Abstract

Ο καρκίνος σκοτώνει αποτελεσματικότητα του προτύπου χημειοθεραπευτικούς παράγοντες όπως σισπλατίνη (CDDP) περιορίζεται από τις παρενέργειές τους στους φυσιολογικούς ιστούς. Ως εκ τούτου, οι ερευνητικές προσπάθειες βελτιστοποίηση της ασφάλειας και της αποτελεσματικότητας των εν λόγω παραγόντων είναι κλινικά σημαντική. Κάναμε οθόνη για παράγοντες που προστατεύουν συγκεκριμένα φυσιολογικά ανθρώπινα μεσοθηλιακά κύτταρα έναντι CDDP χωρίς να μειώνεται το καρκινικό κύτταρο σκοτώνει αποτελεσματικότητα. Η λοβαστατίνη ταυτοποιήθηκε από την οθόνη. Λοβαστατίνη σε φαρμακολογικώς σχετικές συγκέντρωση συλληφθεί έντονα τον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών κυττάρων, ενώ τα καρκινικά κύτταρα επηρεάστηκαν λιγότερο. CDDP επαγόμενη απόκριση βλάβης DNA δεν ενεργοποιήθηκε και τα φυσιολογικά κύτταρα έδειξαν αυξημένη ανοχή σε CDDP όταν φυσιολογικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον συνδυασμό του CDDP και λοβαστατίνη. Έχουμε αποδείξει ότι η παρεμβολή πρωτεΐνη γερανυλγερανυλίωση εμπλέκεται στη λοβαστατίνη μεσολάβηση CDDP προστατευτική επίδραση σε φυσιολογικά κύτταρα. Σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα, σε καρκινικά κύτταρα λοβαστατίνη δεν μετέβαλε την CDDP επαγόμενη απόκριση, και τα καρκινικά κύτταρα δεν προστατεύονταν από λοβαστατίνη. Επιπλέον, η λοβαστατίνη στην φαρμακολογική σχετική συγκέντρωση

per se

προκαλούμενη βλάβη του DNA, το οξειδωτικό στρες και αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε φυσιολογικά μεσοθηλιακών κυττάρων. Ως εκ τούτου, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η λοβαστατίνη έχει τη δυνατότητα να βελτιώσει τον θεραπευτικό δείκτη της θεραπείας σισπλατίνη βασίζεται

Παράθεση:. Shi Υ, Felley-Bosco Ε, Marti TM, Stahel RA (2012) Διαφορικές Επιδράσεις της Lovastatin για σισπλατίνη απαντήσεις σε κανονικό ανθρώπινο Mesothelial κύτταρα σε σχέση με τα κύτταρα του καρκίνου: επιπτώσεις για την θεραπεία. PLoS ONE 7 (9): e45354. doi: 10.1371 /journal.pone.0045354

Επιμέλεια: Αμπντελιλάχ Aboussekhra, βασιλιά Faisal Specialist Νοσοκομείο & amp? Κέντρο Ερευνών, η Σαουδική Αραβία

Ελήφθη: May 14, 2012? Αποδεκτές: 20, Αυγ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Σεπ, 2012

Copyright: © Shi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Stiftung für Angewande Krebs Forschung (3.41718.14), Winkelwiese 6, 8001 Ζυρίχη. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Cisplatin (CDDP) είναι ένα πρότυπο χημειοθεραπευτικό παράγοντα για τη θεραπεία διαφόρων συμπαγών όγκων. Ωστόσο, οι παρενέργειες στους φυσιολογικούς ιστούς οδηγήσει σε περιορισμένη ανοχή σε ασθενείς [1]. Έτσι, θεραπευτικές στρατηγικές παρακάμπτοντας τις τοξικές παρενέργειες του CDDP θα είναι ευπρόσδεκτη και θα μπορούσε να βελτιώσει το θεραπευτικό αποτέλεσμα.

Απώλεια ή αποδυναμωθεί σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου είναι από τα πιο καθολική μεταβολές στα καρκινικά κύτταρα, με αποτέλεσμα τη μειωμένη ευαισθησία σε proliferation- ανασταλτική σηματοδότηση που κανονικά ξεκινήσει μια ποικιλία των απαντήσεων, συμπεριλαμβανομένων σύλληψης πολλαπλασιασμό, την ενεργοποίηση των μηχανισμών αυτοπροστασίας ενάντια τονίζει, διαφοροποίηση, ή κυτταρικό θάνατο [2]. Υπό ορισμένες συνθήκες πολλαπλασιασμού-περιοριστική, φυσιολογικά κύτταρα συλλαμβάνουν την αντιγραφή τους και με τον τρόπο αυτό μπορεί να προστατεύεται από την τοξικότητα των παραγόντων πολλαπλασιασμού που εξαρτώνται από, π.χ. οι παράγοντες προκαλούν βλάβη στο DNA. Ωστόσο, τα καρκινικά κύτταρα, λόγω της μειωμένης ευαισθησίας τους σε πολλαπλασιασμό ανασταλτική σηματοδότηση, δεν μπορεί να συλλάβει σωστά κυτταρικό κύκλο τους και ως εκ τούτου επιλεκτικά θανατώνονται υπό αυτές τις συνθήκες [3] – [6].

