (Σχήμα 3Β). αποτελέσματα ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι οι σφαίρες το GRP ήταν θετικά για CD133, Oct4 και φωσφορυλιωμένη IGF1R (Σχήμα 3C). Επιπλέον, με ένεση 1 χ 10 κύτταρα ή 1 × 10

2 κύτταρα των γονικών κυττάρων PC9 και νορμοξικές και υποξικές GRPs σε αμφότερες τις πλευρές των ποντικών NOG και συγκρίθηκε η ογκογόνο δυναμικό

in vivo

. περιστατικά όγκου ορθοξικές και υποξικών GRPs σε ποντίκια ήταν υψηλότερες από εκείνες σε γονικά κύτταρα (Πίνακας 1). Αξίζει να σημειωθεί ότι, νορμοξικές και υποξικές GRPs σχηματίζονται όγκοι στα δύο και πέντε από τα 16 ποντίκια NOG σε 1 × 10 κύτταρα /ένεση, αντίστοιχα, αν και τα γονικά κύτταρα δεν σχηματίζουν όγκους (Πίνακας 1). Η διαφορά στο σχηματισμό όγκων μεταξύ της ομάδας γονικών κυττάρων και ομάδα υποξικές GRPs με την ένεση του 1 × 10 κύτταρα ήταν στατιστικά σημαντική (* ρ = 0,040). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι GRPs εμπλουτισμένα για βλαστική ικανότητα σημειωτές έχουν χαρακτηριστικά γνωρίσματα του φαινοτύπου των βλαστικών κυττάρων και ότι η υποξική μικροπεριβάλλον απορυθμίζεται και διατηρήθηκε ιδιότητες βλαστικών κυττάρων του GRPs, όπως η ικανότητα σχηματισμού σφαίρας και ογκογονικότητα.

PC9 γονικά κύτταρα, GRPs, και υποξικές GRPs παρασκευάστηκαν σε πυκνότητες 2.5 χ 10

3 κύτταρα ανά 2 ml ανά φρεάτιο σε μέσα χωρίς ορό συμπληρωμένο με αυξητικούς παράγοντες και σπάρθηκαν σε 6-φρεατίων εξαιρετικά χαμηλής πλάκες στερεώσεως. γονικά κύτταρα PC9 και GRPs επωάστηκαν υπό συνθήκες ορθοξικές, ενώ GRPs PC9 υποξικές αναπτύχθηκαν υπό συνθήκες υποξίας. Το μέσο καλλιέργειας τροφοδοτήθηκε κάθε 3 ημέρες. Ο αριθμός και το μέγεθος των σφαιρών καταγράφηκαν και ανοσοφθορισμός 7 ημέρες μετά την έναρξη της περιόδου καλλιέργειας. Σφαίρες σταθεροποιήθηκαν και επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα εναντίον CD133, Oct4 ή φωσφορυλιωμένη IGF1R (pIGF1R), και στη συνέχεια με δευτερογενές αντίσωμα επισημασμένο με Alexa Fluor 594 αντι-ποντικού κατσίκας IgG (κόκκινο) ή Alexa Fluor 488 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (πράσινο) . πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε). Εικόνες ελήφθησαν σε ένα σύστημα απεικόνισης Axioplan 2 με λογισμικό AxioVision. A. Ο αριθμός των σφαιρών ήταν σημαντικά αυξημένη σε PC9 GRPs σύγκριση με σε γονικά κύτταρα, και αυξήθηκε περαιτέρω σε GRPs υποξική PC9. * P & lt? 0,01, # p & lt? 0,05. B. Σφαίρα μέγεθος του PC9 υποξικής GRPs ήταν σημαντικά μεγαλύτερη από εκείνη των γονικών κυττάρων. # P & lt? 0,05. Γ ανοσοφθορισμού εικόνες των κυττάρων ελέγχου της PC9 (αριστερά) και σφαίρες το GRP (δεξιά) για CD133, Oct4 και pIGF1R.

Η

Πληθυσμός της CD133- και Oct4-θετικών GRPs αυξήθηκαν κάτω από συνθήκες υποξίας

για να διερευνήσουν το ρόλο της υποξίας στην παραγωγή και την επιμονή του πληθυσμού βλαστικών κυττάρων gefitinib ανθεκτικά, αξιολογήσαμε CD133- και Oct4-θετικών GRPs κάτω ορθοξικές και συνθήκες υποξίας χρήση ανοσοφθορισμού. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α και 4Β, υποξία αύξησε σημαντικά τον πληθυσμό των CD133- και Oct4-θετικών GRPs σε PC9 και HCC827 κύτταρα.

