Αφηρημένο

Ιστορικό

Εμείς δημοσίευσε πρόσφατα το σπάνιο ανίχνευση του ιού που σχετίζονται με ιούς της λευχαιμίας των ποντικών ξενοτροπικά (XMRV) (1/105) στον καρκίνο του προστάτη (PCA) ιστό των ασθενών στη Βόρεια Ευρώπη με PCR. Η αμφιλεγόμενη συζήτηση σχετικά με τον ιό που ανιχνεύεται στο PCA ιστού, δείγματα αίματος από ασθενείς που πάσχουν από το σύνδρομο χρόνιας κόπωσης (CFS), καθώς και από έναν σημαντικό αριθμό υγιών μαρτύρων μας ώθησε να εμβαθύνει τις μελέτες μας για την ανίχνευση της μόλυνσης XMRV που εφαρμόζουν διαφορετικές μεθόδους ανίχνευσης (PCR, συγκαλλιέργεια και ανοσοϊστοχημείας [IHC]).

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) από 92 PCA και 7 υγιείς μάρτυρες απομονώθηκαν, PHA ενεργοποιείται και συν-καλλιεργούνται με LNCaP κύτταρα για μέχρι 8 εβδομάδες. Το υπερκείμενο αυτών των κυττάρων εφαρμόστηκε σε μια κυτταρική γραμμή ανταποκριτή, Derse-iGFP. Επιπλέον, οι PBMCs και συγκαλλιεργήθηκαν LNCaP κύτταρα ελέγχθηκαν για την παρουσία XMRV με PCR καθώς και η ανάλυση Western Blot. Ενώ όλοι οι PCR ενισχύσεις και τις αναλύσεις Western Blot ήταν αρνητικά για σημεία λοίμωξης XMRV, κύτταρα Derse-iGFP εμφανίζονται απομονωμένα GFP θετικά κύτταρα σε τρεις περιπτώσεις. Και στις τρεις περιπτώσεις η παρουσία XMRV δεν μπορούσε να επιβεβαιωθεί από την τεχνολογία PCR. Επιπλέον, πραγματοποιήσαμε XMRV συγκεκριμένες IHC στις τομές ιστών PCA. τομές ολόκληρου ιστού (n = 20), καθώς και μικροσυστοιχίες ιστού (ΤΜΑ), συμπεριλαμβανομένων 50 καλοήθη υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ), 50 χαμηλού βαθμού και 50 τμήματα PCA υψηλής ποιότητας και TMAs συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, ο καρκίνος του παχέος εντέρου και των φυσιολογικών ιστών χρωματίστηκαν με δύο XMRV ειδικοί αντιοροί. έκφραση πρωτεΐνης XMRV δεν ανιχνεύθηκε σε οποιαδήποτε τμήματα του καρκίνου συμπεριλαμβάνονται. Ένα ιστό ΒΡΗ εμφανίζεται XMRV ειδική έκφραση της πρωτεΐνης σε τυχαία απομονωμένα βασικά κύτταρα.

Συμπέρασμα

Δεν ήταν σε θέση να εντοπίσει με βεβαιότητα XMRV στο αίμα από τους ασθενείς PCA ή από υγιείς ελέγχους και δεν υπάρχει κανένα αποδεικτικό στοιχείο της έκφρασης της πρωτεΐνης XMRV στο PCA, τμήματα του καρκίνου του μαστού και του παχέος εντέρου ιστού δοκιμάζονται με χρώση IHC

Παράθεση:. Stieler K, Schindler S, Schlomm Τ, Hohn O, Bannert Ν, Simon R, et al. (2011) αριθ Ανίχνευση XMRV σε δείγματα αίματος και τομές ιστών από τον καρκίνο του προστάτη ασθενείς στη Βόρεια Ευρώπη. PLoS ONE 6 (10): e25592. doi: 10.1371 /journal.pone.0025592

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 7, Ιουνίου 2011? Αποδεκτές: 6 του Σεπτεμβρίου 2011? Δημοσιεύθηκε: 12 Οκτωβρίου 2011

Copyright: © 2011 Stieler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Επί του παρόντος, η ανίχνευση των Xenotropic ποντικού ιό της λευχαιμίας των σχετικών ρετροϊού (XMRV) σε ανθρώπινα δείγματα βιο είναι συζητείται αμφιλεγόμενα κυμαίνεται από XMRV να συνδέεται με δύο σημαντικές ανθρώπινες ασθένειες, σύνδρομο χρόνιας κόπωσης (CFS) [1], [2] και του καρκίνου του προστάτη (PCA) [3], [4] για να είναι οι άνδρες που δημιουργείται εργαστήριο πρόσμειξη λόγω διαβίβαση ξένου μοσχεύματος μέσω ποντίκια [5] – [18]

το 2006, XMRV έχει ταυτοποιηθεί σε προστατικό ιστό από ασθενείς με καρκίνο του προστάτη εξοικειωμένοι (PCA) που μεταφέρουν μια ομόζυγη μετάλλαξη στο εσωτερικό της. γονίδιο RNaseL (R462Q) [19]. Η συσχέτιση μεταξύ XMRV και PCA ενισχύθηκε σοβαρά από μελέτες που αποδεικνύουν την έκφραση της πρωτεΐνης XMRV, καθώς και την παρουσία αλληλουχιών XMRV σε έως και 26% όλων των περιπτώσεων PCA [3], [4], [20]. έκφραση της πρωτεΐνης XMRV ήταν κυρίως δει σε κακόηθες επιθήλιο προτείνοντας ένα πιο άμεσο ρόλο στην ογκογένεση. Ωστόσο, υπάρχουν πολλαπλές μελέτες σπανίως ή πλήρως μη ανίχνευση XMRV σε δείγματα καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιώντας PCR ή μεθόδων IHC [3], [4], [9], [21] – [26]. Πρόσφατα εντοπίσαμε XMRV σε χαμηλή συχνότητα (1%) σε σποραδικές δείγματα PCA από τη Βόρεια Ευρώπη χρησιμοποιώντας μεθόδους ενίσχυσης PCR και RNA που απομονώθηκε από κατεψυγμένα δείγματα ιστών [27]. Έκφραση της πρωτεΐνης XMRV, καθώς και η παρουσία των αλληλουχιών XMRV σε ποσοστό έως 26% του συνόλου των δειγμάτων που αναλύθηκαν PCA αποδείχθηκε το 2009 από την εφαρμογή ανοσοϊστοχημεία (IHC) ολόκληρων τμημάτων mount PCA με ένα ειδικό αντιορό αντι-XMRV [4], [20 ]. Ωστόσο, μια πρόσφατη έκθεση χρησιμοποιώντας Rauscher MLV gag αντιοροί που αναγνωρίζει επίσης πρωτεΐνη XMRV gag, δεν επιβεβαίωσε τα ευρήματα αυτά [24]. Η μελέτη από Schlaberg et al. μας ώθησε να επανεξετάσουμε τον επιπολασμό της XMRV σε δείγματα PCA με IHC αφού εστιακές λοιμώξεις δει από την IHC μπορεί να χαθεί σε ανάλυση PCR. Επιπλέον, έχουμε αξιολογήσει την παρουσία της έκφρασης πρωτεΐνης XMRV στα τμήματα των άλλων κακοηθειών, καθώς και φυσιολογικό ιστό από την IHC. Με τη χρήση του πρόσφατα δημοσιευμένη αντι-XMRV αντιορό [4], καθώς και ένα ειδικό αντιορό XMRV gag δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσουν XMRV gag ειδική χρώση των κυττάρων σε PCA ή άλλες καρκινικό ιστό. Ωστόσο, ένας καλοήθης υπερπλασία του προστάτη (ΚΥΠ) τμήμα εμφανίζεται σαφώς θετική χρώση κυττάρων με τη χρήση αντι-XMRV ορό gag k121.

