Αφηρημένο

Ιστορικό

Τα καρκινικά κύτταρα εθίζονται στα δύο ενεργοποιημένα ογκογονίδια και πολλαπλασιαστικών και σήματα προ-επιβίωσης που παρέχεται από την ανώμαλη μικροπεριβάλλον του όγκου. Παρά το σημαντικό αριθμό διαλυτών παραγόντων έχουν ταυτοποιηθεί που διαμορφώνουν το αλληλοπαρεμβολές μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και στρώμα, αυτό δεν έχει αποδειχθεί πως ογκογονικές μεταλλάξεις στα κύτταρα του όγκου μεταβάλλουν την αλληλεπίδραση τους με τα φυσιολογικά κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου.

Principal Εκτίμηση

Δείξαμε ότι η ισογονιδιακές HCT116 και τα κύτταρα HKE-3, τα οποία διαφέρουν μόνο από την παρουσία του μεταλλαγμένου KRAS αλληλόμορφο, τόσο διεγείρουν μακροφάγα για να παράγουν IL-1β. Με τη σειρά του, μακροφάγα αυξημένη σηματοδότηση Wnt, τον πολλαπλασιασμό και την επιβίωση τόσο HCT116 και HKE-3 κύτταρα, αποδεικνύοντας ότι σηματοδότησης από ογκογόνο KRAS σε καρκινικά κύτταρα δεν επηρεάζει την αλληλεπίδρασή τους με τα μακροφάγα. κύτταρα HCT116 είναι ετερόζυγα για το β-κατενίνης (HCT116

WT /ΜΤ), που φέρει ένα άγριου τύπου (WT) και ένα μεταλλαγμένο (MT) αλληλόμορφο, αλλά ισογονιδιακές γραμμές που μεταφέρουν μόνο το WT (HCT116

WT) ή ΜΤ β-κατενίνης αλληλόμορφο (HCT116

ΜΤ) έχουν δημιουργηθεί. Δείξαμε ότι τα μακροφάγα προωθούνται σηματοδότηση Wnt σε κύτταρα που φέρουν το αλληλόμορφο ΜΤ β-κατενίνης, αλλά όχι σε κύτταρα HCT116

WT. Συνεπής με αυτή την παρατήρηση, μακροφάγα και IL-1β απέτυχε να σταθεροποιηθεί σαλιγκάρι σε HCT116

WT κύτταρα, και να προστατεύσει αυτά τα κύτταρα από TRAIL επαγόμενη απόπτωση. Τέλος, αποδείξαμε ότι τα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν κυρίαρχο αρνητικό TCF4 (dnTCF4) ή HCT116 κυττάρων με σιγήσει Σαλιγκάρι απέτυχε να διεγείρει την παραγωγή IL-1β σε μακροφάγα, αποδεικνύοντας ότι τα καρκινικά κύτταρα ενεργοποιούν τα μακροφάγα μέσω Wnt-εξαρτώμενο παράγοντα.

Σημασία

τα δεδομένα μας δείχνουν ότι ογκογόνος μεταλλάξεις β-κατενίνης σε κύτταρα όγκου, και την επακόλουθη ενεργοποίηση των σηματοδότηση Wnt, όχι μόνο σκανδάλη κύτταρο-εγγενή τροποποιήσεις, αλλά επίσης έχουν σημαντική επίπτωση στην στιχομυθία των κυττάρων του όγκου με τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους.

Παράθεση: Kaler P, Augenlicht L, Klampfer L (2012) Ενεργοποίηση μεταλλάξεις σε β-κατενίνης στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα Αλλάξτε την αλληλεπίδρασή τους με μακροφάγα? ο ρόλος των σαλιγκαριών. PLoS ONE 7 (9): e45462. doi: 10.1371 /journal.pone.0045462

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 18 Ιουνίου 2012? Αποδεκτές: 22 Αυγ 2012? Δημοσιεύθηκε: 21, Σεπτεμβρίου 2012