Ο στόχος μας ήταν να βρούμε παράγοντες η οποία θα μπορούσε να προστατεύσει τα φυσιολογικά κύτταρα από σισπλατίνη κυτταροτοξικότητα και συγχρόνως επιτρέπουν τη θανάτωση καρκινικών κυττάρων. Ως εκ τούτου, έχουμε δημιουργήσει μια οθόνη σε δύο στάδια: πρώτον, έχουμε προβληθεί μια σειρά ενώσεων για διαφορετικές επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών mesothelial

έναντι

κύτταρα μεσοθηλιώματος? δεύτερο, συνδυασμένες δράσεις του CDDP με αυτούς παράγοντες διαφοροποίησης δοκιμάστηκαν σε φυσιολογικά κύτταρα για την αναγνώριση παραγόντων που κάνουν τα φυσιολογικά κύτταρα ανθεκτικά σε CDDP κυτταροτοξικότητα, ενώ επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα σκοτώνουν.

Η λοβαστατίνη αναγνωρίστηκε από την οθόνη μας. Ως φάρμακο μείωσης της χοληστερόλης, λοβαστατίνη δρα αναστέλλοντας την HMG-CoA αναγωγάσης, το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο της οδού βιοσύνθεσης της χοληστερόλης [7]. Ο αποκλεισμός του μονοπατιού της σύνθεσης της χοληστερόλης επίσης έχει σαν αποτέλεσμα την εξάντληση του ισοπρενοειδή τμημάτων παρεμβαίνοντας έτσι ισοπρενυλίωσης πρωτείνης, η οποία είναι ένα κρίσιμο ρυθμιστικό στάδιο σε πολλές βιολογικές διαδικασίες [7]. Ως εκ τούτου, πέρα ​​από την λειτουργία μείωσης της χοληστερόλης, λοβαστατίνη εκτελεί επίσης πλειοτροπικές βιολογικές ρόλους στον έλεγχο του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, την απόπτωση, την επιβίωση, τη διαφοροποίηση, τη μετανάστευση και την εμπορία κυτταρικών κυστιδίων [7] – [9]. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η λοβαστατίνη έχει μια δυνατότητα να αυξήσει το θεραπευτικό δείκτη του CDDP.

Το πειραματικό πρωτόκολλο για τη διερεύνηση των παραγόντων προστασία των φυσιολογικών κυττάρων έναντι CDDP κυτταροτοξικότητα φαίνεται στο (Α). προφίλ κυτταρικού κύκλου των φυσιολογικών SDM104 (Β) και (Γ), και ZL55 καρκινικά κύτταρα (D) και (Ε) του ελέγχου χωρίς αγωγή (Β) και (Δ), ή 24 ώρες επεξεργασίας με 2 μΜ λοβαστατίνη (C) και ( Ε) εμφανίζονται (n = 3). Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 μΜ BrdU για μια ώρα πριν από τη συγκομιδή για την ανάλυση FACS.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

καλλιέργειες κυττάρων και αντιδραστήρια

Κανονική ανθρώπινα μεσοθηλιακά πρωτογενή κύτταρα και καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε Μ199 (Invitrogen) /MCDB105 (Sigma) (1:01) μεικτό μέσο συμπληρωμένο με 15% FCS, 10 ng /ml EGF, και 0,4 μg /ml υδροκορτιζόνη, όπως περιγράφεται [10]. Το μεσοθηλίωμα ανθρώπινη κυτταρική σειρά ZL55 [11] και η πρωταρχική φυσιολογική κυτταρική καλλιέργεια SDM104 [12] δημιουργήθηκαν στο εργαστήριο μας. Η κυτταρική σειρά καρκίνου του μαστού MCF-7 [13] και το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 κυτταρική γραμμή [14] αγοράστηκαν από την American Type Culture Corporation (Manassas, VA). Η κύρια φυσιολογική κυτταρική καλλιέργεια LP9 [15] ήταν από το εργαστήριο του Δρ Τζέιμς Rheinwald του. Η κύρια φυσιολογική κυτταρική καλλιέργεια SDM85 ιδρύθηκε από μια κανονική υπεζωκότα ιστό που λαμβάνεται από ένα καρκίνο που υποβάλλονται σε ασθενή άσχετες θωρακική χειρουργική επέμβαση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την ηθική επιτροπή της Ζυρίχης Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από τον ασθενή. Όλες οι κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη επικυρώνονται από τη λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων (Microsynth, Μπάλγκατς, Ελβετία). Λοβαστατίνη (Alexis Biochemicals) μετατράπηκε σε μορφή ενεργό οξύ όπως περιγράφεται [16] και χρησιμοποιήθηκε σε μία συγκέντρωση 2 μΜ στα περισσότερα πειράματα. Cisplatin (0,5 mg /ml αλατούχου διαλύματος) αγοράστηκε από Ebewe Pharma? mevalonate, GGPP και FTI-277 από το Sigma? GGTI-298 από την Calbiochem. Anti-ATM-Ser1981 (Epitomics), αντι-ATM (2C1) (Gene Tex), αντι-γ-H2AX (Ser139) (Millipore), αντι-LC3B (Abcam), αντι-φωσφο-p53 (Ser15) (κυτταρική σηματοδότηση Technology), αντι-ρ53, αντι-β-ακτίνης, αντι-οξυγονάσης αίμης 1 (ΗΟ 1), αντι-ρ21, αντι-η-Ras, αντι-Rap1a και αντι-βινκουλίνης (Santa Cruz) χρησιμοποιήθηκαν ανάλογα με το προϊόν οδηγίες. Για την ανίχνευση κηλίδος western των ΑΤΜ, εκχυλίσματα πρωτεϊνών έτρεξαν σε 5% SDS-πολυακρυλαμιδίου ενώ για χρησιμοποιήθηκε το υπόλοιπο 13,5% SDS-πολυακρυλαμιδίου.

