μετανάστευσης

Αφηρημένο

Ιστορικό

κυττάρων είναι μια εξαιρετικά πολύπλοκη διαδικασία, που ρυθμίζεται από πολλαπλά γονίδια , μονοπάτια σηματοδότησης και εξωτερικά ερεθίσματα. Για να ανακαλύψουν γονίδια ή φαρμακολογικών παραγόντων που μπορούν να ρυθμίζουν τη μεταναστευτική δραστηριότητα των κυττάρων, η διαλογή στρατηγικές που επιτρέπουν την παρακολούθηση των ποικίλων μεταναστευτικών παραμέτρους σε ένα μεγάλο αριθμό δειγμάτων είναι απαραίτητες.

Μεθοδολογία

Εν μελέτη, περιγράφουμε την ανάπτυξη ενός ποσοτικού, υψηλής απόδοσης δοκιμασία κυτταρική μετανάστευση, βασίζεται σε τροποποιημένη φαγοκινητική κομμάτια διαδικασία (ΠΚΤ), και να εφαρμοστεί για την ταυτοποίηση νέων προμεταναστευτικές γονιδίων σε μια βιβλιοθήκη γονιδίου σχετίζονται με τον καρκίνο. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων φιμπρονεκτίνη-επιχρισμένα με μία μονοστοιβάδα καρβοξυλιωμένα σφαιρίδια λατέξ. Κινητικά κύτταρα καθαρίσετε τις χάντρες, που βρίσκονται κατά μήκος των μεταναστευτικών διαδρομών τους, σχηματίζοντας κομμάτια που καθίστανται ορατά χρησιμοποιώντας ένα αυτοματοποιημένο, μεταδίδονται-οπτικό μικροσκόπιο ανίχνευσης. Τα κομμάτια στη συνέχεια, κατά διαστήματα και χαρακτηρίζονται από πολυ-παραμετρικές, μορφομετρική ανάλυση, επίλυση μια ποικιλία των μορφολογικών και κινητικών χαρακτηριστικών.

Συμπεράσματα

Στην οθόνη αυτή εντοπίσαμε 4 νέων γονιδίων που προέρχονται από καρκίνωμα του μαστού σχετικές βιβλιοθήκη cDNA, του οποίου η υπερ-έκφραση επάγει σημαντική μεταβολή στη μετανάστευση των στατικών κυττάρων MCF7. Αυτή η προσέγγιση μπορεί να χρησιμεύσει για τη διαλογή υψηλής απόδοσης για νέους τρόπους για να ρυθμίζουν την κυτταρική μετανάστευση σε παθολογικές καταστάσεις όπως η μετάσταση του όγκου και την εισβολή

Παράθεση:. Naffar-Abu-Amara S, Shay Τ, Galun M, Cohen Ν, Isakoff SJ, Kam Ζ, et al. (2008) Ταυτοποίηση των Μυθιστόρημα Pro-Μεταναστευτικό, σχετίζονται με τον καρκίνο γονίδια χρησιμοποιώντας ποσοτική, Μικροσκοπία προσυμπτωματικό έλεγχο. PLoS ONE 3 (1): e1457. doi: 10.1371 /journal.pone.0001457

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Neil Hotchin, Πανεπιστήμιο του Birmingham, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 21 Οκτ 2007? Αποδεκτές: 18 Δεκέμβρη του 2007? Δημοσιεύθηκε: 23 του Ιανουαρίου 2008

Copyright: © 2008 Naffar-Abu-Amara et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Ισραήλ Επιστήμη και επιχορήγηση NIGMS για το κινητό Μετανάστευσης Consortium (ΝΙΗ Grant U54GM64346), και από το ταμείο Kahn για συστημική βιολογία στο Ινστιτούτο Weizmann

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

μετανάστευση κυττάρων παίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε πολυάριθμες φυσιολογικές διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της εμβρυϊκής ανάπτυξης, φλεγμονώδεις αποκρίσεις, επούλωση πληγών, και την αγγειογένεση, όπως επίσης και σε παθολογικές καταστάσεις όπως ως εισβολή και μετάσταση όγκου [1], [2]. Να διερευνήσει τους μηχανισμούς που διέπουν τη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης, έχουν αναπτυχθεί μια ποικιλία από ποιοτικές και ποσοτικές προσεγγίσεις. Αυτές περιλαμβάνουν 2- και 3-διαστάσεων ταινίες time-lapse, εντοπισμού μετανάστευση καλλιεργημένων ή ιστού-embedded κυττάρων [3], [4], προσδιορισμούς πληγή-κλείσιμο [5] – [7], προσδιορισμούς μήτρας διαπέρασης [8] [9], και «καταγραφή» της μετανάστευσης των κυττάρων «ιστορία», με βάση προσδιορισμούς όπως ο σχηματισμός της ΠΚΤ [10]. Η τελευταία δοκιμασία χρησιμοποιείται ευρέως για τη μελέτη των μεταναστευτικών δραστηριότητες των διαφορετικών τύπων κυττάρων [3], [11], μήτρα αναδιαμόρφωση [12], [13] και διατάραξη των κυτταρικών μετανάστευση με χημική ή γενετική ρυθμιστές [14] – [19]. Οι μελέτες αυτές έχουν ιδιαίτερη σημασία για τον καρκίνο κυτταρική κινητικότητα, η οποία πιστεύεται να αντικατοπτρίζει την επεμβατική ή μεταστατικό δυναμικό αυτών των κυττάρων in vivo [14], [20] – [23]. Έτσι, ο προσδιορισμός των χημικών ουσιών που αλλοιώνουν τη μετανάστευση των κυττάρων, ή συγκεκριμένα γονίδια των οποίων η διαταραχή επηρεάζει τη μετανάστευση των κυττάρων θα μπορούσε δυνητικά να χρησιμοποιηθεί για τη διαμόρφωση της μεταστατικής κυτταρικής μετανάστευσης.

Ο στόχος μας στην παρούσα μελέτη ήταν να αναπτυχθεί μια προσέγγιση που βασίζεται ΠΚΤ για την παρακολούθηση της μετανάστευσης των κυττάρων, η οποία είναι αναπαραγώγιμη, συμβατή με μικροσκοπία υψηλής απόδοσης, και παρέχει ποσοτικές πληροφορίες, μορφολογικές και δυναμική, στη μεταναστευτική διαδικασία. Δείχνουμε εδώ ότι ενώ η ΠΚΤ καταγράφει την ολοκληρωμένη ιστορία των μεταναστευτικών δραστηριότητας σε ένα μόνο χρονικό σημείο, η ποσοτική λογισμικό απεικόνισης, επιτρέπει τον υπολογισμό των δύο «στατική» παραμέτρους όπως το μήκος της τροχιάς και τομέα και «δυναμική» παραμέτρους, όπως τα ποσοστά μετανάστευσης , επιμονή, και πεταλοειδή δραστηριότητα.