Το 2009 XMRV εντοπίστηκε σε ποσοστό έως 68% των PBMC (μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος) δείγματα από ασθενείς με το σύνδρομο χρόνιας κόπωσης και 3-4% του ομάδα ελέγχου έδειξε σημάδια μόλυνσης XMRV [2]. δεδομένα PCR ενισχύθηκαν από κύτταρο εξαρτώμενη καθώς κύτταρο ελεύθερη μετάδοση του ιού από δείγματα αίματος ασθενών CFS σε κύτταρα δείκτη. Ωστόσο, αρκετές μελέτες που ακολούθησαν από άλλα εργαστήρια απέτυχαν να επιβεβαιώσουν τα δεδομένα PCR και δεν έχουν πειράματα μετάδοσης του ιού έχει αναπαραχθεί μέχρι σήμερα [6], [9], [10], [11], [13], [15], [17 ], [18], [28], [29], [30], [31]. Πρόσφατα, τα δείγματα αίματος από ασθενείς CFS έχουν αναφερθεί στο παρελθόν ότι περιέχουν ακολουθίες XMRV επανεξετάστηκαν, ωστόσο, ταυτοποιήθηκαν ως XMRV αρνητικά από τις στρατηγικές ενίσχυσης PCR και μέθοδοι ορολογικές [12], [32].

Νωρίτερα αυτό το έτος, ενώ αυτή τη μελέτη ήταν σε εξέλιξη, διάφορες δημοσιεύσεις που απευθύνονται τον κίνδυνο μολύνσεων από τα ίχνη του DNA ποντικού (τομές παραφίνης, κυτταρικές σειρές ή άλλες πηγές) [7], [13], [15] και ο κίνδυνος ψευδών θετικών PCR προϊόντα από κάποιους κιτ εμπορική ενίσχυση [17], [33]. Επιπλέον, Hue και οι συνεργάτες του ισχυρίζονται ότι λόγω της έλλειψης αλληλουχίας μεταβλητότητα των θραυσμάτων γονιδίου XMRV ασθενή απομονώσεις σε σχέση με μεταβλητότητα αλληλουχίας προσδιορίζονται σε μια XMRV θετική κυτταρική γραμμή 22Rv1, XMRV μπορούσε να είναι ένα εργαστήριο μολυσματικό παρά ένας αληθινός εξωγενές ανθρώπινο ιό [11 ]. Μια ισχυρή ένδειξη ότι XMRV είναι ένας ιός που κυκλοφορεί στον ανθρώπινο πληθυσμό είναι η ταυτοποίηση των περιοχών ιική ενσωμάτωση στο γονιδίωμα του ξενιστή [34]. Ωστόσο, πιο πρόσφατα ευρήματα δείχνουν ότι δύο θέσεις ενσωμάτωσης που δημοσιεύθηκε νωρίτερα είναι ταυτόσημες με θέσεις ενσωμάτωσης XMRV σε μία in vitro μολυσμένη κυτταρική γραμμή DU145 [35]. Επιπλέον, Paprotka και οι συνεργάτες παρέχουν αποδείξεις ότι XMRV προέρχεται από δύο ποντίκι ενδογενείς προ-ιούς που υποβλήθηκε ρετροϊική ανασυνδυασμού σε καλλιέργεια κυττάρων αφήνοντας έτσι να εννοηθεί ότι όλες οι ακολουθίες XMRV αναφερθεί μέχρι σήμερα ήταν πιο πιθανό να προέρχονται από αυτή την εκδήλωση της κυτταρικής καλλιέργειας [14]. Στην παρουσιαζόμενη μελέτη ασχοληθήκαμε την ανίχνευση XMRV και σχετικών αλληλουχιών MLV σε περιφερειακά κύτταρα αίματος των ασθενών με καρκίνο του προστάτη και υγιείς μάρτυρες υποκινούνται από την ανίχνευση XMRV στα κύτταρα του αίματος του 3-4% των υγιών [2] ελέγχων και υπόθεσή μας ότι XMRV αντιγραφής θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί λόγω της ανοσοκαταστολής που συνοδεύει PCA και εν συνεχεία ανιχνεύσιμη στο αίμα των ασθενών. Ένα σύνολο 100 δειγμάτων αίματος συμπεριλήφθηκαν στην μελέτη μας. PBMCs απομονώθηκαν, διεγείρονται και στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση γενωμικού DNA ή συγκαλλιέργεια πειράματα ακόλουθα δημοσιευμένα πρωτόκολλα [1], [2]. Επιπλέον, εκχυλίσματα πρωτεΐνης από ενεργοποιημένα PBMCs παρήχθησαν και αναλύθηκαν για έκφραση πρωτεΐνης XMRV. Δείχνουμε ότι PBMCs σε γενικές γραμμές μπορεί να είναι in vitro έχουν μολυνθεί με XMRV, καταλήγοντας σε 1-2% κύτταρα μολυσμένα η οποία μπορεί εύκολα να παρακολουθείται με PCR ή έκφραση πρωτεΐνης αναλύσεις επιβεβαιώνοντας έτσι δημοσίευσε πρόσφατα τα αποτελέσματα [10]. Αν και ιικά γονιδιώματα είναι ιδιαίτερα επεξεργασία λόγω περιορισμού Apobec, υπερκείμενο από XMRV μολυνθεί PBMCs μολύνει αποτελεσματικά μια κυτταρική γραμμή ρεπόρτερ, Derse-iGFP. Αυτή η κυτταρική γραμμή (που παράγεται από Vineet Ν KewalRamani, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Frederick, USA) εκφράζει αναφοράς GFP η οποία ενεργοποιείται από την έκφραση της ανάστροφης μεταγραφάσης. Παρά το γεγονός ότι η ευαισθησία όλων των τεχνικών που χρησιμοποιούνται στη μελέτη μας είναι αρκετά υψηλό, δεν αλληλουχίες XMRV ή ειδική πρωτείνη XMRV έκφραση ανιχνεύθηκε σε ενεργοποιημένα PBMCs. Είναι ενδιαφέρον, ανιχνεύσαμε σε υπερκείμενο από 3/67 ενεργοποιημένα PBMCs και 2/67 πειράματα συγκαλλιέργεια των PBMC με κύτταρα LNCaP, δραστηριότητα RT με αποτέλεσμα GFP θετικά κύτταρα Derse-iGFP, ωστόσο, δεν μπορέσαμε να σαφώς απόδειξη ότι αυτές οι PBMCs μολυνθεί με XMRV, δεν μπορεί να αποκλειστεί άλλες πηγές δραστηριότητα RT.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του ομοσπονδιακού κράτους του Αμβούργου (δεν . OB-052-04).