Η

Αποτελέσματα δοκιμασιών ΜΤΤ με πρωτίστως καλλιεργημένα φυσιολογικά κύτταρα ( SDM104, SDM85 και LP9) και καρκινικά κύτταρα (ZL55, Α549 και MCF-7) μετά από θεραπείες με CDDP μόνο, λοβαστατίνη (2 μΜ) μόνο, ή και τα δύο μαζί φαίνονται στο (Α) (η = 6? * P & lt? 3.0 × 10

-5). Στο (Β), οι προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν μετά κύτταρα SDM104 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις της λοβαστατίνης και μόνο, ή λοβαστατίνη μαζί με 20 μΜ CDDP (n = 6? * P & lt? 0,002? ** P & lt? 3,0 × 10

-5)? L0.5, L1, L2 και L4 σταθεί για 0,5 μΜ, 1 μΜ, 2 μΜ και 4μΜ λοβαστατίνη, αντίστοιχα? και Γ για CDDP. Στο (C), οι προσδιορισμοί ΜΤΤ διεξήχθησαν μετά κύτταρα SDM104 υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2 μΜ λοβαστατίνη μόνο, CDDP διαφορετικών συγκεντρώσεων μόνο, ή και τα δύο μαζί (n = 6? * P & lt? 0,02? ** P & lt? 1,0 × 10

-5)? C5, C10, C20 και να σταθεί για 5 μΜ, 10 μΜ και 20 μΜ CDDP, αντίστοιχα.

Η

Ένα σχέδιο για την βιοσυνθετική οδό της χοληστερόλης φαίνεται στο (Α). Στο (Β) και (Γ), 20 μΜ CDDP προστέθηκαν μετά από 8 ώρες προ-επώαση με 2 μΜ λοβαστατίνη παρουσία ή απουσία 200 μΜ μεβαλονικό (Β) ή 100 μΜ Q10 (C), τότε τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για μια άλλη 16 ώρες παρουσία του CDDP και οι άλλοι παράγοντες μαζί (n = 6? * P & lt? 7,0 × 10

-7). προσδιορισμοί ΜΤΤ Διεξήχθησαν μετά τις θεραπείες τελείωσε και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ξανά σε φρέσκο ​​μέσο για 24 ώρες. Στο (Β) και (Γ), «L» σημαίνει λοβαστατίνη, «Μ» για μεβαλονικού.

Η

κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού κύκλου Ανάλυση

δοκιμασία πολλαπλασιασμού ΜΤΤ κυττάρου διεξήχθη ως περιγράφεται [17]. Για την ένωση οθόνη, η ανάλυση της κατανομής κύκλου κυττάρου έγινε ως εξής: τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από αγωγή 24 ωρών με διαφορετικούς παράγοντες, πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Μετά ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) χρώση (Sigma), την ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FACS) πραγματοποιήθηκε με FACSCalibur (FACScan, BD Biosciences) και τα δεδομένα αναλύθηκαν με ModFit LT 3.2.1 λογισμικού. Για τη λεπτομερή ανάλυση FACS κυττάρων λοβαστατίνης-αγωγή, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 10 μΜ BrdU επί μία ώρα πριν από τη συγκομιδή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες λοβαστατίνη-αγωγή και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη. Μετά αντι-BrdU αντίσωμα (BD Biosciences) /Δευτερεύουσα Alexa488-συζευγμένο κατσίκας-αντι-ποντικού (Invitrogen) και χρώση ΡΙ, ανάλυση FACS διεξήχθη με FACSCalibur και τα δεδομένα αναλύθηκαν με λογισμικό V4.3 Summit. Η στατιστική σημαντικότητα πραγματοποιήθηκε με δύο-tailed t-test.