η δοκιμασία μετανάστευσης υψηλής απόδοσης που περιγράφεται στο παρόν, και το λογισμικό απεικόνισης που αναπτύχθηκε για τη μέτρηση διαφορετικά χαρακτηριστικά της μεταναστευτικής διαδικασίας, παρέχουν μια ταχεία, αξιόπιστη και ποσοτική προσέγγιση για την αξιολόγηση της μετανάστευσης των κυττάρων σε διάφορους τύπους κυττάρων, καλλιεργημένων υπό διάφορες συνθήκες, και εκτίθενται σε μια ποικιλία από χημικές ή γενετικές διαταραχές.

Αποτελέσματα

Ανάπτυξη ενός σφαιριδίου με βάση υψηλής απόδοσης

δοκιμασία ΠΚΤ

Κρίσιμη στην ανάπτυξη αυτής της δοκιμασίας ΠΚΤ ήταν η επιλογή των κατάλληλων χάντρες, με βέλτιστες διαστάσεις και τις χημικές ιδιότητες (Πίνακας S1). Τα σφαιρίδια που βρέθηκαν πιο κατάλληλη για προσδιορισμούς ΠΚΤ εφαρμοστεί σε μια ευρεία ποικιλία κυτταρικών τύπων ήταν καρβοξυλικό τροποποιημένο λατέξ (CML) λευκό σφαιρίδια πολυστυρενίου, με μέση διάμετρο 340 nm, και περιεκτικότητα αρνητικό φορτίο του 184,7 μΕς /g. Αυτά τα σφαιρίδια σχηματισμό ενός ομοιογενούς και ορατή μονοστιβάδα? προσήλωσή τους στο υπόστρωμα είναι αρκετό για να εμποδίσει την αυθόρμητη αφαίρεση εταιρεία, αλλά ακόμα επιρρεπείς σε απομάκρυνση από κύτταρα που μεταναστεύουν

Η επιφάνεια χημεία των σφαιριδίων βρέθηκε να έχει μια ισχυρή επίδραση στην δοκιμασία ΠΚΤ:. χάντρες με μια αλδεΰδη -τροποποιημένης επιφάνεια στερεώνεται σταθερά στο υπόστρωμα, και δεν θα μπορούσε να απομακρυνθεί με μεταναστεύουν κύτταρα. Χάντρες με μια θειική ομάδα επιφάνεια έτειναν να συσσωματώνονται, δίδοντας ένα μη ομοιόμορφο μονοστιβάδας. Καρβοξυλιωμένου χάντρες, με ή χωρίς πρόσθετες θειικές ομάδες, είχαν την τάση να σχηματίζουν μάλλον ομοιογενή εναιωρήματα μετά από φυγοκέντρηση. Η επιφανειακή πυκνότητα των καρβοξυλικών ομάδων που επηρεάζονται επίσης σχηματισμός τροχιά: χαμηλή πυκνότητα φορτίου (23,9 μΕς /g) προκάλεσε το σφαιρίδιο να αλληλεπιδρά έντονα με την επιφάνεια, έτσι ώστε πολλοί τύποι κυττάρων απέτυχε να απομακρύνει αποτελεσματικά τις χάντρες καθώς μετανάστευσαν. Χάντρες με καρβοξυλικές ομάδες ενδιάμεσης πυκνότητας (91,4 μΕς /g) βρέθηκε βέλτιστη για μερικούς προσκολλημένα κύτταρα (π.χ., Η1299, REF52), αλλά όχι για κύτταρα με ασθενέστερη συμφύσεις (π.χ., MCF7? Β16-F10). Σφαιρίδια που περιέχουν ομάδες καρβοξυλίου με πυκνότητα 160-185 μΕς /g βρέθηκαν να είναι η βέλτιστη για προσδιορισμούς εφαρμοστεί σε ένα ευρύ φάσμα κυτταρικών τύπων.

Επιπλέον, η διάμετρος των σφαιριδίων είχε μια σημαντική επίδραση στην ορατότητα των κομματιών και για την σταθερότητα της μονοστιβάδας. Έτσι, μικρά σφαιρίδια (& lt? 300 nm σε διάμετρο) δύσκολα θα μπορούσε να απεικονιστεί, ενώ οι μεγάλες χάντρες (~1,000 nm σε διάμετρο) τείνουν να αποκολληθούν από την επιφάνεια και στη συνέχεια αυθόρμητα ξαναβάλουν, με αποτέλεσμα μη επαρκώς καθορισμένα κομμάτια. Η βέλτιστη διάμετρος σφαιριδίου για την αυτοματοποιημένη προσδιορισμούς ΠΚΤ βρέθηκε να είναι περίπου 400 nm.

Ανάπτυξη του αυτοματοποιημένου συστήματος μικροσκοπία

δοκιμασίες ΠΚΤ καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας ένα κύτταρο-διαλογή μικροσκόπιο [24] εξοπλισμένα με συσκευή αυτόματης εστίασης με λέιζερ [25]. Το πρόγραμμα λειτουργίας μικροσκόπιο και το λογισμικό λήψης εικόνας γράφτηκαν ως εφαρμογή στο περιβάλλον UCSF PRIISM (https://msg.ucsf.edu/ive). Για την εφαρμογή αυτή, οι εικόνες ελήφθησαν με τη χρήση ενός στόχου 10 × /0.4, υπό μεταδίδεται φωτισμό φως. Ένα φως διάχυσης εισήχθη πάνω από την πλάκα πολλαπλών φρεατίων, για την ελαχιστοποίηση των μη ομοιογενή φωτισμό και να αποφύγει τις σκιές προκαλείται συνήθως από τα στενά τοιχώματα καλά

Το ειδικό πρόγραμμα απόκτησης ελέγχει το φωτισμό.? αυτόματης εστίασης και λήψης εικόνων βήματα για όλα τα επιλεγμένα πεδία μέσα σε κάθε φρεάτιο και για όλα τα επιλεγμένα φρεάτια στην πλάκα, ενώ βελτιστοποιώντας τα πειραματικά στοιχεία (π.χ. καλά αριθμός, θέση πεδίου, χρόνος έκθεσης, αντικειμενικά, οπτική ρύθμιση, και τα παρόμοια). Για να εγγράψετε ένα μέγιστο αριθμό των πλήρων κυττάρων κομμάτια, εικόνες των παρακείμενων πεδία συγχωνεύονται σε ένα ενιαίο μοντάζ, στην οποία κομμάτια που εκτείνονται σε περισσότερες από μία εικόνες συγχωνεύονται σε υψηλή ακρίβεια (Σχήμα S1).