πληθυσμού Μελέτη και συλλογή του δείγματος. πληθυσμού της μελέτης και τη συλλογή του δείγματος

Τα δείγματα αίματος από 92 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη (ηλικίας 44-77) συλλέχθηκαν μία ημέρα πριν από ριζική προστατεκτομή. Τα κλινικά δεδομένα συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Επιπλέον, τα δείγματα αίματος από 7 άνδρες (ηλικίας 30-44) χωρίς οποιαδήποτε ένδειξη PCA συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Όλοι οι ασθενείς έδωσαν γραπτή συγκατάθεση για την επιστημονική χρήση των δειγμάτων αίματος? EDTA-αίματος από ασθενείς και υγιείς μάρτυρες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας χρησιμοποιώντας Ficoll (Biocoll, Biochrom L6715). Πρωτογενή μονοπύρηνα κύτταρα του αίματος (PBMCs) διαχωρίζονται και καλλιεργούνται όπως περιγράφεται παρακάτω.

Η

Οι κυτταρικές σειρές

Ο καρκίνος του προστάτη κυτταρική σειρά ανθρώπινου LNCaP (ATCC # CRL-1740), LNCaP DERSE- iGFP (ευγενώς από Vineet Ν KewalRamani, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Frederick, USA) και το XMRV θετικού ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρική γραμμή 22Rv1 (ATCC # CRL-2505) αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FCS, 5 % πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και L-γλουταμίνη. Χρονίως μολυσμένα κύτταρα LNCaP (XMRV) δημιουργήθηκαν με επιμόλυνση προϊικού DNA XMRV VP62 όπως δημοσιεύθηκε προηγουμένως [36] και διατηρήθηκε για αρκετές εβδομάδες. PBMC απομονώθηκαν από 10 ml EDTA αίμα και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Gibco) παρόμοια με κυτταρικές γραμμές καρκίνου εγκατεστημένος προστάτη, αλλά επιπλέον έχει συμπληρωθεί με ΡΗΑ (5 μg /ml, Thermo Fisher Scientific) και rhIL-2 (180 IU /ml, R & amp? D Systems).

πειράματα Συνκαλλιέργεια

1ml εναιωρήματος κυττάρων που περιέχουν 1 × 10

6-3 × 10

6 PBMCs ενεργοποιείται για 7 ημέρες προστέθηκε σε 2 × 10

5 LNCaP διατηρήθηκε σε 2 ml RPMI που περιέχει 8 μg /ml polybrene σε πλάκες 6 φρεατίων. Οι πλάκες φυγοκεντρήθηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C και 800 χ g. PBMCs αφαιρέθηκαν 24 ώρες αργότερα. LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν για 6-8 εβδομάδες. Τα κύτταρα χωρίστηκαν όταν φθάνει το 100% συρροή. Τα υπερκείμενα λήφθηκαν μετά από 6 και 8 εβδομάδες και εφαρμόζονται σε κύτταρα Derse-iGFP (βλέπε παρακάτω).

Για θετικοί έλεγχοι ανθρώπινα PBMC μολύνθηκαν με υπερκείμενο XMRV περιέχουν από κύτταρα LNCaP XMRV. Ενδείκνυται ποσότητα ιού που περιέχει το υπερκείμενο από κύτταρα που παράγουν XMRV (τουλάχιστον 80% συρροή) ήταν στείρα διήθηση και προστέθηκε σε 3 × 10

6 PBMCs προ-ενεργοποιημένο για δύο ημέρες. Οι πλάκες φυγοκεντρήθηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C και 800 χ g. XMRV περιείχε υπερκείμενο απομακρύνθηκε την επόμενη μέρα με καταβύθιση κυττάρων σε 200 χ g, πλύση τους με 10 ml PBS (Gibco) και τη διάδοση μετά από ένα επιπρόσθετο στάδιο φυγοκέντρησης σε μια νέα πλάκα 6 φρεατίων σε 2 ml RPMI που περιέχει ΡΗΑ και rhIL-2. PBMCs καλλιεργήθηκαν για 7 ημέρες πριν από την ανάλυση υπερκειμένου, συν-καλλιέργεια, νουκλεϊκών οξέων και εκχύλιση των πρωτεϊνών.

μόλυνση χρησιμοποιώντας ικανό αντιγραφής XMRV

XMRV VP62 προϊικού DNA διαμολύνθηκε σε LNCaP κύτταρα για την παραγωγή ιού που περιέχει υπερκειμένου όπως περιγράφηκε προηγουμένως [34], [36].