Τα αποτελέσματα του στυπώματος Western με αντίσωμα αντι-Η-Ras (Α) και αντίσωμα αντι-Rap1a (C) δείχνονται. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης έγιναν αμέσως μετά φυσιολογικά κύτταρα SDM104 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές ενώσεις για 16 ώρες. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης για τη Δυτική. Στο (Β), 20 μΜ CDDP προστέθηκαν μετά από 8 ώρες προ-επώαση με 10 μΜ GGTI-298 (GGTI) ή 10 μΜ FTI-277 (FTI), και στη συνέχεια τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 16 ώρες παρουσία του CDDP και οι αναστολείς μαζί (n = 6? * για την P & lt? 3,0 × 10

-4? ** P & lt? 2,0 × 10

-6). Στο (D), 20 μΜ CDDP προστέθηκαν μετά από 8 ώρες προ-επώαση με 2 μΜ λοβαστατίνη παρουσία ή απουσία 10 μΜ GGPP, και στη συνέχεια τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 16 ώρες παρουσία του CDDP και ενώσεων μαζί (n = 6? ** P & lt? 2,0 × 10

-6). Στο (Β) και (Δ), οι προσδιορισμοί ΜΤΤ πραγματοποιήθηκαν μετά τις θεραπείες τελείωσε και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν ξανά σε φρέσκο ​​μέσο για 24 ώρες. «L» σημαίνει λοβαστατίνη.

Η

ανάλυση Western blot των συστατικών σε απόκριση βλάβη του DNA στα φυσιολογικά κύτταρα SDM104 (Α) και καρκινικά κύτταρα (Β) μετά τη θεραπεία με CDDP σε παρουσία ή απουσία της λοβαστατίνης δειχνονται. Βινκουλίνης και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. Για τη θεραπεία CDDP, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία 8 μΜ CDDP για 16 ώρες? για λοβαστατίνη, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε παρουσία 2 μΜ λοβαστατίνη για 24 ώρες? για το συνδυασμό της CDDP και λοβαστατίνη, 8 μΜ CDDP προστέθηκαν 8 ώρες μετά 2μΜ λοβαστατίνη προ-επώαση, τότε τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 16 ώρες παρουσία του CDDP και λοβαστατίνης μαζί.

Η

Αποτελέσματα

Η λοβαστατίνη διαφορικά επηρεάζουν κυτταρικού πολλαπλασιασμού των Normal

έναντι

καρκινικά κύτταρα και Ειδικά Προστατευόμενες φυσιολογικά κύτταρα από CDDP κυτταροτοξικότητα

in vitro

Η

Η οθόνη για τους παράγοντες που θα μπορούσε να προστατεύσει τα φυσιολογικά κύτταρα από σισπλατίνη επαγόμενη κυτταροτοξικότητα εκτελέστηκε σε δύο στάδια. Στο πρώτο στάδιο, μελετήθηκε η λογοτεχνία και επιλεγέντα υποψήφιο μέσα από την οποία βρήκαμε ενδείξεις που θα μπορούσαν να επηρεάσουν διαφορετικά πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών

έναντι

καρκινικά κύτταρα. προφίλ κυτταρικού κύκλου των φυσιολογικών κυττάρων του ανθρώπου μεσοθηλιακών SDM104 και ανθρώπινα κύτταρα μεσοθηλιώματος ZL55 αναλύθηκαν 24 ώρες μετά την έκθεση σε εμπορικά διαθέσιμα μέσα που είναι γνωστό ότι παρεμβαίνουν με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό. Μερικοί από τους παράγοντες που δείχνουν διαφορετικές επιδράσεις στην κατανομή του κυτταρικού κύκλου σε φυσιολογικούς

έναντι

τα καρκινικά κύτταρα απαριθμούνται (Πίνακας 1). Στο δεύτερο βήμα, ελέγξαμε ποια από τις επιλεγμένες παραγόντων προστατεύεται κανονικά κύτταρα από CDDP (Σχήμα 1Α). Η λοβαστατίνη, ένα FDA εγκεκριμένο φάρμακο μείωσης της χοληστερόλης, ταυτοποιήθηκε στο δεύτερο στάδιο.

ανάλυση Western blot του δείκτη autophagy LC3B-ΙΙ και το οξειδωτικό στρες δείκτη ΗΟ-1 σε φυσιολογικά κύτταρα (SDM104) (Α) και τα καρκίνου (ZL55) κύτταρα (Β) μετά τη θεραπεία με CDDP σε παρουσία ή απουσία της λοβαστατίνης δείχνεται. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος φόρτωσης. Για τη θεραπεία CDDP, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία 8 μΜ CDDP για 16 ώρες? για λοβαστατίνη, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία 2μΜ λοβαστατίνη για 24 ώρες? για το συνδυασμό της CDDP και λοβαστατίνη, 8 μΜ CDDP προστέθηκαν 8 ώρες μετά 2μΜ λοβαστατίνη προ-επώαση, τότε τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 16 ώρες παρουσία του CDDP και λοβαστατίνης μαζί.