Copyright: © Kaler et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την CA 111361 (για να LK), U54 CA 100926 (για LA) και P30-13330 από NCI (National Cancer Institute (ΗΠΑ)). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Beta κατενίνη (β-κατενίνης) είναι ένα Ε-καδερίνης πρωτεΐνη δεσμεύσεως και έτσι παίζει σημαντικό ρόλο στην προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου [1]. Επιπλέον, ενεργεί ως ένας τελεστής της σηματοδότησης Wnt [2]. Σε περίπτωση απουσίας του Wnt σηματοδότησης β-κατενίνης φωσφορυλιώνεται από ΟδΚ3β, με αποτέλεσμα την ουβικιτινίωση της και μετέπειτα αποικοδόμηση στο πρωτεάσωμα [3]. Η δραστηριότητα της β-κατενίνης ελέγχεται από το ογκοκατασταλτικό αδενωματώδη πολυποδίαση coli (APC) και αδρανοποίηση μεταλλάξεις στο APC γονίδιο, που εμποδίζουν την υποβάθμιση β-κατενίνης, βρίσκονται στη μεγάλη πλειονότητα των σποραδικών καρκίνων του παχέος εντέρου [4], [5] . Περαιτέρω, περίπου το 10% των καρκίνων του παχέος φέρουν μεταλλάξεις στη θέση φωσφορυλιώσεως της ΟδΚ3β που βρίσκεται στο Ν-άκρο της β-κατενίνης [6]. Αρο μεταλλάξεων και μεταλλάξεων β-κατενίνης αλληλοαναιρούνται σε καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς και οι δύο οδηγούν σε σταθεροποίηση του β-κατενίνης και σε συστατική β-κατενίνης /TCF μεταγραφική δραστικότητα.

κύτταρα HCT116 είναι ετερόζυγα για β-κατενίνης, φιλοξενούν ένα άγριου τύπου (WT) αλληλόμορφο και ένα μεταλλαγμένο (ΜΤ) αλληλόμορφο με αδρανοποίηση της SER45, ένα από τα κατάλοιπα φωσφορυλιώνεται από ΟδΚ3β που συχνά μεταλλάσσεται σε όγκους [6], [7]. Οι Ισογενή HCT116 κυτταρικές γραμμές που φέρουν μόνο WT ή ΜΤ αλληλόμορφο έχουν δημιουργηθεί για τη μελέτη του ρόλου των ογκογόνο σηματοδότηση β-κατενίνης στον καρκίνο του παχέος εντέρου [8], [9]. Όπως ήταν αναμενόμενο, η διαγραφή της ΜΤ αλληλόμορφο β-κατενίνης σε κύτταρα HCT116 μείωσε σημαντικά β-κατενίνης /TCF μεσολάβηση μεταγραφική δραστικότητα σε αυτά τα κύτταρα. Ενώ τα ολικά επίπεδα της β-κατενίνης ήταν παρόμοια σε κύτταρα με διασπασμένο αλληλόμορφο β-κατενίνης WT ή ΜΤ, η αδρανοποίηση του αλληλόμορφου ΜΤ οδήγησε σε ανακατανομή των β-κατενίνης στις κυτταρικές μεμβράνες των κυττάρων που συνδέονται με κόμβους [8], [9]. Παραδόξως, η έκφραση των τυπικών Wnt γονιδίων στόχων, όπως το c-myc, δεν μειώθηκε κατά απαλοιφή του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου β-κατενίνης, και δεν επηρεάστηκαν σημαντικά χαρακτηριστικά ανάπτυξης αυτών των κυττάρων κάτω από πρότυπες συνθήκες

in vitro

[ ,,,0],8]. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι οι μεταλλάξεις σε β-κατενίνη, παράλληλα με την διεξαγωγή μια πληθώρα κυτταρικών εγγενή μετατροπές, μπορεί επίσης να επηρεάσει την αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων με τα συστατικά του μικροπεριβάλλον του όγκου και να συμβάλλουν έτσι στην ανάπτυξη του όγκου

in vivo

.

πρόσφατα αναφέρθηκε ότι καρκινικών κυττάρων που προέρχονται από παράγοντα (ες) ενεργοποιημένα μακροφάγα παράγουν IL-1β να, που με τη σειρά αδρανοποιείται ΟδΚ3β, αύξησε τα επίπεδα της μη-φωσφορυλιωμένης β-κατενίνης και διεγείρονται σηματοδότηση Wnt σε κύτταρα HCT116 [10]. Δείξαμε ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες διεγείρεται σηματοδότηση Wnt σε ένα ΝΡ-κΒ-εξαρτώμενο τρόπο [11]. Σε συμφωνία με αυτό, συστατική ενεργοποίηση του ΙΚΚ2 στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα, που είναι επαρκής για να επάγει εντερική όγκων σε ποντικούς, προκαλεί την κινητοποίηση των μακροφάγων και την έκφραση μιας ποικιλίας των προφλεγμονωδών κυτοκινών, συμπεριλαμβανομένων των ΤΝΡ και IL-1β [12], και τα κύτταρα με συστατική ενεργοποίηση του ΙΚΚ2 εμφάνισε ενεργοποιημένων σηματοδότηση Wnt