Ποσοτικοποίηση των μεταναστευτικών παραμέτρους, με βάση την ΠΚΤ μορφομετρία

για να προσδιορίσετε μεμονωμένα κομμάτια, εικόνες υποβλήθηκαν σε «ισοπέδωση», αντισταθμίζοντας έτσι μη ομοιογενή φωτισμό, την εξομάλυνση και βελτίωση αντίθεσης. Η προκύπτουσα ένταση ιστόγραμμα απέδωσε ένα κύρια κορυφή που αντιστοιχεί στο ατάραχος υποβάθρου (Σχήμα 1γ, μαύρο αστερίσκος)? μια κορυφή υψηλή ένταση που αντιστοιχεί στα σφαιρίδια ελεύθερα κομμάτια (Σχήμα 1γ, μπλε αστερίσκο)? και εικονοστοιχεία χαμηλής έντασης που αντιστοιχεί στο σφαιρίδιο κύτταρα φορτωμένα (Σχήμα 1γ, κόκκινο αστερίσκο). Με την εφαρμογή δύο δυαδικών ορίων, κύτταρα (Σχήμα 1δ), και ίχνη (Σχήμα 1ε) θα μπορούσε να διαφοροποιηθεί από το άλλο. Συντρίμμια, γρατσουνιές, κομμάτια με κανένα ή περισσότερα από ένα κύτταρο, τεμνόμενες διαδρομές και ίχνη που εκτείνεται πέρα ​​από τα σύνορα του μοντάζ, εντοπίστηκαν και απορρίπτονται (Σχήμα 1στ, τα τμήματα που περιγράφονται στο μπλε). Για να αποκτήσετε λεπτή ορισμό των συνόρων κομμάτι, το οποίο ήταν ελαφρώς θολή από το βήμα εξομάλυνσης (Σχήμα 1 g), τα όρια κομμάτι υπολογίστηκαν εκ νέου από τις αρχικές εικόνες, χρησιμοποιώντας Multiscale ανάλυση τμηματοποίησης [26] (Σχήμα 1).

(α ) ένα μοντάζ 4 × 4 πεδία (1024 × 1024 pixels), το καθένα απέκτησε τη χρήση ενός στόχου 10 × /0.4. (Β) ενός ενιαίου πεδίου (512 × 512 pixels, ομαδοποιημένων 2 χ 2) (γ) Ιστόγραμμα της έντασης των pixel: η κύρια κορυφή (*) αντιστοιχεί σε εικονοστοιχεία φόντου? ο ανήλικος κορυφή φωτεινό έντασης (*) αντιστοιχεί σε παρακολουθείτε pixels? και τα σκοτεινά pixels αντιπροσωπεύουν κυτταρικά σώματα και τα συντρίμμια (*). Οι κόκκινες κάθετες γραμμές σημειώνουν τα δύο όρια διαχωρισμού των pixels κομμάτι από τα κύτταρα και του φόντου. (D, e) δυαδικές εικόνες, μετά την εφαρμογή ορίων. Pixel με εντάσεις κάτω από το κατώτερο όριο (τα κύτταρα και τα συντρίμμια) είναι χρώματος λευκού (δ), και τα εικονοστοιχεία με εντάσεις πάνω από το υψηλότερο όριο (κομμάτια) χρωματισμένο λευκό (ε). (Στ) Όλα τα συνδεδεμένα συστατικά ολόκληρου του μοντάζ που περιγράφεται: Τα κομμάτια με κόκκινο περίγραμμα. Αντικείμενα είτε πολύ μικρή ή πολύ μεγάλη σε έκταση που πρέπει να περιλαμβάνονται στην ανάλυση της εικόνας, ή που βρίσκεται στα σύνορα του μοντάζ, περιγράφονται σε μπλε. (Ζ) Η διεύρυνση του τμηματικού τομέα ακόλουθη δυαδική κατάτμησης. (Η) Η ίδια περιοχή που απεικονίζεται στο (ζ), μετά από πολυ-κλίμακας κατάτμησης, και συμπεριλαμβανομένου του προστίμου περίγραμμα της πίστας και των αξόνων κομμάτι. Ράβδοι κλίμακας: 250 μm

Η

Μετά το βήμα κατάτμησης, έχουμε ποσοτικά τις διάφορες μορφομετρικών παραμέτρων για κάθε τύπο κυττάρου.. Οι παράμετροι κομμάτι που αυτόματα μετριέται περιλαμβάνονται περιοχή κομμάτι, περίμετρο, κύριο άξονα, δευτερεύοντα άξονα, αξονική αναλογία και τη σταθερότητα. Track μήκος διαδρομής και από άκρο σε άκρο μήκους με το χέρι μετρήθηκαν. Οι παράμετροι γραμμής υπολογίζεται από αυτές τις μορφομετρικών παραμέτρων περιλαμβάνουν την επιμονή, την αποτελεσματική ταχύτητα, μέση ταχύτητα μετανάστευσης, φολιδωτή δραστηριότητα, και τη συνολική κατευθυντικότητα. Αυτά τα μορφολογικά και «δυναμική» παραμέτρων που ορίζονται στον Πίνακα S2, και γραφικά παρουσιάζονται στο Σχήμα 2.

Ο αυτόματος υπολογισμός των διαφόρων μορφομετρικές παράμετροι που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη, οι καταδειχθεί χρησιμοποιώντας pkts σχηματίζεται από Η1299, Β16-Ρ10 και τα κύτταρα MCF7. Οι υπολογιζόμενες παράμετροι περιλαμβάνουν: Συνολική έκταση κομμάτι (μm

2), οριοθετείται σε κόκκινο? καθαρό εμβαδόν προσκήνιο μετά τον τομέα των κυττάρων αφαιρείται? μικρές και μεγάλες άξονες (μm) του ταιριάζει καλύτερα έλλειψη? αναλογία των αξόνων? ταχύτητα μετανάστευσης [μήκος του σκελετού και των υποκαταστημάτων (πράσινο + μπλε) /χρόνος μετάβασης], αποτελεσματική ταχύτητα [end-to-end απόσταση (κόκκινο χρώμα) /χρόνος μετάβασης]? παρακολουθείτε περίμετρο? τραχύτητα [Περιμετρική

2 /(4π * Χώρος)] και τη σταθερότητα [περιοχή track (μπλε) /περιοχή της κυρτό του κύτους (κόκκινο + μπλε) που περικλείει το κομμάτι]. Οι τιμές που αναφέρονται στο σχήμα παραπέμπει στο ενιαίο κομματιών.