PCR

Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από PBMCs χρησιμοποιώντας Qiagen QIAamp kit mini και αποθηκεύεται στους 4 ° C. Οι συγκεντρώσεις νουκλεϊκών οξέων προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Nanodrop (Peqlab). Διαφορετικές ένθετη PCRs αλληλουχιών στόχευσης gag και env διεξήχθησαν όπως δημοσιεύθηκαν πρόσφατα [1], [3], [19], με τη χρήση 650 ng εκμαγείο DNA ανά αντίδραση. Gag έξω αστάρι: 419F 5′-ATCAGTTAACCTACCCGAGTCGGAC-3 ‘, 5′-1154R GCCGCCTCTTCTTCATTGTTCTC-3′? μέσα αστάρι: NP116F 5’-CATGGGACAGACCGTAACTACC-3 ‘και NP117R 5′-GCAGATCGGGACGGAGGTTG-3’. Για τον προσδιορισμό της ευαισθησίας του Gag PCR αρχικά δημοσιεύθηκε από Urisman et al. εφαρμόστηκαν οι ακόλουθοι εκκινητές: gag του 5′-CGCGTCTGATTTGTTTTGTT-3 ‘, 5′-GAG OR CCGCCTCTTCTTCATTGTTC-3′, 5’-GAG IF TCTCGAGATCATGGGACAGA-3 ‘και 5′-GAG IR AGAGGGTAAGGGCAGGGTAA [19]. Το env PCR διεξήχθη όπως δημοσιεύθηκε πρόσφατα [3] χρησιμοποιώντας τα ζεύγη εναρκτήρα ακόλουθες F 5’-ACCAGACTAAGAACTTAGAACCTCG-3 ‘, R5′-AGCTGTTCAGTGATCACGGGATTAG-3′, 5’-IF GAACAGCATGGAAAGTCCAGCGTTC-3 ‘και 5′-IR CAGTGGATCGATACAGTCTTAGTCC-3′ . Η ακεραιότητα των δειγμάτων DNA και την παρουσία υποθετικού inhibiters ελέγχονταν με ενίσχυση GAPDH, F 5’- GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3 ‘και R 5′- GAAGATGG TGATGGGATTTC-3’.

Western Blot

τα κυτταρολύματα παράχθηκαν χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 1% Triton-X 100 και μείγμα αναστολέα πρωτεάσης (Roche). Ειδικές ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα Εην Rauscher 77S85 (δωρεά του C. Stocking, Heinrich-Pette Institute, Αμβούργο, Γερμανία), XMRV ειδικά πολυκλωνικά κουνελιού Gag k121 αντιορό και Ρ30-Gag υπερκείμενο υβριδώματος αναγνωρίζοντας από CRL-1912 κύτταρα (ATCC) . Ίσες ποσότητες πρωτείνης ανά λωρίδα διασφαλίστηκαν με mAb αντίσωμα ακτίνης 1501 (Chemicon) επώαση αντι-ανθρώπινο. Για την ανίχνευση των σωματιδίων XMRV σε υπερκείμενα κυτταρικής καλλιέργειας, στείρο μέσο καλλιέργειας διηθείται των μολυσμένων κυττάρων υπερφυγοκεντρήθηκε 1 ώρα, 110.000 χ g στους 4 ° C (Beckman SW60Ti). Το σφαιρίδιο του υπερκειμένου 11ml επαναιωρήθηκε σε 10 μΙ PBS και αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση.

τομές παραφίνης γραμμή κυττάρων και TMAs

1 × 10

7 κύτταρα (LNCaP, LNCaP χρονίως μολυνθεί με XMRV , 293Τ, 293Τ χρονίως μολυνθεί με XMRV και SC1 κύτταρα ποντικού) σταθεροποιήθηκαν για 20 h σε 10% φορμαλίνη ρυθμισμένη με φωσφορικό, ενσωματωμένα σε άγαρ και σε επεξεργασία για να Παραφίνη [37].

Μια προϋπάρχουσα ΤΜΑ περιέχουν ιστό προστάτη ( 50 χαμηλού PCA βαθμού, 50 υψηλής ποιότητας PCA και 50 της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΚΥΠ)) χρησιμοποιήθηκε για IHC.

Immunhistochemistry

Διαφάνειες με τομές παραφίνης των ασθενών με καρκίνο του προστάτη αρχικά αποπαραφινοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ξυλόλιο. Για αντιγόνο ανάκτηση τμήματα θερμάνθηκαν 4 × 2 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού χρησιμοποιώντας ένα φούρνο μικροκυμάτων (650W) και στη συνέχεια ψύχεται σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Δέσμευση διεξήχθη για 30 λεπτά σε RT με ορό χοίρου 10% σε ρυθμιστικό αραίωσης αντισώματος (Dako). Στη συνέχεια ενδογενή βιοτίνη έχει αποκλειστεί χρησιμοποιώντας αβιδίνη /βιοτίνη Kit (Dako). Πρωτογενής αντίσωμα (αραιωμένο σε ρυθμιστικό αραίωσης αντισώματος με 2% ορό των χοίρων, αντι-XMRV 1:7500? XMRV αντι-gag k121 1:5000) επωάστηκε για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου σε υγρό θάλαμο. Οι έλεγχοι είτε επικαλύπτονται με την αντίστοιχη προ του ορού (ίδια αραίωση) ή μόνο με ρυθμιστικό διάλυμα αραίωσης αντισώματος με 2% ορό των χοίρων. Η επώαση με το δευτερεύον αντίσωμα – σημασμένο βιοτίνη /στρεπταβιδίνη – διεξήχθη για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Για μια μεταγενέστερη ανίχνευση των δεσμευμένων αντισωμάτων επισημασμένα τμήματα καλύφθηκαν με διάλυμα αλκαλικής φωσφατάσης (Dako, AK 5000) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. διάλυμα χρώσης IHC που περιέχει λεβαμισόλη για να αναστείλει την ενδογενή αλκαλική φωσφατάση προστέθηκε στα πλακίδια για 15-20 λεπτά, ενώ αντιχρωματισμός διεξήχθη με διαλύματα hamin Mayers. Ο ορός αντι-XMRV παρασχέθηκε ευγενώς από τον Ila Singh (Πανεπιστήμιο της Γιούτα, ΗΠΑ).