Η

Lovastatin κατά τη φαρμακολογική σχετική συγκέντρωση [18] 2 μΜ σε φυσιολογικά κύτταρα μειώνονται περισσότερο από το 98% των κυττάρων φάσης S και περίπου το 14% της G2 /Μ κυττάρων ενώ υπήρχε περίπου 47,8% αυξήσεις των κυττάρων G0 /G1 (Εικόνα 1C ), σε σύγκριση με μη επεξεργασμένο έλεγχο (Εικόνα 1Β). Σε αντίθεση, σε καρκινικά κύτταρα υπήρχαν ακόμη περίπου το 20% των S-φάσης κύτταρα που παραμένουν και τα δύο G0 /κυττάρων G1 και G2 κύτταρα /M αυξήθηκαν 58% και 77,7%, αντίστοιχα (Σχήμα 1 Ε) μετά από λοβαστατίνη-θεραπεία, σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχου (Σχήμα 1 D). Έτσι, λοβαστατίνη έδειξε διαφορετικές επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού των φυσιολογικών κυττάρων

έναντι

καρκινικά κύτταρα. Συνεπής με τις αλλαγές που παρατηρούνται σε κυτταρικό κύκλο, η θεραπεία με λοβαστατίνη μόνο, κατέστειλε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κανονικών (Ρ & lt? 1,0 × 10

-6), και ZL55 καρκίνου (Ρ & lt? 0.001)? Κύτταρα και MCF-7 (0.001 Ρ & lt) , σε σύγκριση με χωρίς θεραπεία ελέγχους (Σχήμα 2Α).

Ο αριθμός των φυσιολογικών κυττάρων SDM104 μετά τη συνδυασμένη αγωγή της CDDP και λοβαστατίνης ήταν 3,8 φορές υψηλότερη σε σύγκριση με τον αριθμό των κυττάρων που παρατηρείται μετά από αγωγή με CDDP μόνο του. Αυτή η προστατευτική δράση έναντι της τοξικότητας από την CDDP παρατηρήθηκε επίσης σε δυο επιπλέον κανονικές πρωτογενείς καλλιέργειες SDM85 και LP9 (Σχήμα 2Α). Η λοβαστατίνη μεσολάβηση προστατευτική επίδραση φάνηκε ειδικό για τα φυσιολογικά κύτταρα, δεδομένου ότι καμία από τις εξετασθείσες κυτταρικές σειρές καρκίνου, τα ανθρώπινα μεσοθηλίωμα ZL55, ανθρώπινου καρκίνου του μαστού MCF-7 και τα ανθρώπινα Α549 αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα, προστατεύτηκε (Σχήμα 2Α).

Μία απόκριση δόσης λοβαστατίνης για προστατευτική επίδραση έναντι CDDP κυτταροτοξικότητα εκτελέστηκε με κύτταρα SDM104. δοσοεξαρτώμενο Lovastatin μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων, ωστόσο, η μέγιστη προστατευτική επίδραση παρατηρήθηκε ήδη στα 2 μΜ (Σχήμα 2Β). Έτσι, 2 μΜ συγκέντρωση λοβαστατίνη χρησιμοποιήθηκε στα περισσότερα πειράματα μας. Επειδή η λοβαστατίνη μεσολάβηση προστασία των φυσιολογικών κυττάρων συνδέθηκε σε κυτταρικό κύκλο σύλληψης, CDDP-προστατευτικά αποτελέσματα ήταν ορατή μόνο σε υψηλή συγκέντρωση CDDP (10-20 μΜ), όπου η μείωση στον αριθμό κυττάρων οφείλεται σε κυτταροτοξικότητα ήταν υψηλότερη από ό, τι η μείωση του αριθμού των κυττάρων λοβαστατίνη προκαλούμενη λόγω με πολλαπλασιασμό σύλληψη (Σχήμα 2C).

ο αποκλεισμός της χοληστερόλης βιοσυνθετικής δρόμος αλλά δεν Ubiquinone Σύνθεση απαιτείται για την λοβαστατίνη μεσολάβηση προστασία των φυσιολογικών κυττάρων από Cisplatin Τοξικότητα

Ως παράγοντας μια μείωση των λιπιδίων, λοβαστατίνη πράξεις για την αναστολή της HMG-CoA αναγωγάσης, το περιοριστικό του ρυθμού ένζυμο της βιοσυνθετικής οδού της χοληστερόλης [7] (Σχήμα 3Α). Εξετάσαμε αν αναστέλλοντας τη βιοσυνθετική οδό της χοληστερόλης είναι απαραίτητη για τη λοβαστατίνη μεσολάβηση προστασία των φυσιολογικών κυττάρων έναντι CDDP με εξέταση των επιπτώσεων της μεβαλονικό οξύ, το οποίο είναι η άμεση προϊόν της HMG-CoA αντίδραση αναγωγάσης που καταλύεται στην βιοσυνθετική οδό της χοληστερόλης [7] ( Σχήμα 3Α). Η προσθήκη του μεβαλονικού αντιστραφεί εντελώς τα ανασταλτικά αποτελέσματα της λοβαστατίνης επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Η λοβαστατίνη δεν προστατεύει κανονικά κύτταρα έναντι CDDP παρουσία μεβαλονικού (Σχήμα 3Β), δεικνύοντας ότι η λοβαστατίνη προστατεύει κανονικά κύτταρα αναστέλλοντας τη βιοσυνθετική οδό της χοληστερόλης. Η προσθήκη του ουβικινόνης (συνενζύμου Q10) σε φυσιολογικά κύτταρα δεν άλλαξε ούτε το ανασταλτικό αποτέλεσμα της λοβαστατίνης επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού ή της προστασίας από CDDP (Σχήμα 3C) υποδεικνύει την παρεμβολή με τη σύνθεση ουβικινόνη δεν εμπλέκεται στην παρατηρούμενη προστασία των φυσιολογικών κυττάρων.