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι, ακόμη και φαινομενικά παρόμοιες παραμέτρους (π.χ., «ταχύτητα μετάβασης» και «αποτελεσματική ταχύτητα») μπορεί να ποικίλει σε μεγάλο βαθμό. Για παράδειγμα, Β16-Ρ10 κυττάρου, που φαίνεται στο Σχήμα 2, εμφάνισε σχεδόν την ίδια ταχύτητα μετανάστευσης (62,4 μm /hr) ως Η1299 κυττάρων (67,26 μm /h), ενώ ο τελευταίος τύπος κυττάρου εμφανίζεται πολύ υψηλότερη αποτελεσματική ταχύτητα (57,26 μm /hr, σε σύγκριση με 20,4 μm /hr σε κύτταρο Β16-Ρ10), υποδεικνύοντας μια πιο επίμονη μετανάστευση από το πρώτο. Για να αξιολογηθεί «πλευρική» πεταλοειδή δραστηριότητα, η οποία επηρεάζει το πλάτος και την τραχύτητα των συνόρων πίστα, μετρήθηκε η περίμετρος κομμάτι, και υπολογίζονται οι παράμετροι τραχύτητας και τη σταθερότητα. Αυτή η ανάλυση έδειξε ότι, ενώ οι περίμετροι των κομματιών που αποτελούνται από κύτταρα Η1299 και Β16-Ρ10 ήταν σχεδόν η ίδια, η παράμετρος τραχύτητα ήταν σημαντικά υψηλότερη σε Β16-Ρ10 κυττάρων (5,2) από ό, τι σε Η1299 κυττάρων (3,2), υποδεικνύοντας υψηλότερο πεταλοειδή δραστηριότητα στην κύτταρα μελανώματος. Η διαπίστωση αυτή επιβεβαιώθηκε άμεσα από ταινίες time-lapse (Σχήμα 3, και Ταινίες S1 και S2).

Τα διαφορετικά χρονικά σημεία παρουσιάζονται στο οποίο πλευρική πεταλοειδή δραστηριότητα ενός Η1299 (άνω τμήμα) ή Β16-F10 (κάτω πάνελ κύτταρα) αφήνουν πίσω τους σημάδια στο σχήμα και την τραχύτητα των συνόρων πίστα. (Πλήρους μήκους ταινίες είναι διαθέσιμες σε απευθείας σύνδεση, όπως ταινία S1 και S2 ταινίας, αντίστοιχα.)

Η

Εφαρμογή της ΠΚΤ μορφομετρίας για τη μέτρηση κυτταρικό τύπο και τα ναρκωτικά που προκαλείται επιπτώσεις για τα μεταναστευτικά παραμέτρους

α) Διαφορετικοί τύποι κυττάρων παράγουν ΠΚΤ με διακριτά χαρακτηριστικά.

Ο προσδιορισμός της ΠΚΤ που περιγράφεται εδώ χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστεί η μεταναστευτική συμπεριφορά μιας ποικιλίας κυτταρικών σειρών. Αυτές περιλαμβάνουν: Β16-F10 και B16-F1 κύτταρα μελανώματος? κύτταρα καρκινώματος μαστού MDA-MB-231 και MCF7, REF52, SV80 και ΝΙΗ3Τ3 ινοβλαστών γραμμές? κύτταρα καρκινώματος πνεύμονα Η1299 και αρκετές γραμμές καρκινώματος προστάτη (DU145, PC3 και CL1). Τέσσερις από αυτές τις κυτταρικές σειρές (MDA-MB-231, MCF7, Η1299 και Β16-Ρ10) χρησιμοποιούνται για τους σκοπούς της απεικόνισης (βλέπε Εικόνα 4α και Πίνακας S3). κύτταρα MCF7, για παράδειγμα, δύσκολα μεταναστεύουν, παράγουν μόνο ένα μικρό, χάντρα-ελεύθερη ζώνη γύρω από κάθε κύτταρο, με μέσο καθαρό εμβαδόν κομμάτι των 4.900 ± 2.400 μm

2 (n = 93). Τα κύτταρα μελανώματος Β16-F10 παράγουν διακλαδισμένης κομμάτια λόγω της επέκτασης των πολλαπλών filopodia και λεπτό έλασμα σε μεγάλο βαθμό κάθετα προς τον κύριο μεταναστευτικό κομμάτι, με μέσο καθαρό εμβαδόν 7.400 ± 2.800 μm

2 (n = 124). Τα κύτταρα MDA-MB-231 είναι άκρως μεταναστευτικών μεταστατικών κυττάρων, που παράγουν τόσο μεγάλη και φαρδιά μετατρόχια με μέση καθαρή έκταση 13.500 ± 6.300 μm

2 (n = 149). Τα κύτταρα Η1299 χαρακτηρίζεται από ταχεία και εξαιρετικά επίμονη μετανάστευση, που αποτελούν κομμάτια με μέση καθαρή έκταση 14.000 ± 7.600 μm

2 (n = 104).

(α) Ένα μοντάζ 2 × 3 εικόνες η ΠΚΤ των κυττάρων MCF7, καθώς επίσης και για MDA-MB-231 κύτταρα, κύτταρα Β16-Ρ10, και Η1299 κύτταρα. Σημειώστε τις διαφορές στην τροχιά καθαρό εμβαδόν (Α

Ν) και αξονική αναλογία (Χ), ανάλογα με την κυτταρική σειρά. (Β) Ένα μοντάζ 2 × 3 εικόνα των κυττάρων ελέγχου Η1299, τα οποία εμφανίζουν μεγάλες μεταναστευτικές διαδρομές που είναι ιδιαίτερα ανθεκτικές. Οι εικόνες μοντάζ του Latrunculin Α (4 μΜ) – και Nocadazole (2,5 μΜ) κατεργασμένους πηγάδια υποδεικνύουν ανέστειλε κινητικότητα των κυττάρων? ΡΜΑ (100 ng /ml) κατεργασμένους καλά δείχνει μια αύξηση στην κυτταρική κινητικότητα. Ράβδοι κλίμακας:. 250 μm

Η

β) Οι επιδράσεις των φαρμάκων κυτταροσκελετού στην ΠΚΤ διαρθρωτικά και δυναμικά χαρακτηριστικά