Αποτελέσματα

έκφραση της πρωτεΐνης XMRV στο PCA ιστού με μεθόδους ανοσοϊστοχημείας

Το 2009, η διαπίστωση του 23% του PCA τμήματα θετικά για την έκφραση της πρωτεΐνης XMRV έχει αναφερθεί [4]. έκφραση της πρωτεΐνης XMRV οποία στην πλειοψηφία των περιπτώσεων εντοπιστεί στο επιθήλιο του όγκου συσχετίζεται έντονα με υψηλότερους βαθμούς Gleason. Είναι ενδιαφέρον ότι, τα δεδομένα έκφρασης πρωτεΐνης δεν συσχετίστηκε με τα αποτελέσματα της PCR. Μια υποθετική εξήγηση είναι λίγες εστιακό μολυσμένα κύτταρα XMRV στον προστάτη που είναι δύσκολα ανιχνεύσιμες με PCR χρησιμοποιώντας DNA από ολόκληρα τμήματα mount ιστού ως πρότυπο. Ωστόσο, τα ευρήματα αυτά δεν επιβεβαιώθηκαν από μια άλλη μελέτη [24]. Να συμβάλει στην εξήγηση των διαφορών που εξετάστηκαν ολόκληρα τμήματα PCA καθώς TMAs χρησιμοποιώντας την πρόσφατα δημοσιευθείσα ορού αντι-XMRV [4] και ένα πολύκλωνο αντι-XMRV gag στον ορό (gag k121).

Και οι δύο οροί έχουν δοκιμαστεί σε Western Blot αναλύσεις με gag k121 ορό αναγνωρίζουν εξειδικευμένα ξενοτροπικών πρωτεΐνη gag ενώ εμφανίζει καμία διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με οποιεσδήποτε κυτταρικές πρωτεΐνες. Σε αντίθεση ο ορός αντι-XMRV [4] αναγνωρίζεται επίσης κυτταρικές πρωτεΐνες σε μη μολυσμένα γραμμές του ανθρώπου και των κυττάρων ποντικού (συμπληρωματική Εικόνα S1). Δημιουργήσαμε τομών παραφίνης αντιπροσωπεύει ανθρώπινες κυτταρικές σειρές 293Τ, LNCaP, και οι δύο κυτταρικές γραμμές που έχουν μολυνθεί με XMRV και ένα SC1 κυτταρική σειρά ποντικού. Αμφότερες οι αντιοροί αναγνωρίζουν πρωτεΐνη XMRV κυττάρων που εκφράζουν σε τομές παραφίνης δείχνουν κοκκώδη χρώση του κυτταροπλάσματος (Εικόνα 1). Αριθ χρώση των μη μολυσμένων κυττάρων και καμία χρώση των κυττάρων ποντικού SC1 ανιχνεύθηκε. Ένα σύνολο 100 PCA (χαμηλής ποιότητας και υψηλής ποιότητας PCA) και 50 BPH εκπροσωπούνται στο ΤΜΑ, καθώς και 10 μεγάλα τμήματα του καρκίνου του προστάτη (με υψηλή βαθμολογία Gleason) αναλύθηκαν με ορό gag k121 (Πίνακας 2). Επιπλέον, ένα ΤΜΑ περιέχουν μαστού, του παχέος εντέρου και του καρκίνου του προστάτη καθώς επίσης και διάφορα κανονικούς ιστούς δοκιμάστηκε για έκφραση πρωτεΐνης XMRV. Κάθε κηλίδωση IHC ελέγχθηκε με τη συμπερίληψη θετικών μαρτύρων (τομές παραφίνης των κυτταρικών γραμμών) και αρνητικοί μάρτυρες (χωρίς προσθήκη πρώτου αντισώματος) όπως επίσης και υψηλότερες αραιώσεις του πρώτου αντισώματος. Αριθ χρώση τομών του καρκίνου παρατηρήθηκε καθώς και η πλειονότητα των ιστών ελέγχου ήταν αρνητικά για χρώση gag k121. Μόνο ένα τμήμα της ΒΡΗ εμφανίζεται πολύ λίγα τυχαία βασικά κύτταρα χρωματίζονται θετικά με αντι-gag ορό k121 (Σχήμα 2). Κανένα από τα ΤΜΑ ελέγχθηκε με τον ορό αντι-XMRV αφού υψηλό υπόβαθρο λόγω της διαδικασίας παραγωγής TMA έχει παρατηρηθεί.

τομές παραφίνης των array κυτταρική γραμμή που περιέχει μολυσμένες κυτταρικές γραμμές XMRV καθώς και μη μολυσμένα κυτταρικές γραμμές ήταν χρωματίστηκαν για έκφραση πρωτεΐνης XMRV χρησιμοποιώντας ορό αντι-XMRV (Α) ή αντι-gag ορό κουνελιού πολυκλωνικό k121 (Β). Τα μεγαλύτερα μεγεθύνσεις εμφανίζεται για κύτταρα μολυσμένα XMRV, καθώς και για ένα άγριους κυτταρική γραμμή ποντικού, SC1.

Η

1/50 ΒΡΗ παρατηρήθηκαν τυχαία θετικά χρωματισμένα κύτταρα, τα οποία θα μπορούσαν να τα βασικά κύτταρα με βάση την εντόπιση τους στον προστάτη.

η

Ενεργοποιημένο PBMCs μπορεί να μολυνθεί με XMRV, ωστόσο αντιγραφή XMRV περιορίζεται σε PBMCs.

Μετά την υπόθεση δημοσιεύθηκε από Lombardi et al, ότι XMRV μπορεί να ανιχνευθεί σε PBMCs από μέχρι 67% των ασθενών CFS, καθώς και μέχρι και σε 4% των υγιών μαρτύρων [2] σκοπεύαμε να ενεργοποιήσει PBMCs από ασθενείς με PCA και ασθενείς της ομάδας ελέγχου και της οθόνης για μόλυνση XMRV εφαρμόζουν διαφορετικές μεθόδους. Ιδρύσαμε το πρώτο μεθόδους μας ανίχνευσης XMRV σε PBMCs που έχουν in vitro έχουν μολυνθεί με ιικό υπερκείμενο που περιέχει VP62 XMRV. Προιικού DNA χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή XMRV λοιμώδη υπερκείμενα σε LNCaP κύτταρα, τα οποία υποστηρίζουν σθεναρά την αντιγραφή XMRV λόγω της ισχυρής ενεργοποίησης του LTR, καθώς και η έλλειψη ρετροϊικών περιορισμός παραγόντων έκφραση Apobec 3G [36], [38] – [41]. ΡΗΑ ενεργοποιημένα PBMCs ήταν in vitro έχουν μολυνθεί με τις υποδεικνυόμενες ποσότητες ιικών υπερκειμένου (Σχήμα 3), τα οποία καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία IL2 για άλλες 7 d. Ιός που περιέχει υπερκείμενο στη συνέχεια υποβλήθηκε σε υπερφυγοκέντρηση και ιικά σφαιρίδια (Σχήμα 3Α), καθώς και κυτταρικής λύσης (Σχήμα 3Β) από τα μολυσμένα PBMCs αναλύθηκαν με Western Blotting εξασφαλίζοντας την έκφραση συγκεκριμένων πρωτεϊνών XMRV. Με βάση πειράματα Western Blot χρησιμοποιώντας χρονίως μολυσμένα κύτταρα LNCaP αραιώνεται με την υποδεικνυόμενη αριθμό των κυττάρων των μη μολυσμένων κυττάρων 293Τ (Σχήμα S2) μπορούμε να υπολογίζουμε ότι περίπου το 1-2% του PBMCs έχουν μολυνθεί με XMRV. Μόνο εάν μολύνουν PBMCs με υψηλό ιικό τίτλους ανιχνεύσαμε αποτελεσματικά XMRV στο ιικό σφαιρίδιο μετά υπερφυγοκέντρηση και η ανάλυση Western Blot (Σχήμα 3Α). Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από αυτά τα in vitro XMRV μολυνθεί PBMCs ήταν θετικό για αλληλουχίες XMRV με PCR χρησιμοποιώντας 650 ng γονιδιακού DNA και δύο διαφορετικά σύνολα εκκινητών που στοχεύουν gag και env (Σχήμα 4Α και το Σχήμα S3). Ευαισθησία όλες τις αντιδράσεις PCR υποδεικνύεται στο συμπληρωματικό σχήμα S4 με όλα PCR ανίχνευση 1-10 μολυσμένα κύτταρα σε ένα φόντο από 10