η προστασία των φυσιολογικών κυττάρων από Cisplatin Τοξικότητα επιτυγχάνεται με τη μεσολάβηση λοβαστατίνη-Induced παρέμβαση της πρωτεΐνης γερανυλογερανυλίωση

η λοβαστατίνη παρεμβαίνει με πρωτεΐνη ισοπρενυλιώσεως (συμπεριλαμβανομένων φαρνεζυλίωση και γερανυλογερανυλίωση) μέσω καταστρέφουν το ισοπρενοειδές δωρητές πυροφωσφορικού φαρνεσυλίου (FPP) και γερανυλογερανυλο πυροφωσφορικό (GGPP) [7] (Σχήμα 3Α, και 4Α και 4C). αναστολέα φαρνεσυλτρανσφεράσης (FTI-277) αναστέλλει ειδικά την φαρνεσυλίωση των μικρών πρωτεϊνών G, π.χ., η φαρνεζυλίωση του H-Ras (Σχήμα 4Α), αλλά όχι πρωτεΐνη γερανυλγερανυλίωση, π.χ., η γερανυλγερανυλίωση των Rap1a σε φυσιολογικά κύτταρα SDM104 (Σχήμα 4C). FTI-277 έδειξε πολύ ασθενέστερη πολλαπλασιασμό ανασταλτική επίδραση σε φυσιολογικά κύτταρα (Σχήμα 4Β) από ό, τι η λοβαστατίνη (Σχήμα 3Β) και CDDP-προστατευτική επίδραση της στα φυσιολογικά κύτταρα (Σχήμα 4Β) ήταν επίσης πιο αδύναμη από λοβαστατίνη (Σχήμα 3Β). Ωστόσο, η ειδική αναστολή των γερανυλγερανυλίωση από γερανυλγερανυλτρανσφεράσης-Ι αναστολέα (GGTI-298) (Σχήμα 4C), η οποία δεν επηρέασε φαρνεσυλίωσης (Σχήμα 4Α), παρεμποδίζει ισχυρά τον πολλαπλασιασμό των φυσιολογικών κυττάρων και τους προστάτευε από τη σισπλατίνη τοξικότητα (Σχήμα 4Β) παρόμοια με λοβαστατίνη (Σχήμα 3Β). Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, τις κυτταρικές πολλαπλασιασμός-ανασταλτικές επιδράσεις και την CDDP προστατευτική επίδραση της λοβαστατίνης για κανονικά κύτταρα δραματικά καταστέλλονται με την προσθήκη GGPP (Εικόνα 4D), που ανέτρεψε την λοβαστατίνη μεσολάβηση αναστολή της γερανυλγερανυλίωση (Σχήμα 4C), αλλά όχι φαρνεζυλίωση (Σχήμα 4Α). Έτσι, τα δεδομένα μας αποδεικνύουν ότι η λοβαστατίνη μεσολάβηση προστασία των φυσιολογικών κυττάρων από την τοξικότητα CDDP οφείλεται κυρίως στην GGPP εξάντληση επαγόμενη αναστολή της γερανυλγερανυλίωση.

Lovastatin Αποτρέπει την ενεργοποίηση της προκαλούμενης από CDDP Responses Βλάβη DNA στα φυσιολογικά κύτταρα, αλλά προκαλεί απαντήσεις Βλάβη DNA στα καρκινικά κύτταρα

για να διερευνήσουν περαιτέρω το μηχανισμό της λοβαστατίνη μεσολάβηση διαφορικό επιπτώσεις στην κανονική

έναντι

καρκινικά κύτταρα, οι απαντήσεις της κανονικής

έναντι

καρκινικά κύτταρα εξετάστηκαν με περισσότερες λεπτομέρειες. Όπως ήταν αναμενόμενο, CDDP ενεργοποιήσει τις αποκρίσεις βλάβη του DNA [19] – [22] σε φυσιολογικά κύτταρα: την φωσφορυλίωση του ΑΤΜ, την επακόλουθη συσσώρευση της βλάβης του DNA φωσφο δείκτη ιστόνης Η2ΑΧ σε Σερίνη 139 (γ-Η2ΑΧ), η φωσφορυλίωση και συσσώρευση ρ53, και η συσσώρευση του κυτταρικού κύκλου αναστολέα ρ21 (Σχήμα 5Α). Ωστόσο, εκτός από την ρ21 αυξορρύθμιση, απόκριση βλάβης DNA δεν ανιχνεύθηκε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με λοβαστατίνη 8 ώρες πριν και κατά τη διάρκεια της θεραπείας CDDP (Σχήμα 5Α), υποδεικνύοντας ότι η λοβαστατίνη, με τη σύλληψη της κυτταρικής ανάπτυξης, κατέστειλε την απόκριση βλάβης DNA και να προστατεύονται τα φυσιολογικά κύτταρα από CDDP επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Λοβαστατίνη επαγόμενη ανοδική ρύθμιση του p21 ήταν πιθανό μέσω μιας ρ53-ανεξάρτητη μονοπάτι επειδή καμία ανιχνεύσιμη ενεργοποίηση της ρ53 παρατηρήθηκε σε φυσιολογικά κύτταρα κατεργασμένα με λοβαστατίνη μόνο (Σχήμα 5Α).