Για να καθοριστεί αν αυτοματοποιημένο σύστημα ελέγχου μας ήταν ικανή να ανιχνεύει αλλαγές στην. ειδικά μεταναστευτικά χαρακτηριστικά που προκαλούνται από γενετικές ή χημικές διαταραχές, που αντιμετωπίζονται Η1299 κυττάρων με διάφορες ενώσεις (π.χ., Latrunculin-Α, Νοκοδαζόλη και PMA) είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την κυτταρική κινητικότητα. Η επίδραση του κάθε φαρμάκου για τις διάφορες παραμέτρους μορφομετρικών συνέχεια μετρήθηκε (Σχήμα 4β). Δεδομένου ότι οι τιμές για κάθε παράμετρο της ΠΚΤ δεν φαίνεται να έχουν φυσιολογική στατιστικών κατανομών, εμείς βάση σύγκρισης μας σχετικά με τις αλλαγές στο εκατοστημόριο τιμές για κάθε μορφομετρική παράμετρο, όχι σχετικά με τις αλλαγές στο μέσες τιμές (Πίνακας S4). Ανάλυση της περιοχής ΠΚΤ του Η1299 κύτταρα επεξεργασμένα με τους διάφορους αναστολείς έδειξαν ότι Latrunculin-Α ή Νοκοδαζόλη μείωσε σημαντικά περιοχές κομμάτι, αξονική αναλογίες, οι ταχύτητες μετανάστευση και την τραχύτητα, σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Στα PMA-κατεργασμένων κυττάρων, η περιοχή ΠΚΤ, κύριο άξονα και υπολογίζεται ταχύτητες μετανάστευσης αυξήθηκε (p & lt? 0.05), αλλά το μικρό άξονα, αξονικές αναλογίες και τη σταθερότητα δεν διέφεραν σημαντικά από αυτές των κυττάρων ελέγχου

Εφαρμογή. του προσδιορισμού ΠΚΤ στην ταυτοποίηση προμεταναστευτικές γονιδίων σε ένα γονιδιακή βιβλιοθήκη του μαστού καρκίνωμα που σχετίζονται με (BC1000)

Η δοκιμασία ΠΚΤ περιγράφεται εδώ χρησιμοποιήθηκε για τη διαλογή μίας βιβλιοθήκης γονιδίων σχετιζόμενων με τον καρκίνο για την ικανότητά τους να επάγουν ένα μεταναστευτικό φαινότυπο σε μεγάλο βαθμό σταθερές μαστού επιθηλιακών κυττάρων. Για τον σκοπό αυτό, μπορούμε μολυσμένα καλλιεργημένα κύτταρα MCF7 με ρετροϊικούς φορείς που κωδικοποιούν 55 γονίδια που επιλέγονται από την βιβλιοθήκη BC1000 (Πίνακας S5) και ελέγχθηκαν μεταναστευτική δραστηριότητα τους με τη βοήθεια ποσοτικής διαλογής ΠΚΤ.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5α και Πίνακας S6 , η οθόνη ΠΚΤ μας επέτρεψε να εντοπιστούν τέσσερις νέες προμεταναστευτικές υποψήφιοι: HOXB7, FGF7, erbB3 και ΡΚΟζ. Το 80

ου ποσοστιαίες τιμές, καθώς και το μέσο όρο και την τυπική απόκλιση, παρουσιάζονται στον Πίνακα S6. Ενώ όλα τα τέσσερα γονίδια τονωθεί η μετανάστευση MCF7 κυττάρων, τα αποτελέσματά τους στις διάφορες μεταναστευτικές παράμετροι διέφεραν. Έτσι, ενώ FGF7 και ΡΚΟζ κλώνοι που επάγεται ο σχηματισμός πολύ, επίμονη κομμάτια, λόγω της ενίσχυσης της κατεύθυνσης προεξοχές μεμβράνης, οι επιμήκεις τροχιές, που προκαλείται από HOXB7 και ErbB3 φάνηκε να σχετίζεται με πολλαπλές προεξοχές μεμβράνη σε όλες τις κατευθύνσεις. Ως εκ τούτου, ενώ η προβολή της κατεύθυνσης «προς τα εμπρός προεξοχές» δεν μπορεί να εκτιμηθεί άμεσα από μορφομετρία κομμάτι, είναι προφανές ότι η ενίσχυση του μήκους διαδρομής η οποία δεν συνοδεύεται από υψηλή τραχύτητα τιμές είναι, πιθανότατα, οδηγείται από αυξημένη κατεύθυνσης lamellipodial δραστηριότητας (Πίνακας S6 και Εικόνα 5). Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι στην οθόνη της βιβλιοθήκης BC1000, αλλαγές στη μεταναστευτική συμπεριφορά παρατηρήθηκαν για ένα άλλο γονίδιο, δηλαδή MFGE8 (επίσης γνωστό ως ΒΑ46 αντιγόνο επιθηλιακής του μαστού). Ενώ η υπερέκφραση του γονιδίου που προκαλείται από μικρές μόνο ενίσχυση στην περιοχή της ΠΚΤ, είχε ενισχύσει σε μεγάλο βαθμό την τραχύτητα κομμάτι, γεγονός που υποδηλώνει ότι ενισχύει προεξοχή μη-κατευθυντικό μεμβράνη (Naffar Abu-Amara, αδημοσίευτα δεδομένα).

(α) μοντάζ 4 × 4 εικόνες, συγκρίνοντας ΠΚΤ που παράγεται από τα κύτταρα ελέγχου GFP-MCF7, με εκείνες που παράγονται από τα κύτταρα MCF7 εκφράζουν τις BC1000 που προέρχονται από γονίδια HOXB7, ΡΚΟζ, FGF7, και ErbB3. Μεγέθυνση: 10 ×. Ράβδοι κλίμακας: 250 μm. (Β) υπολογισμένη αναλογία μεταξύ καθενός από τα μεταναστευτικά παραμέτρων μορφομετρικών των διαφόρων υποψηφίων βιβλιοθήκη BC1000, και εκείνων των κυττάρων ελέγχου (GFP-MCF7). Η κύρια στατιστική προσέγγιση που χρησιμοποιείται βασίζεται σε υπολογισμό, για κάθε παράμετρο, το η κανονικοποιημένη επίδραση της GFP-ελέγχου είναι πάντα ορίζεται ως μηδέν «80

ο εκατοστημόριο.»: Η τιμή μηδέν δείχνει ότι δεν υπάρχει διαφορά μεταξύ του «80

th εκατοστημόριο «τιμή του υποψήφιου γονιδίου, και των κυττάρων ελέγχου. Αριθμοί που είναι υψηλότερες ή χαμηλότερες από μηδέν υποδηλώνουν αύξηση ή μείωση, αντίστοιχα, σε 80

ου αξία εκατοστημορίου των δοκιμαζόμενων παραμέτρων. (Για περισσότερες λεπτομέρειες, βλέπε Πίνακα S6).