6 μη μολυσμένα κύτταρα.

PBMCs από δύο διαφορετικούς δότες απομονώθηκαν, συνενώθηκαν, ΡΗΑ διεγερμένα και στη συνέχεια μολύνθηκαν με τις υποδεικνυόμενες ποσότητες του υπερκείμενου XMRV περιέχει (λωρίδα 1-5). Western Blot ανάλυση του κυτταρολύματος από μολυσμένα PBMCs διεξήχθη 7 d παρελθόν λοίμωξη (Β). Το υπερκείμενο των μολυσμένων PBMCs εμπλουτίστηκε για σωματίδια ιού με υπερφυγοκέντρηση και χρωματίστηκαν για έκφραση CA (Α). (C) 500 μΐ XMRV υπερκείμενο που περιείχε προήλθε από PBMCs που φαίνεται στα Α και Β χρησιμοποιήθηκε για να μολύνει κύτταρα Derse-iGFP που αναλύθηκαν ως προς την έκφραση GFP 7 d παρελθόν μόλυνση με FACS. Οι τίτλοι υποδεικνύονται ως GFP μολυσματικές μονάδες /ml. (Δ) Η μόλυνση των κυττάρων Derse-iGFP είναι 100fold αυξάνεται κατά συγκαλλιέργεια των μολυσμένων PBMCs (φαίνεται στο (Α)) με κύτταρα LNCaP για 7 d, SN κυττάρων LNCaP στη συνέχεια εφαρμόστηκε σε κύτταρα Derse-iGFP, τα οποία αναλύθηκαν με FACS 5 δ πίν.

Η

(Β) κύτταρα Derse-iGFP μολύνθηκαν με 500 μΐ υπερκείμενο από 22Rv1 κύτταρα, ψευδο μολυσμένα κύτταρα ή κύτταρα LNCaP συν-καλλιεργήθηκαν με XMRV μολυσμένα PBMCs για 14 d. 72 ώρες μετά τη μόλυνση των κυττάρων Derse-iGFP παρακολουθήθηκαν για GFP θετικά κύτταρα με μικροσκόπιο.

Η

Συνκαλλιέργεια της XMRV μολυσμένων PBMCs με LNCaP κύτταρα αυξάνει σημαντικά την ευαισθησία της ανίχνευσης XMRV.

Derse-iGFP κύτταρα εκτέθηκαν σε διηθημένο υπερκείμενο καλλιέργειας από μολυσμένα XMRV PBMCs. 500 μΐ υπερκείμενο προστέθηκε σε 5 × 10

4 κύτταρα Derse-iGFP που βαθμολογήθηκαν για έκφραση GFP 7 d ρ.ί. με μικροσκοπία και ανάλυση FACS (Σχήμα 3C). Σε γενικές γραμμές, υπερκείμενο ιού από PBMCs είναι μολυσματική, ωστόσο, μόνο πολύ λίγα θετικά κύτταρα GFP ανιχνεύτηκαν. Είναι ενδιαφέρον ότι, αν cocultivate τις XMRV μολυνθεί PBMCs με LNCaP κύτταρα για 5 ημέρες, συγκομιδή του υπερκειμένου και reinfect κύτταρα Derse-iGFP με φιλτραρισμένο υπερκείμενο, η ευαισθησία της ανίχνευσης XMRV χρησιμοποιώντας κύτταρα Derse-iGFP ήταν 100fold αυξημένη Εικόνα 3D και στην Εικόνα 4Β.