Στα καρκινικά κύτταρα, σε αντίθεση με την κανονική κύτταρα, το CDDP επαγόμενη απόκριση βλάβης του DNA περιλαμβανομένης της ενεργοποίησης του ΑΤΜ, η συσσώρευση του γ-Η2ΑΧ και ρ53 δεν άλλαξαν στη συνδυασμένη θεραπεία με λοβαστατίνη (Σχήμα 5Β). Είναι σημαντικό ότι, ενώ η λοβαστατίνη μόνη δεν επάγει περαιτέρω απόκριση εκτός p21 αυξητική ρύθμιση σε φυσιολογικά κύτταρα (Σχήμα 5Α), είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση των επιπέδων της Ρ-ATM, ρ53 και γ-Η2ΑΧ σε καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 5Β) υποδεικνύοντας ότι η λοβαστατίνη κατά την φαρμακολογική σχετική συγκέντρωση 2 μΜ

per se

προκαλεί βλάβη στο DNA των καρκινικών κυττάρων.

Η λοβαστατίνη προκαλεί Autophagy και το οξειδωτικό στρες στον καρκίνο, αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα

Σύμφωνα με άλλες μελέτες lovastatin- εκθέσεων επαγόμενη autophagy [23] – [25], παρατηρήσαμε ότι η λοβαστατίνη προκάλεσε την προς τα άνω ρύθμιση του δείκτη autophagy LC3B-II [26] σε καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 6Β). Ωστόσο, LC3B-ΙΙ δεν ήταν ρυθμισμένη σε φυσιολογικά κύτταρα λοβαστατίνη φάρμακο (Σχήμα 6Α). Η λοβαστατίνη προκάλεσε επίσης το οξειδωτικό στρες που υποδεικνύεται από την έκφραση της αίμης οξυγενάσης-1 (ΗΟ-1) [27] σε καρκινικά κύτταρα (Σχήμα 6Β), η οποία δεν ανιχνεύεται σε κανονικά κύτταρα SDM104 είτε (Σχήμα 6Α). Ως εκ τούτου, λοβαστατίνη προκαλεί αυτοφαγία και το οξειδωτικό στρες στον καρκίνο, αλλά όχι τα φυσιολογικά κύτταρα.

Συζήτηση

Οι παρενέργειες των αντικαρκινικών φαρμάκων βλάπτει την ποιότητα ζωής των ασθενών και να επηρεάσει τη θεραπευτική αποτελεσματικότητα [28]. Ταυτοποιήσαμε λοβαστατίνη από μια οθόνη για παράγοντες οι οποίοι μειωμένη τοξικότητα επαγόμενη από cisplatin σε φυσιολογικά κύτταρα, ενώ επιτρέπει στα καρκινικά κύτταρα να σκοτωθεί. Λοβαστατίνη όχι μόνο με τη μεσολάβηση την προστατευτική δράση CDDP για τα κανονικά κύτταρα, αλλά επίσης προκάλεσε βλάβες στο DNA, το οξειδωτικό στρες και αυτοφαγία ειδικά σε καρκινικά κύτταρα.

Η προστασία των φυσιολογικών κυττάρων έναντι CDDP είναι σε συμφωνία με τις προηγούμενες παρατηρήσεις ότι η λοβαστατίνη προστατεύεται ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα (HUVEC) από τις τοξικές επιδράσεις των αντικαρκινικών φαρμάκων δοξορουβικίνη και ετοποσίδη και τη δολοφονία της ιονίζουσας ακτινοβολίας

in vitro

[29], [30]. Λοβαστατίνη επίσης μειωμένη ιονίζουσα ακτινοβολία που προκαλείται από φυσιολογική βλάβη ιστού και προστατεύονται από ανθρακυκλίνη καρδιακής τοξικότητας που προκαλείται από

in vivo

[31], [32].