Η

Για τον προσδιορισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των διαφόρων μεταναστευτικών παραμέτρων, εφαρμόσαμε το τεστ συσχέτισης Pearson σε όλα τα ΠΚΤ που παράγεται από ατάραχος κύτταρα (Εικόνα S2). Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε, για παράδειγμα, ότι το μήκος της γραμμής (μείζων λόγος άξονα και αξονική) συσχετίζεται αρνητικά με στερεότητα τροχιά, που δείχνει ότι η παραγωγή του επιμήκους κομμάτια από τα κύτταρα ελέγχου συσχετίζεται ιδιαίτερα με την πλευρική προεξέχων δραστηριότητα. Η ανάλυση αυτή εφαρμόζεται επίσης σε εκείνα τα κύτταρα που εκφράζουν τις διαφορετικές προμεταναστευτικές γονίδια, προκειμένου να καθοριστεί η ικανότητά τους να διαταράξει την φαινομενική αλληλεξάρτηση μεταξύ των διαφόρων μεταναστευτικών παραμέτρους. Αυτές οι αναλύσεις δείχνουν ότι, η υπερέκφραση του ΡΚΟζ, HOXB7, και ErbB3 μειωθεί η αμοιβαία σχέση μεταξύ του μήκους διαδρομής και τη σταθερότητα.

Όσον αφορά τις σχέσεις μεταξύ της αξονικής αναλογίας και τις διαστάσεις των long και short άξονες, τα κύτταρα ελέγχου δείχνουν η κυρίαρχη συνεισφορά του διαμήκους άξονα προς την αξία αξονική αναλογία, με τον μικρό άξονα ασκώντας μια περιορισμένη επίδραση. Σε κύτταρα που εκφράζουν FGF7 και ΡΚΟζ η αξονική αναλογία συσχετίστηκε κυρίως με τον κύριο άξονα, ενώ erbB3 και HOXB7 επηρεάζεται η αξονική σχέση με την αλλαγή του πλάτους γραμμής. Φαίνεται έτσι ότι η ενίσχυση της συνολικής κυτταρικής μετανάστευσης από διαφορετικούς προ-μεταναστευτικές γονιδίων μπορεί να επιτευχθεί με επιλεκτική ρύθμιση μιας ποικιλίας κυτταρικών δυναμικών χαρακτηριστικών, όπως κύτταρο πόλωση και τη δραστηριότητα προεξέχων μεμβράνης.

Συζήτηση

ο πρωταρχικός στόχος αυτής της μελέτης ήταν η ανάπτυξη ενός ποσοτικού προσδιορισμού για τη μετανάστευση των κυττάρων, η οποία θα μπορούσε να μετρήσει πολλαπλές μεταναστευτικά χαρακτηριστικά, και θα ήταν συμβατό με διαλογή υψηλής απόδοσης. Η σημαντική πειραματική πρόκληση που εμπλέκονται στο σχεδιασμό μιας τέτοιας ανάλυσης είναι η φαινομενική σύγκρουση μεταξύ της ταχείας απόκτησης του τεράστιου όγκου των δεδομένων για τη μετανάστευση, καθώς και την ανάγκη να αποκτήσει «υψηλή περιεκτικότητα» πληροφορίες σχετικά με τη μεταναστευτική συμπεριφορά πολλών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων και δυναμικά χαρακτηριστικά όπως η ταχύτητα μετανάστευσης και lamellipodial δραστηριότητα. Από τη συλλογή των άμεσων δυναμικές πληροφορίες σχετικά με τη μετανάστευση των κυττάρων είναι ασυμβίβαστη με υψηλή απόδοση, εμείς, ως εκ τούτου επέλεξε να διερευνήσει έμμεση, αλλά να αναπαραχθούν και ισχυρή, προσεγγίσεις για την απόκτηση αυτών των πληροφοριών. Προτείνουμε στο παρόν ότι λεπτομερής ανάλυση μορφομετρικών της ΠΚΤ που δημιουργούνται από μεμονωμένα κύτταρα που μεταναστεύουν μπορούν να παρέχουν τέτοια ποσοτική, μορφολογικά και προφανώς δυναμικά δεδομένα

Οι νέες πτυχές αυτής της μελέτης, που χρήζουν ειδικής συζήτησης είναι:. (I) η επιλογή των χαντρών ? (Ii) ο κατακερματισμός της τροχιάς και μορφομετρία? και (iii) στατιστική ανάλυση των δεδομένων. Η επιλογή των χαντρών για τη δοκιμασία ΠΚΤ βασίστηκε σε τρεις ιδιότητες του «τομέα της μετανάστευσης»: προβολή της τροχιάς (κατά κύριο λόγο επηρεάζονται από το μέγεθος των σφαιριδίων, με τη βέλτιστη διάμετρο σφαιριδίων των 300-400 nm)? ικανότητά τους να σχηματίζουν ένα ομοιογενές στρώμα (βέλτιστη με αλδεΰδη ή καρβοξυλιωμένο επιφάνειες? φτωχή με χάντρες θειικής-τροποποιημένη), και η ικανότητα να απομακρυνθεί με μεταναστεύοντα κύτταρα (βέλτιστη με carboxylated- και φτωχή με χάντρες αλδεΰδη τροποποιημένη). Αξίζει να σημειωθεί ότι η ευαισθησία των καρβοξυλιωμένων σφαιριδίων σε απομάκρυνση με μεταναστεύοντα κύτταρα συσχετίζεται αντίστροφα με την πυκνότητα επιφάνεια των ομάδων καρβοξυλικού, επιτρέποντας «λεπτή ρύθμιση» του στρώματος σφαιριδίου για τον συγκεκριμένο τύπο κυττάρου που θα δοκιμαστεί.

ΠΚΤ κατάτμηση και μορφομετρία παρέχονται σημαντικές γνώσεις σχετικά με τα βασικά χαρακτηριστικά της μεταναστευτικής διαδικασίας. Αυτές περιλαμβάνουν τη συνολική μεταναστευτική δραστηριότητα του κυττάρου, η οποία αντιστοιχεί στην καθαρή περιοχή ΠΚΤ? μετανάστευση πολικότητα, που αντιστοιχεί στο μήκος του κύριου άξονα της μετανάστευσης (ή την αξονική αναλογία)? και «πλευρικά» πεταλοειδή δραστηριότητα, μετρούμενη με τη σταθερότητα του κομματιού, μεταξύ άλλων αξιών. Με βάση αυτές τις μετρήσεις, διάφορες δυναμικές παράμετροι υπολογίστηκαν, συμπεριλαμβανομένου και ενός μέσου και αποτελεσματική ποσοστά μετανάστευσης, και πεταλοειδή δραστηριότητα. Φυσικά, η δυναμική πληροφορία, η οποία συνάγεται από τη στατική μορφολογία ΠΚΤ, είναι μάλλον έμμεση, αλλά τα δεδομένα υψηλής ανάλυσης [ειδικά η τραχύτητα των συνόρων τροχιά, που μετράται με Multiscale ανάλυση τμηματοποίησης [26]? (Σχήμα 1)], τα οποία θα μπορούσαν να συσχετιστούν με δυναμικές πληροφορίες, με βάση τις time-lapse μικροσκοπία βίντεο (Σχήμα 3). Μόλις υπολογίστηκε για κάθε κομμάτι, οι πολλαπλές παράμετροι θα μπορούσαν να συσχετιστούν με το άλλο, είτε σε κύτταρα ελέγχου, ή ακόλουθη χημική ή γενετική διαταραχή.