Α:. HCT116 και HKE-3 κύτταρα συγκρίθηκαν ως προς την ικανότητά τους να επάγουν IL-1β σε μονοκύτταρα περιφερικού αίματος (Μο). Η ικανότητα των ΤΗΡ1 μακροφάγα και IL-1β για να επάγει σηματοδότηση Wnt σε HCT116 και HKE-3 κύτταρα (Β), για την προώθηση της ανάπτυξης κλωνογόνο (C) και να προστατεύεται από το TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (D) μετρήθηκε.

Η

Δείξαμε ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες σταθεροποιηθεί σαλιγκάρι σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [13], ένας παράγοντας μεταγραφής που προάγει την επεμβατική και μεταστατικό φαινότυπο μέσω της επαγωγής ενός επιθηλιακού μετάβαση μεσεγχυματικά (ΕΜΤ) [14]. Σαλιγκάρι είναι ένα γονίδιο στόχος Wnt [15], [16], αλλά έχει επίσης αποδειχθεί ότι αλληλεπιδρούν με β-κατενίνης και να συν-διεγείρουν τα γονίδια στόχους Wnt [15] – [17], υποδεικνύοντας ένα περίπλοκο αλληλεπίδραση μεταξύ σηματοδότηση Wnt και Σαλιγκάρι. Επιπλέον, σαλιγκάρι ρυθμίζει την ανάπτυξη και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, και έχει συνδεθεί με τον σχηματισμό των καρκινικών βλαστικών κυττάρων [18]. Ως εκ τούτου, Αυξημένη σηματοδότηση Wnt και σταθεροποίηση του σαλιγκαριού υποδηλώνουν έντονα ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες αυξάνουν τις ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων των καρκινικών κυττάρων, τα οποία συμβάλλουν στην μετάσταση και να εμφανίσει την αντίσταση στη θεραπεία. Σε συμφωνία με αυτό, δείξαμε ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες προστατεύονται κύτταρα όγκου από TRAIL επαγόμενη απόπτωση [13]

Α:. Ισογενή HCT116 κυτταρικές γραμμές με το διαγραμμένο WT (HCT116

ΜΤ) ή ΜΤ β- κατενίνης αλληλόμορφο (HCT116

WT) επιμολύνθηκαν με το γονίδιο ανταποκριτή TOP-LUC και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενες συγκεντρώσεις IL-1β ή καλλιεργήθηκαν με ΤΗΡ1 μακροφάγα όπως υποδεικνύεται. Β: κύτταρα HCT116 επιμολύνθηκαν με το γονίδιο ΝΡ-κΒ-reporter και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TNF και IL-1β όπως δείχνεται

Η

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η ικανότητα των κυττάρων HCT116 να διεγείρουν μακροφάγα εξαρτάται πλήρως από το. παρουσία του ενδογενούς μεταλλαγμένου β-κατενίνης και την επακόλουθη σταθεροποίηση του σαλιγκαριού στα επιθηλιακά κύτταρα, που πιστοποιεί την υπόθεσή μας ότι η απόκτηση των ογκογόνων μεταλλάξεων σε εντερικά επιθηλιακά κύτταρα μεταβάλλει την αλληλεπίδραση τους με το μικροπεριβάλλον τους. Δείξαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου διεγείρουν μακροφάγα μέσω του προϊόντος ενός γονιδίου στόχου Wnt. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι Σαλιγκάρι ρυθμίζει την έκφραση του γονιδίου αυτού και, συνεπώς, διαδραματίζει καίριο ρόλο στη λογομαχία μεταξύ του παχέος εντέρου καρκινικά κύτταρα και μακροφάγα

Α:. Γονικός HCT116 κύτταρα ή HCT116 με διαγραφή αλληλόμορφο β-κατενίνης WT ή MT ήταν κατεργάζεται με TRAIL απουσία ΤΗΡ1 μακροφάγα ή IL1 όπως υποδεικνύεται. Β: Η έκταση της απόπτωσης προσδιορίστηκε σε 4 ανεξάρτητα πειράματα. C:. HCT116