Δείξαμε ότι διαμεσολαβείται λοβαστατίνη CDDP προστατευτική επίδραση σε κανονικούς κύτταρα σε συγκέντρωση 2 μΜ, η οποία είναι στην περιοχή του φαρμακολογικά εφικτή συγκέντρωση στον ορό του λοβαστατίνης (2.3 ± 1.27 μΜ) [18], που σημαίνει άμεση σκοπιμότητα της κλινικής εφαρμογής της λοβαστατίνης θεραπεία των ασθενών με καρκίνο που λαμβάνουν αυτό το φάρμακο. Παρόμοια συγκέντρωση είχε χρησιμοποιηθεί για την προστασία των κυττάρων CHO ποντικού από δοξορουβικίνη, και η αναστολή της γερανυλγερανυλίωση προτάθηκε ότι εμπλέκονται στην προστατευτική επίδραση [33]. Δείξαμε εδώ ότι ένας παρόμοιος μηχανισμός λειτουργεί επίσης στην λοβαστατίνη μεσολάβηση προστασία των φυσιολογικών ανθρώπινων κυττάρων από CDDP. Επιβεβαιώσαμε περαιτέρω ότι το προστατευτικό αποτέλεσμα της λοβαστατίνης οφείλεται κυρίως σε μια γερανυλγερανυλίωση εξαρτώμενη μηχανισμός αφού GGTI αλλά όχι FTI έδειξε παρόμοια επίδραση όπως λοβαστατίνη στην προστασία των φυσιολογικών ανθρώπινων κυττάρων από τοξικότητα CDDP.

γερανυλγερανυλιωμένες πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην έλεγχος του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [9]. Η μείωση αυτού του μετα-μεταφραστική τροποποίηση μπορεί να είναι υπεύθυνη για τη σύλληψη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού που παρατηρείται σε φυσιολογικά κύτταρα μετά από θεραπεία με λοβαστατίνη. Είναι γνωστό ότι η επεξεργασία του CDDP-DNA-προϊόντα προσθήκης σε πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα οδηγεί σε βλάβη του DNA [19], [34]. Ως εκ τούτου, η αναπαραγωγή, ηρεμίας ή -inhibited κύτταρα γίνονται ανθεκτικά σε CDDP. Αυτό μπορεί επίσης να εξηγήσει γιατί η λοβαστατίνη δεν προστατεύει τα καρκινικά κύτταρα, όπου ο πολλαπλασιασμός-ανασταλτικές επιδράσεις της λοβαστατίνης μπορεί να ανταγωνίζεται από ογκογόνους μεταλλάξεις [35].

Πρόσφατες μελέτες έχουν ανανεώσει το θεραπευτικό ενδιαφέρον για τους αναστολείς του βιοσυνθετική οδό της χοληστερόλης σε καρκίνους του μαστού με μεταλλάξεις ρ53, δεδομένου ότι γίνεται πολύ εξαρτημένη από αυτήν την οδό [36]. Σε δύο από δοκιμάστηκαν καρκινικών κυτταρικών γραμμών (ZL55 και MCF-7) παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετά από θεραπεία με λοβαστατίνη, υποδεικνύοντας ότι ακόμη και p53-ικανοί όγκοι μπορεί να είναι ευαίσθητη σε κάποιο βαθμό να ανασταλτικές της ανάπτυξης επιδράσεις της θεραπείας λοβαστατίνη. Σε αντίθεση με τα φυσιολογικά κύτταρα, όπου η επίδραση επί του πολλαπλασιασμού προέκυψαν από την αναστολή της αντιγραφής του DNA, η λοβαστατίνη μεσολάβηση μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να αποδοθεί σε βλάβη ϋΝΑ-εξαρτώμενη G

0 /G

1 σύλληψης . Λόγω της μικρή μείωση σε κύτταρα φάσης S, τα καρκινικά κύτταρα δεν προστατεύονταν από λοβαστατίνη από την κυτταροτοξική δράση του CDDP.

Είναι γνωστό ότι η λοβαστατίνη καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, και επαγόμενη από οξειδωτικό στρες, αυτοφαγία και απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα

in vitro

[24], [37] – [45]. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, λοβαστατίνη ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου [25] και ενίσχυσε την αντικαρκινική δράση της δοξορουβικίνης και CDDP

in vivo

[46], [47] και η μακροχρόνια χρήση της στατίνης σχετίζεται με χαμηλότερο κίνδυνο πολλοί καρκίνοι [48], [49]. Εδώ, δείχνουμε επίσης ότι οι εν λόγω λοβαστατίνη επαγόμενη επιβλαβείς επιδράσεις συμβαίνουν ειδικά στον καρκίνο αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα.

Ως εκ τούτου, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η λοβαστατίνη έχει δυνατότητα για την προστασία των φυσιολογικών κυττάρων από τοξικότητα CDDP χωρίς να μειώνεται η ευαισθησία του καρκίνου κυττάρων στη θεραπεία CDDP που βασίζεται βελτιώνοντας έτσι το θεραπευτικό δείκτη.

ευχαριστίες

ιδιαίτερες ευχαριστίες μας πηγαίνουν σε όλα τα μέλη του Εργαστηρίου Μοριακής Ογκολογίας USZ για την ευγενική τους βοηθά και την τόνωση των συζητήσεων. Είμαστε ευγνώμονες στον Δρ Τζέιμς Rheinwald (Harvard Medical School) για την καλοσύνη να μας παρέχουν LP9 κύτταρα.