Α, Β PC9 ή HCC827 κύτταρα, που αναπτύσσονται σε πλακίδια θαλάμου Lab-Tek με ή χωρίς 1 ή 2 μΜ gefitinib και υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες για 72 ώρες, σταθερό, και επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα εναντίον CD133 (Α) και Oct4 (Β), και στη συνέχεια με δευτερογενές αντίσωμα επισημασμένο με Alexa Fluor 594 αντι-ποντικού κατσίκας IgG (κόκκινο). πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε). Εικόνες ελήφθησαν σε ένα σύστημα απεικόνισης Axioplan 2 με λογισμικό AxioVision. Εικόνες χρησιμοποιηθεί για να συγκρίνει τα γονικά κύτταρα, GRPs, και υποξικές GRPs αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας τις ίδιες ρυθμίσεις του οργάνου και οι χρόνοι έκθεσης και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με παρόμοιο τρόπο. Οι αριθμοί του CD133 και Oct4-θετικών κυττάρων μετρήθηκαν, και η αναλογία αυτών των κυττάρων υπολογίσθηκε σε πέντε πεδία σε κάθε πείραμα. ** P & lt? 0.001, * ρ & lt? 0,01, # p & lt?. 0.05

Η

IGF1R ενεργοποιήθηκε στις GRPs υπό συνθήκες υποξίας, και εξόντωση IGF1 Μειώθηκε ο πληθυσμός της CD133- και Oct4-θετικών GRPs Υποξική

για να διερευνηθεί η επίδραση της υποξίας στην ενεργοποίηση των IGF1R, εξετάσαμε την έκφραση του γονιδίου του IGF1 σε GRPs από qPCR καθώς επίσης και την φωσφορυλίωση του IGF1R επί GRPs χρησιμοποιώντας ανοσοφθορισμό υπό νορμοξικές και υποξικές συνθήκες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, η έκφραση IGF1 mRNA ήταν πολύ υψηλότερη σε PC9 GRPs ό, τι σε γονικά κύτταρα PC9 και ρυθμίζεται αυξητικά με έκθεση σε συνθήκες υποξίας. Σημαντικά, φωσφορυλιωμένη IGF1R εκφράστηκε επί PC9 GRPs, και η έκθεση σε υποξία ρυθμίζεται αυξητικά σημαντικά τον πληθυσμό των φωσφορυλιωμένων IGF1R εκφράζουν GRPs PC9 (Σχήμα 5Β).

A. Ποσοτική RT-PCR πραγματοποιήθηκε με εκκινητές ειδικούς για IGF1 σε PC9 ή HCC827 γονικά κύτταρα, GRPs, και υποξικές GRPs. Τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν προς ακτίνη έκφρασης. ** P & lt? 0.001. Β κύτταρα PC9, αναπτύχθηκαν σε πλακίδια θαλάμου Lab-Tek με ή χωρίς 1 μΜ gefitinib και υπό ορθοξικές ή υποξικές συνθήκες για 72 ώρες, σταθερό, και επωάστηκαν με τα πρωτογενή αντισώματα έναντι φωσφορυλιωμένης IGF1R (pIGF1R) και, στη συνέχεια, με δευτερογενή αντισώματα σημασμένα με Alexa Fluor IgG αντι-κουνελιού 488 αιγών (πράσινο). πυρήνες κυττάρων χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ (μπλε). Εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα Axioplan 2 απεικόνισης σύστημα με λογισμικό AxioVision. Εικόνες που χρησιμοποιούνται για να συγκρίνετε PC9 γονικών κυττάρων, GRPs και υποξικές GRPs αποκτήθηκαν με τις ίδιες ρυθμίσεις του οργάνου και χρόνους έκθεσης, και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με παρόμοιο τρόπο. Ο αριθμός των pIGF1R-θετικών κυττάρων μετρήθηκε, και η αναλογία αυτών των κυττάρων υπολογίσθηκε σε πέντε πεδία σε κάθε πείραμα. ** P & lt? 0.001. έκφραση Γ IGF1 χτυπήθηκε κάτω στο PC9 ή HCC827 υποξικό GRPs χρησιμοποιώντας μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) σε πλάκες θαλάμου Lab-Tek. χρώση ανοσοφθορισμού για pIGF1R, CD133, ή Oct4 Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκε. Χρησιμοποιήθηκαν δύο συγκεκριμένες siRNAs και ένα μη ειδικό έλεγχο. Οι αριθμοί των pIGF1R-, CD133- και Oct4-θετικών κυττάρων μετρήθηκαν, και η αναλογία αυτών των κυττάρων υπολογίσθηκε σε πέντε πεδία για κάθε πείραμα. ** P & lt? 0.001, * ρ & lt?. 0.01