WT και HCT116

κύτταρα ΜΤ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TRAIL με την απουσία ή την παρουσία του TNF και την έκταση της απόπτωσης προσδιορίστηκε με χρώση ΡΙ

Η

Αποτελέσματα

Μεταλλάξεις σε β-κατενίνης, αλλά όχι KRAS, μεταβάλλει καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρου αλληλεπιδράσεις με μακροφάγα

ανέφεραν ότι τα καρκινικά κύτταρα κόλου, μέσω ενός διαλυτού παράγοντα, ενεργοποιούν τα μακροφάγα ώστε να εκκρίνουν IL-1β, το οποίο με τη σειρά του προωθεί β- κατενίνης /TCF4 μεταγραφική δραστικότητα στα καρκινικά κύτταρα και διεγείρει την ανάπτυξη τους [10]. Για να διαπιστωθεί αν απόκτηση του ογκογόνου Kras μετάλλαξη στα κύτταρα του όγκου μεταβάλλει την αλληλεπίδρασή τους με τα μακροφάγα, εκτελέσαμε πειράματα σε HCT116 και τα κύτταρα HKE-3, ισογονιδιακές κυτταρικές σειρές που διαφέρουν μόνο με την παρουσία του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου Kras [19]. Δείξαμε ότι τόσο HCT116 και HKE-3 κυττάρων που επάγεται IL-1β σε μονοκύτταρα περιφερικού αίματος, πρόδρομοι των μακροφάγων που σχετίζονται με όγκους (Σχ. 1Α). Συνεπώς, τα μακροφάγα και IL-1β διεγείρονται σηματοδότηση Wnt (Εικ. 1Β), προώθησε την ανάπτυξη (Εικ. 1 C) και να προστατεύεται HCT116 και τα κύτταρα HKE-3 από TRAIL-επαγώμενη απόπτωση (Σχ. 1D). Οι μελέτες αυτές έδειξαν ότι η παρουσία των ογκογόνων KRAS σε καρκινικά κύτταρα δεν έχουν σημαντικές επιπτώσεις στην αλληλεπίδρασή τους με τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους

Α:. Β: HCT116

WT και HCT116

κύτταρα ΜΤ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με TRAIL απουσία ή την παρουσία του IL-1β όπως δείχνεται και τον εντοπισμό β-κατενίνης προσδιορίστηκε με ανοσοφθορισμό σε κύτταρα κατεργασμένα με TRAIL απουσία ή παρουσία IL-1β ή TNF όπως υποδεικνύεται. Β:. Η έκταση της κασπάσης 8 ενεργοποίηση και η διάσπαση της PARP και β-κατενίνης προσδιορίστηκαν με ανοσοστύπωμα

Η

κύτταρα HCT116 είναι επίσης ετερόζυγο για β-κατενίνης, που περιέχει ένα αγρίου τύπου (WT) και αλληλόμορφο ένα μεταλλαγμένο (ΜΤ) αλληλόμορφο με ένα 3-bp διαγραφή που εξαλείφει το υπόλειμμα σερίνης στο κωδικόνιο 45 [7], με αποτέλεσμα τη σταθεροποίηση β-κατενίνης και την ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt. Για να προσδιοριστεί αν η παρουσία του ενεργοποιημένου, ΜΤ β-κατενίνης σε κύτταρα όγκου διαμορφώνει την αλληλεπίδραση τους με τα μακροφάγα εκτελέσαμε πειράματα σε κύτταρα HCT116 με μια διαγραφή είτε του WT (HCT116

ΜΤ) ή ΜΤ αλληλόμορφο β-κατενίνης (HCT116

WT) [8]. Οι ισογονιδιακές κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-1β ή καλλιεργήθηκαν με ΤΗΡ1 μακροφάγα. Όπως και στην γονική HCT116 κύτταρα, μακροφάγα και IL-1β επαγόμενη σηματοδότηση Wnt σε HCT116