Για τους σκοπούς μας, η δοκιμασία ΠΚΤ χρησιμοποιήθηκε για να ανακαλύψουν νέα προμεταναστευτικές γονίδια σε ένα μητρικό καρκίνωμα που σχετίζονται με γονιδιακή βιβλιοθήκη. Η λογική που διέπει αυτή την προσέγγιση είναι ότι, παρά την προφανή μοριακή πολυπλοκότητα της διαδικασίας της μετανάστευσης των κυττάρων, μπορεί να υπάρχουν «κύριος γονίδια» που θα μπορούσε να προκαλέσει μεταναστευτικά χαρακτηριστικά σε ένα σταθμευμένο κυττάρων. Η μοναδική ικανότητα του προσδιορισμού ΠΚΤ έχουμε αναπτύξει για να αναδείξει και να ποσοτικοποιηθούν επιμέρους χαρακτηριστικά του μεταναστευτικού φαινότυπο, θα μπορούσε στη συνέχεια να συνδέσετε ένα δεδομένο προμεταναστευτικές γονιδίου σε συγκεκριμένα μεταναστευτικά μηχανισμούς. Τα νέα προμεταναστευτικές γονίδια εντοπίστηκαν εδώ περιλαμβάνουν: HOXB7, ErbB3, ΡΚΟζ και FGF7. Ενώ όλα αυτά τα γονίδια είναι γνωστό ότι είναι «σχετικά με τον καρκίνο», οι τρέχουσες σημεία μελέτη για την πιθανότητα ότι η συμβολή τους στην κακοήθη διαδικασία θα μπορούσε να σχετίζεται με φιλο-μεταναστευτική δραστηριότητα τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Παρασκευή επικαλυμμένα με σφαιρίδιο 96 φρεατίων πλάκες

Glass-πυθμένα 96-φρεατίων (Whatmann, Inc., Clifton, NJ, USA, Cat. # 7706 – 2370) επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, με 50 μΐ διαλύματος 10 μg /ml ινωδονεκτίνης διαλυμένο σε PBS (ινωδονεκτίνης, F-1141? Sigma Chemical Co., St Louis, ΜΟ, USA). Τα φρεάτια στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επικαλύφθηκαν με 340 nm λευκές χάντρες λατέξ πολυστυρενίου (Interfacial Dynamics Corporation-Molecular Probes Μικροσφαιρών Technologies, USA? Προϊόν δεν 2-300?. Batch ηο 1344).. Το εναιώρημα σφαιριδίων (3,2 ml) υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση για 5 λεπτά στα 20.800 χ g και το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε 4 ml PBS, μέχρις ότου διεσπάρησαν όλα τα ορατά συσσωματώματα σφαιριδίων. Η διαδικασία καθίζησης κατόπιν επαναλήφθηκε μία ακόμη φορά, μετά την οποία τα σφαιρίδια επαναιωρήθηκαν σε 7 ml PBS, σε μία τελική συγκέντρωση των 0,9

12 σωματίδια /ml. Δείγματα των 70 μΐ του εναιώρημα σφαιριδίων προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, η οποία είχε προ-επικαλυμμένη με ινονεκτίνη και επωάζονται στους 37 ° C για 2 ώρες, που ακολουθείται από ήπια έκπλυση με PBS (Χ 5) χρησιμοποιώντας ένα πλυντήριο πλάκας (Colombus Plus , Tecan, Ελβετία). Πριν από κύτταρο επιμετάλλωση, ο PBS αντικαταστάθηκε με 50 μΐ μέσου καλλιέργειας κατάλληλες για το συγκεκριμένο τύπο κυττάρου που χρησιμοποιείται στην δοκιμασία (βλέπε σχήμα S3).

Προετοιμασία κυττάρων για την δοκιμασία

ΠΚΤ

MCF7 (ATCC -HTB-22), κύτταρα MDA-MB-231 (ATCC-ΗΒΤ-26), και Β16-Ρ10 (ATCC-CRL-6475) καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM)? κύτταρα Η1299 (ATCC-CRL-5803) αναπτύχθηκαν σε RPMI-1640. Αμφότερα τα μέσα καλλιέργειας συμπληρώθηκαν με 10% FCS, 2 mM γλουταμίνη, 100 Διεθνείς Μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), και διατηρήθηκαν σε ένα 5% CO

2 υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C. Για τη δοκιμασία ΠΚΤ, 200-400 κύτταρα (σε 50 μΐ μέσου) καλλιεργήθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Ανάλογα με τις τυπικές διαστάσεις τροχιάς, όπως προσδιορίστηκε σε προκαταρκτικά πειράματα, ο αριθμός των κυττάρων επιστρώθηκαν και ο χρόνος επώασης ήταν βαθμονομημένο για να μεγιστοποιηθεί ο αριθμός των ενιαίο, μη τεμνόμενες κύτταρο κομμάτια. Τυπικά, 200-400 κύτταρα /φρεάτιο και 7 ώρες επώασης βρέθηκαν να είναι βέλτιστες παραμέτρους για τα περισσότερα κύτταρα.

Φαρμακολογική διαταραχές του σχηματισμού ΠΚΤ

Για τον προσδιορισμό των αποτελεσμάτων των διαφόρων φαρμακολογικών αναστολέων στην Η1299 κυτταρική γραμμή, τα κύτταρα απλώθηκαν και επωάστηκαν για μία ώρα, μετά την οποία έλαβαν θεραπεία είτε με 4 μΜ Latrunculin Α? 2.5 μΜ Νοκοδαζόλη? ή 100 ng /ml ΡΜΑ (φορβόλη 12-mirystate 13-acetate). Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν για επιπλέον 4 ώρες, σταθεροποιήθηκαν με 3% παραφορμαλδεΰδη και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Οι πλάκες είτε εξετάστηκαν αμέσως με τη βοήθεια ενός μικροσκοπίου αυτόματης εστίασης διαλογής, ή αποθηκεύονται στους 4 ° C για μετέπειτα επιθεώρηση.