Η

Για να διευκρινιστεί η βιολογική σημασία της IGF1 στην αντίσταση gefitinib στην υποξική μοντέλο των κυττάρων μας, γκρέμισε έκφραση IGF1 στην υποξική GRPs της PC9 και HCC827 κύτταρα χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικές ειδικές siRNAs (# 1 και # 2? Σχήμα S3 στα Πληροφοριακά S1). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C, ο knockdown του IGF1 μείωσε σημαντικά φωσφορυλιωμένο GRPs IGF1R εκφράζουν, και μειωμένη CD133- και Oct4-θετικών GRPs υπό συνθήκες υποξίας. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι IGF1 παίζει ένα ρόλο στην ενεργοποίηση των IGF1R και τη διατήρηση του gefitinib ανθεκτικά ΚΕΠ.

Η υποξία ρυθμίζει την έκφραση IGF1 μέσω HIF1α, και η αναστολή της HIF1α ή IGF1R Μειώθηκε CD133- και Oct4-θετικών GRPs Κάτω από υποξία

για να διερευνηθούν περαιτέρω οι επιδράσεις της υποξίας στην ρύθμιση προς τα άνω του IGF1 και την ενεργοποίηση των IGF1R, εμείς μειωτικά παράγοντας 1α (HIF1α) έκφραση προκαλείται από υποξαιμία σε υποξικά GRPs χρησιμοποιώντας το ειδικό αναστολέα HIF1α YC-1. Η θεραπεία με YC-1 ανέστειλαν την έκφραση HIF1α σημαντικά τόσο PC9 και HCC827 κύτταρα κάτω από τον υποξία σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα S4 στα Πληροφοριακά S1). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6Α, η αναστολή της HIF1α με YC-1 θεραπεία κατέστειλε επίσης την έκφραση IGF1 σε υποξικά GRPs, και μείωσε σημαντικά την φωσφορυλίωση IGF1R επί GRPs κάτω από την υποξία. Επιπλέον, YC-1 θεραπεία μείωσε σημαντικά τον πληθυσμό των CD133- και Oct4- θετική υποξικές GRPs. Τέλος, η θεραπεία με τον αναστολέα IGF1R AEW541 μείωσε σημαντικά τον πληθυσμό των CD133- και Oct4-θετικών GRPs με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο μετά από έκθεση gefitinib υπό υποξικές συνθήκες (Σχήμα 6Β). Επιπλέον, ο αριθμός των αποικιών που αποτελούνται από GRPs κατεστάλη σημαντικά από AEW541 υπό συνθήκες υποξίας (Σχήμα 6C). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά υποδεικνύουν έντονα ότι η υποξία ρυθμίζει την έκφραση IGF1 μέσω HIF1α, και ότι υπερεκφράζεται IGF1 επάγει την ενεργοποίηση της IGF1R και αυξάνει τις gefitinib ανθεκτικά ΚΕΠ στο

EGFR

της μετάλλαξης θετικά NSCLC κύτταρα κάτω από την υποξία.

Α. έκφραση HIF1α κατεστάλη σε PC9 ή HCC827 υποξικό GRPs από κατεργασία με 50 μΜ, 100 μΜ και 200 ​​μΜ YC-1 σε διαφάνειες θαλάμου Lab-Tek. χρώση ανοσοφθορισμού για IGF1, φωσφορυλιωμένη IGF1R (pIGF1R), CD133, και Oct4 Εν συνεχεία πραγματοποιήθηκε. Εικόνα S1. Εικόνα S2. Εικόνα S3.