ΜΤ κύτταρα (Σχ. 2Α). Σε αντίθεση, HCT116

WT κύτταρα, τα οποία έδειξαν χαμηλότερη σηματοδότηση Wnt, απέτυχε να ανταποκριθεί στην IL-1β ή μακροφάγα με αυξημένη σηματοδότηση Wnt (Εικ. 2Α). Η ικανότητα του IL-1β και TNF να ενεργοποιεί NF-κΒ, η κύρια οδός σηματοδότησης ενεργοποιούνται από αυτές τις κυτοκίνες, δεν επηρεάστηκε από την κατάσταση του β-κατενίνης (Εικ. 2Β), αποδεικνύοντας την εξειδίκευση μονοπάτι, και είναι συνεπής με προηγούμενο εύρημα μας ότι ΝΡκΒ σηματοδότηση είναι προς τα ανάντη του σηματοδότηση Wnt [11]. Αυτά τα αποτελέσματα κατέδειξαν ότι η παρουσία του αλληλόμορφου ΜΤ β-κατενίνης σε κύτταρα όγκου, η οποία οδηγεί σε ιδιοσυστατική δραστικότητα β-κατενίνης /TCF4, μεταβάλλει την αλληλεπίδρασή τους με τα μακροφάγα

Α:. Τα μακροφάγα και IL-1β απενεργοποιούν δραστηριότητα της ΟδΚ3β σε HCT116 και HKE-3 κύτταρα. Β: Τα επίπεδα του σαλιγκαριού προσδιορίστηκαν σε κύτταρα HCT116 που καλλιεργήθηκαν με ΤΗΡ1 μακροφάγα ή διεγέρθηκαν με IL-1β με την απουσία ή την παρουσία του LY294002 όπως υποδεικνύεται. C: HCT116

WT και HCT116

ΜΤ κύτταρα καλλιεργήθηκαν με ΤΗΡ1 μακροφάγα ή υποβλήθηκαν σε αγωγή με IL-1β ή TNF όπως υποδεικνύεται για 24 ώρες. D: Η ικανότητα των ΤΗΡ1 μακροφάγα και ανασυνδυασμένη IL-1β για να επάγει σηματοδότηση Wnt συγκρίθηκε σε κύτταρα επιμολυσμένα με μη ειδικά (NSP) ή Σαλιγκάρι ειδικό siRNA

Η

Τα μακροφάγα αποτυγχάνουν να προστατεύουν τα κύτταρα HCT116 που δεν έχουν την ΜΤ β-. κατενίνης αλληλόμορφο από επαγόμενη TRAIL απόπτωση

απέδειξαν ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες προστατεύουν κόλον καρκινικά κύτταρα από TRAIL απόπτωση που επάγεται μέσω ενός μηχανισμού που εξαρτώνται από την σηματοδότηση Wnt [13], υποδηλώνοντας ότι τα κύτταρα HCT116

WT (λείπει ο μεταλλαγμένο αλληλόμορφο β-κατενίνης), τα οποία δεν ανταποκρίνονται σε μακροφάγα με ενισχυμένη σηματοδότηση Wnt (Εικ. 1), μπορεί να εμφανίζει ένα αλλαγμένο απόκριση σε TRAIL. Έχουμε αντιμετωπίζονται τα μητρικά κύτταρα HCT116, HCT116

WT και HCT116

ΜΤ κύτταρα με TRAIL με την απουσία ή την παρουσία ΤΗΡ 1 μακροφάγα ή IL-1β. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3, HCT116 κύτταρα που στερούνται το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο β-κατενίνης (HCT116

WT) επέδειξαν αυξημένη ευαισθησία σε TRAIL επαγόμενη απόπτωση, η οποία είναι σύμφωνη με το γεγονός ότι σηματοδότηση Wnt προστατεύει τα κύτταρα από TRAIL επαγόμενη απόπτωση [20]. Σε αντίθεση με τα γονικά κύτταρα HCT116 και τα κύτταρα HCT116 με διαγράφεται WT αλληλόμορφο β-κατενίνης (HCT116

ΜΤ), κύτταρα HCT116

WT δεν προστατεύθηκαν από TRAIL απόπτωση που επάγεται από μακροφάγα, IL-1β (Σχ. 3Α, Β) ή από TNF (Σχήμα 3C).