ΜΚΠΑ των ασθενών PCA είναι αρνητική για την ανίχνευση XMRV με ανάλυση PCR

με αυτή την προσέγγιση μπορούμε απομονώνονται PBMC από 92 ασθενείς PCA και 7 υγιείς εθελοντές με κλίση Ficoll? Το απομονωθέν PBMCs ΡΗΑ ενεργοποιημένα και καλλιεργήθηκαν παρουσία IL-2 για 7 ημέρες. PBMCs υποβλήθηκαν σε διαφορετικές δοκιμασίες, όπως περιγράφει στο Σχήμα 5Α: γονιδιωματικό απομόνωση DNA που ακολουθείται από XMRV ειδική ένθετη PCR εφαρμόζοντας δύο δημοσιευμένες στρατηγικές XMRV PCR [1], [3], [19]? συγκαλλιέργεια των ενεργοποιημένων PBMCs με κύτταρα LNCaP για 8 εβδομάδες με επακόλουθη μόλυνση των κυττάρων Derse-iGFP χρησιμοποιώντας υπερκείμενο 6 εβδομάδες και 8 εβδομάδες μετά την συγκαλλιέργεια. Εντοπισμός των διαφορετικών ομάδων εναρκτήρα που χρησιμοποιείται παρουσιάζεται στην Εικόνα S3 και την ευαισθησία των διαφόρων PCRs XMRV αντανακλάται στο Σχήμα S4. Η ακεραιότητα του γενωμικού DNA σε συνδυασμό με την απουσία θεωρούμενων αναστολέων PCR διασφαλίστηκε με ενίσχυση GAPDH (Σχήμα S4). Η καλλιέργεια PBMCs, τα παρασκευάσματα DNA και η ενίσχυση PCR διεξήχθησαν στα εργαστήρια του Ινστιτούτου Heinrich-Pette όπου δεν διεξήχθησαν άλλες μελέτες XMRV. Επιπλέον, όλοι οι ένθετες PCRs για την ανίχνευση αλληλουχιών XMRV χρησιμοποιώντας δύο διαφορετικά ζεύγη εκκινητών που στοχεύουν gag, τόσο που δημοσιεύθηκε πρόσφατα, καθώς και ένα env PCR διέτρεξαν από δύο χειριστές χρησιμοποιώντας 650 ng γονιδιωματικού DNA ως μήτρα. Όλα τα δείγματα DNA βρέθηκαν να είναι σταθερά αρνητικά (Πίνακας 3). PCR αντιδράσεις συνήθως ελέγχονται για μόλυνση ποντικού χρησιμοποιώντας εναρκτήρες που κατευθύνονται έναντι ρετροτρανσποζόνια, εντός της εγκεφαλικής δεξαμενής ένα σωματίδιο (ΙΑΡ), όπως δημοσιεύθηκε πρόσφατα [15]. Καμία από τις αντιδράσεις PCR ήταν θετικό για τις αλληλουχίες DNA ποντικού (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τη διαλογή XMRV σε ΜΚΠΑ ασθενών PCA και υγιείς μάρτυρες. (Β) κύτταρα Derse-iGFP 72 ώρες ρ.ί. με SN από κύτταρα LNCaP συν-καλλιεργήθηκαν για 8 εβδομάδες με προερχόμενα ασθενή PBMCs (άνω πλαίσια). Οι κατώτεροι πίνακες εμφανίζουν τα κύτταρα Derse-iGFP 72 ώρες μετά τη μόλυνση με SN από ασθενή που προέρχεται PBMCs που ενεργοποιήθηκαν με ΡΗΑ για 7δ.

Η

67 δείγματα PBMC συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα LNCaP για έως 8 εβδομάδες και SN των κυττάρων LNCaP εφαρμόστηκε στο ρεπόρτερ κυτταρική σειρά Derse-iGFP. Αυτή η κυτταρική γραμμή φέρει έναν φορέα MLV, η οποία οδηγεί σε έκφραση ενός ανταποκριτή GFP εάν αντίστροφης μεταγραφάσης εκφράζεται. 72 ώρες ρ.ί. κύτταρα Derse-iGFP παρακολουθήθηκαν για έκφραση GFP με μικροσκοπία. Από 67 δείγματα υπερκείμενου από PBMCs καλλιεργήθηκαν με κύτταρα LNCaP, δύο κατέληξε σε 2-3 GFP θετικά κύτταρα σε 5 × 10

4 κύτταρα (Σχήμα 5Β). Δεν παρατηρήσαμε μια αύξηση του GFP θετικών κυττάρων συναρτήσει του χρόνου δείχνει ότι δεν υπήρχε εξάπλωση της ιογενούς λοίμωξης. Είναι ενδιαφέρον ότι το υπερκείμενο των ενεργοποιημένων PBMCs από αυτούς τους δύο ασθενείς χωρίς συγκαλλιέργεια οδήγησε επίσης σε 1-2 GFP θετικά κύτταρα Derse-iGFP ανά φρεάτιο. Σε μία περίπτωση έγιναν δύο ανεξάρτητες απομονώσεις PBMC από τον ίδιο ασθενή (# 99 και # 100), οι οποίες και οι δύο είχαν ως αποτέλεσμα 1-2 GFP θετικά κύτταρα Derse-iGFP. Ωστόσο, και οι δύο απομονώσεις πραγματοποιήθηκαν την ίδια ημέρα από τον ίδιο χειριστή. PCR από LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν με PBMCs από αυτούς τους δύο ασθενείς δεν οδήγησε στην ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών XMRV καθώς ήμασταν σε θέση να τον πολιτισμό και την επέκταση των GFP θετικών κυττάρων Derse-iGFP για τις επόμενες αναλύσεις.

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη έχουμε εξετάσει την ανίχνευση XMRV σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη με τη μελέτη διαφορετικών διαγνωστικών δειγμάτων βιολογικών για την παρουσία XMRV ή σχετικών αλληλουχιών MLV. Ειδικότερα, αναλύσαμε δείγματα ιστών PCA καθώς και τμήματα ιστού από άλλες κακοήθειες και φυσιολογικούς ιστούς για έκφραση πρωτεΐνης XMRV με IHC. Επιπλέον, PBMCs από 92 PCA και 7 υγιείς μάρτυρες υποβλήθηκαν σε διαλογή για την παρουσία αλληλουχιών XMRV και ανάκτηση του μολυσματικού ιού. PBMCs ενεργοποιήθηκαν με ΡΗΑ, καλλιεργήθηκαν για έως 8 εβδομάδες και παρουσία XMRV εξετάστηκε είτε ένθετη PCR που στοχεύουν δύο διαφορετικές περιοχές XMRV, Western Blot ανάλυση χρησιμοποιώντας διαφορετικά αντισώματα αντι-XMRV ή μόλυνση των κυττάρων Derse-iGFP εφαρμογή υπερκείμενο από ενεργοποιημένα PBMCs ή υπερκείμενο από LNCaP κύτταρα καλλιεργήθηκαν με PBMCs για έως 8 εβδομάδες.

Δεν ήταν σε θέση να αποδείξει με βεβαιότητα ότι οι ακολουθίες XMRV μπορεί να ανιχνευθεί σε ενεργοποιημένα PBMCs των ασθενών PCA αν και σε δύο ασθενείς GFP θετικά κύτταρα Derse-iGFP εντοπίστηκαν. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις αναλύσεις επακόλουθη PCR ενεργοποιημένων PBMCs καθώς συνκαλλιεργημένα LNCaP κύτταρα ήταν αρνητικά για αλληλουχίες XMRV καθώς δεν βρήκαμε έκφραση πρωτεΐνης XMRV στα τμήματα PCA ενός από αυτούς τους ασθενείς.