Διαλογή για τα γονίδια που επάγουν μετανάστευση

Για διαλογή γονιδίων που επάγουν τη μετανάστευση, εμείς επιλεγεί 55 υποψήφια γονίδια από τη βιβλιοθήκη BC1000: (https://www.hip.harvard.edu/research/breast_cancer/index.htm), συναρμολογούνται στο Χάρβαρντ Ινστιτούτο της Πρωτεομικής χρησιμοποιώντας το λογισμικό λογοτεχνία εξόρυξης [27]. Αυτή η βιβλιοθήκη αποτελείται από μια συλλογή των cDNA πλήρους μήκους που είναι γνωστό ότι συνδέονται με την ανάπτυξη του καρκίνου του μαστού. Τα cDNA κλωνοποιήθηκε σε ένα puromycin- επιλέξιμο φορέα ρετροϊού (JP1520) [28] χρησιμοποιώντας το σύστημα Creator ™ ανασυνδυασμού (Clontech, Mountain View, CA). Τα 55 γονίδια που εξετάστηκαν (βλέπε πίνακα S5) επιλέχθηκαν τυχαία από αυτήν την βιβλιοθήκη και ήταν γενναιόδωρα παρέχονται από τον καθηγητή Joan Brugge (Τομέας Βιολογίας Κυττάρου, Harvard Medical School, USA). Γονίδια εισήχθησαν εντός των κυττάρων MCF7 με τη βοήθεια ρετροϊικής μόλυνσης. Κάθε κλώνος ελέγχθηκε για τις επιπτώσεις της στην κυτταρική μετανάστευση, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία της ΠΚΤ. Ως έλεγχοι, δημιουργήσαμε επίσης JP1520 GFP που εκφράζουν κύτταρα MCF7. Η δοκιμασία ΠΚΤ διεξήχθη σε πλάκες των 96 φρεατίων. Τετρακόσια κύτταρα ανά φρεάτιο ήταν seeded, και 8 φρεάτια ελέγχθηκαν για κάθε κλώνο. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 7 ώρες, και κατόπιν στερεώνεται χρησιμοποιώντας 3% PFA. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν με τη χρήση της αυτόματης εστίασης-διαλογής μικροσκόπιο.

Στατιστική Ανάλυση

Δεδομένου ότι η κατανομή των παραμέτρων τροχιάς εμφανίζει μη κανονικές κατανομές, χρησιμοποιήσαμε το εκατοστημόριο στατιστικό εργαλείο με τις εκτιμήσεις των παραμέτρων μεταβλητότητα. Για παράδειγμα, το 80

ο εκατοστημόριο για την περιοχή είναι η τιμή παρακάτω τα οποία βρίσκονται το 80% της περιοχής κομμάτια.

Οι διαφορές μεταξύ του ελέγχου και να αντιμετωπίζονται οι καλλιέργειες αξιολογήθηκαν για την σημαντικότητα χρησιμοποιώντας τα δύο-Δείγμα Kolmogorov- Smirnov καλοσύνη-of-fit test υπόθεση. Μια τιμή ρ & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

τεστ συσχέτισης του Pearson που διεξήχθη με τιμές που κυμαίνονται από 1 (μια τέλεια θετική γραμμική σχέση μεταξύ των δύο μεταβλητών ελέγχθηκαν) στο -1 (ένα τέλειο. αρνητική γραμμική σχέση). Μια τιμή ρ & lt? 0,0014 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1..

σύγκριση των ιδιοτήτων των διαφόρων χάντρες που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της ΠΚΤ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s001

(0,03 MB DOC)

Πίνακας S2.

Παράμετροι σχολιασμό

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s002

(0,03 MB DOC)

Πίνακα S3. Ανάλυση

ΠΚΤ για τις διάφορες κυτταρικές σειρές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s003

(0,03 MB DOC)

Πίνακας S4.

ΠΚΤ ανάλυση Η1299 κύτταρα υποβάλλονται σε επεξεργασία με διάφορα φάρμακα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s004

(0,03 MB DOC)

Πίνακας S5.

Λίστα δοκιμαστεί γονιδίων

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s005

(0,04 MB DOC)

Πίνακας S6.

ΠΚΤ ανάλυση των κυττάρων MCF7 υπερεκφράζουν ένα δεδομένο προμεταναστευτικές γονίδιο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s006

(0,05 MB DOC)

Εικόνα S1.

Ένα πρόγραμμα που περιγράφει την απόκτηση εικόνας και τη διαδικασία προβολής. (Α) Ένα πρότυπο μιας πλάκας 96 φρεατίων. (Β) Οι θέσεις των 52 πεδίων που μπορούν να αποκτηθούν μέσα σε ένα πηγάδι, χρησιμοποιώντας ένα στόχο 10 ×. (Γ) Ένα μοντάζ 4 × 4 εικόνες (1024 × 1024 pixels), που αντιστοιχεί στην αξιοσημείωτη περιοχή του πηγαδιού. (Δ) Μια εικόνα πλήρους ανάλυσης ενός πεδίου (512 × 512 pixels) στο πλαίσιο του μοντάζ (που σημειώνονται στο c). μπαρ κλίμακα:. 250 μm

doi: 10.1371 /journal.pone.0001457.s007

(2,03 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Auto-συσχέτιση μεταξύ των παραμέτρων της ΠΚΤ μορφομετρικών στα κύτταρα ελέγχου, και στα κύτταρα που εκφράζουν προμεταναστευτικές γονίδια. Auto-συσχέτιση μεταξύ των διαφόρων παραμέτρων μορφομετρικών υπολογίστηκε για τον έλεγχο (GFP-MCF7) βιβλιοθήκη, όπως επίσης και για τα κύτταρα που υπερεκφράζουν τα διάφορα προμεταναστευτικές γονίδια που περιγράφονται στο Σχήμα 5. Κάθε ορθογώνιο διαιρείται από μια λευκή γραμμή σε δύο τρίγωνα? κάθε τρίγωνο δείχνει την δοκιμή συσχετισμού ενός διαφορετικού υποψηφίου. Η π-αξία του κάθε αποτελέσματος συσχέτισης υποδεικνύεται κάτω από τον αριθμό βαθμολογίας συσχέτισης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s008

(4,16 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Σχηματική περιγραφή της προετοιμασίας των 96 φρεατίων για τη δοκιμασία ΠΚΤ

doi:. 10.1371 /journal.pone.0001457.s009

(0.96 MB ΔΕΘ)

Movie S1. σχηματισμό

ΠΚΤ από Η1299, απλώνονται σε σφαιρίδια πολυστυρενίου.