δημοσιευθεί προηγουμένως ότι XMRV αλληλουχίες είναι μόνο σπανίως ανιχνεύονται στη Γερμανία χρησιμοποιώντας cDNA που παράγεται από RNA PCA ιστό ενισχύεται με PCR [27]. Παρόμοια αποτελέσματα για μια μελέτη στις ΗΠΑ έχουν πρόσφατα δημοσιευθεί από Switzer et al., [26]. Ωστόσο, υπάρχουν πολλές μελέτες δεν τον εντοπισμό τυχόν ακολουθίες XMRV στο PCA ιστών, καθώς και υπάρχουν μελέτες με υψηλότερο επιπολασμό XMRV στο PCA [3], [9], [21] – [24], [31], [42] . Λαμβάνοντας υπόψη τη δυνατότητα εστίασης λοίμωξης XMRV στον προστάτη που μπορεί να χαθεί από ενίσχυση PCR οφείλεται μόνο σε μια μειοψηφία των κυττάρων που έχουν μολυνθεί ιδρύσαμε χρώση IHC χρησιμοποιώντας τη δημοσιευμένη ορού αντι-XMRV και μια XMRV συγκεκριμένο ορό αντι-gag. Εμείς απέτυχαν να ανιχνεύσουν έκφραση πρωτεΐνης XMRV σε PCA ιστού, τον καρκίνο του μαστού ή καρκίνου του κόλου ιστών, καθώς και τα περισσότερα ιστός ελέγχου (συμπεριλαμβανομένων 10 τμήματα το καθένα: επινεφρίδια, κόλον, το ενδομήτριο, επιδιδυμίδα, καρδιά, νεφρό, πνεύμονα, πάγκρεας, πλακούντα, παρωτίδα , σπλήνα, στομάχι, γραμμωτών μυών, θύμο, αμυγδαλή, και όρχεις) δεν έδειξε καμία θετική χρώση για gag k121 ορού. Είναι ενδιαφέρον ότι, χρησιμοποιώντας το αντι-gag ορό k121 ανιχνεύσαμε 1/50 τμήματα ΚΥΠ θετικά για έκφραση πρωτεΐνης XMRV. Η έκφραση της πρωτεΐνης ταυτοποιήθηκε σε λίγες μεμονωμένες βασικά κύτταρα στο επιθήλιο του προστάτη. Βασικά κύτταρα είναι απούσα στο PCA, υποστηρίζοντας το γεγονός ότι XMRV πιθανότατα δεν εμπλέκεται άμεσα στην ανάπτυξη του PCA. Ο μικρός αριθμός των ολόκληρα τμήματα ιστού mount εξετάζονται θα μπορούσε να εξηγήσει τη διαφορά μεταξύ των ευρημάτων μας και παλαιότερα ευρήματα από Schlaberg et al. [4]. Εμείς βάφονται μόνο δέκα ολόκληρα τμήματα ιστού mount με δύο αντιοροί, ο ορός αντι-XMRV [4] δεν είχε χρησιμοποιηθεί σε τμήματα TMA λόγω της υψηλής χρώσης υποβάθρου. Aloia et al. και Sakuma et al. τόσο συζητήσει μια διασταυρούμενη αντιδραστικότητα των αντι-XMRV ορού με ανθρώπινη πρωτεΐνη αντιγόνα με αποτέλεσμα IHC θετική χρώση στα τμήματα PCA [16], [24]. Έχουμε εντοπίσει κάποια διασταυρούμενη αντιδραστικότητα με τη δημοσιευμένη ορό αντι-XMRV σε κηλίδες Western ανάλυση κυτταρολύματα από τα μολυσμένα και μη μολυσμένα κύτταρα, ωστόσο δεν υπήρχε φόντο παρατηρήθηκε σε τομές παραφίνης των κυτταρικών γραμμών ή σε ολόκληρα τμήματα του PCA ιστού χρησιμοποιώντας ορό στις ενδεικνυόμενες αραιώσεις . Αρνητική χρώση IHC δεν αποκλείει τη δυνατότητα των λίγων κυττάρων που φέρουν XMRV ακολουθίες προϊού που θα μπορούσαμε να χάσουμε από ενίσχυση PCR. Εμείς δεν εφαρμόζει την τεχνολογία FISH DNA για την ανίχνευση ολοκλήρωσης προϊική XMRV στον ανθρώπινο ιστό. Αξιολόγηση των θετικών σημάτων FISH σε 0,1% ή λιγότερο των κυττάρων ειδικά αν μόνο ένα ιικό αντίγραφο ανά κύτταρο θα πρέπει να αναμένεται, είναι ιδιαίτερα επιρρεπή σε σφάλμα.

Πρόσφατα, Lombardi et al. αναφερόμενη ανίχνευση και η μετάδοση λοιμωδών XMRV από PBMCs ή πλάσμα των ασθενών με CFS με τη συγκαλλιέργεια με κύτταρα LNCaP [2]. Είναι ενδιαφέρον, 3-4% του PBMCs που απομονώθηκαν από ασθενείς ελέγχου ταυτοποιήθηκαν ως θετικά για XMRV μολυσματικού ιού με αποτέλεσμα την γενική ανησυχία για την ασφάλεια των προϊόντων αίματος. Αρκετές μελέτες που ακολούθησαν υποκινούνται από αυτά τα αποτελέσματα δεν ήταν σε θέση να επιβεβαιώσουν αυτά τα αρχικά συμπεράσματα. Λόγοι για την ασυμφωνία είναι ασαφείς και σήμερα διερευνώνται. Ενώ η πλειοψηφία των μελετών επικεντρώθηκε σε τεχνικές PCR καθώς και ανίχνευση των XMRV ειδικών αντισωμάτων μόνο μία μελέτη περιελάμβανε συγκαλλιέργεια των ενεργοποιημένων PBMCs από ασθενείς CFS με LNCaP κύτταρα [10], καθώς και μια πιο πρόσφατη μελέτη εξέτασε τη μετάδοση XMRV από το πλάσμα (που προέρχεται από την CFS ασθενείς) με LNCaP κύτταρα [43]. Και οι δύο μελέτες δεν ανίχνευσαν XMRV σε οποιοδήποτε από τα δείγματα που ελέγχθηκαν. Εστιάζοντας στην πιθανότητα ότι XMRV είναι ένας ιός θεατής επανενεργοποιηθεί σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη, μαζί με το εύρημα ότι XMRV μπορεί να ανιχνευθεί σε ΜΚΠΑ ασθενών [2] ψάξαμε για σημεία λοίμωξης XMRV στα κύτταρα του αίματος των ασθενών PCA εφαρμογή της τεχνολογίας PCR και συγκαλλιέργεια ενεργοποιημένα PBMCs με κύτταρα δείκτη.