Α:. HCT116 επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα ή dnTCF4 συν-καλλιεργήθηκαν με πρωτογενή μονοκύτταρα περιφερικού αίματος (Μο) επί 24 ώρες και η ποσότητα της IL-1β προσδιορίστηκε με ELISA. Β: HCT116 ή HKE-3 κύτταρα επιμολυσμένα με NSP (μη ειδική) ή ειδικές RNAi Σαλιγκάρι καλλιεργήθηκαν με μονοκύτταρα ΤΗΡ1 και η ποσότητα της IL-1β προσδιορίστηκε με ELISA

Η

Παρά φιλοξενούν κύτταρα HCT116 μεταλλαγμένη β-κατενίνης. εμφανίζει εντόπιση κυρίως στο πλάσμα μεμβράνης του β-κατενίνης [8]. Η επεξεργασία των κυττάρων με TRAIL προκάλεσε την απώλεια της χρώσης διακριτό μεμβράνης σε αμφότερα HCT116

ΜΤ και HCT116

WT κύτταρα (Σχ. 4Α), σε συμφωνία με τη διάσπαση του β-κατενίνης σε κύτταρα TRAIL-αγωγή (Εικ. 4Β) . Ωστόσο, ενώ TNF και IL-1β αποκατασταθεί εντοπισμός μεμβράνης β-κατενίνης σε HCT116

κύτταρα ΜΤ, απέτυχαν να εξουδετερώσουν το αποτέλεσμα του TRAIL σε HCT116

WT κύτταρα (Σχ. 4Α). Συνεπώς, τα μακροφάγα και IL-1β απέτυχε να αναστείλει TRAIL-επαγόμενη διάσπαση του β-κατενίνης, η ενεργοποίηση της κασπάσης-8, και η επακόλουθη επεξεργασία του ΡΑΚΡ σε HCT116

WT κύτταρα (Εικ. 4Β).

IL-1β με τη σειρά του δεσμεύει IL1R στα κύτταρα του όγκου και διεγείρει σηματοδότηση Wnt. Δείξαμε ότι ο παράγοντας μακροφάγων που προέρχεται από τη σταθεροποίηση σαλιγκάρι σε κύτταρα όγκου, το οποίο προωθεί περαιτέρω σηματοδότηση Wnt και απαιτείται για την ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να ενεργοποιούν τα μακροφάγα να παράγουν IL-1β.

Η

Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν ότι τα κύτταρα με ενεργή σηματοδότηση Wnt εμφανίσει ένα αλλαγμένο απόκριση σε παράγοντες μακροφάγα που προέρχονται, οι οποίες ενδεχομένως επηρεάζουν την ευαισθησία τους σε θεραπευτικούς παράγοντες.

έλλειψη σταθεροποίηση σαλιγκάρι σε HCT116 κυττάρων με αδρανοποιημένο ΜΤ αλληλόμορφο β-κατενίνης

σηματοδότηση Wnt υπήρξε δειχθεί ότι προάγει τη μεταγραφή, τη σταθερότητα και την πυρηνική εντόπιση του σαλιγκαριού [15], [16]. Πράγματι, δείξαμε ότι η αδρανοποίηση του ΟδΚ3β με LiCl ή από ειδικό αναστολέα της ΟδΚ3β, AR-A014418, ήταν αρκετή για να αυξήσει τα επίπεδα των σαλιγκαριών σε κύτταρα HCT116 [13]. Δείξαμε ότι η υπερέκφραση του σαλιγκαριού προωθεί TCF4-β-κατενίνης με γνώμονα μεταγραφής, και ότι σίγηση του σαλιγκαριού παρεμβαίνει με σηματοδότηση Wnt σε κύτταρα HCT116 [13], σύμφωνα με την ικανότητα του σαλιγκαριού να συνδέσουν με β-κατενίνης και να συν-ρυθμίζει το έκφραση των γονιδίων στόχων Wnt [17], [21].

τα μακροφάγα και IL-1β αδρανοποιούν ΟδΚ3β τόσο HCT116 και τα κύτταρα HKE-3 (Σχ. 5Α) και, με συνέπεια, να σταθεροποιήσει σαλιγκάρι ανεξάρτητα από τις μεταλλάξεις Kras παρουσία σε κύτταρα όγκου [13]. Η ενεργοποίηση του ΟδΚ3β από ένα συγκεκριμένο αναστολέα της ΡΙ3Κ, YL294002, αποκλείεται macrophage- και IL1β- επαγόμενη σταθεροποίηση του σαλιγκαριού σε κύτταρα HCT116, επιβεβαιώνοντας ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες σταθεροποιούν Σαλιγκάρι μέσω της ικανότητάς τους να απενεργοποιούν ΟδΚ3β (Εικ. 5Β).

Δείξαμε προηγουμένως ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες απέτυχε να σταθεροποιηθεί σαλιγκάρι σε κύτταρα HCT116 που εκφράζουν dnTCF4, συνεπής με την έννοια ότι η ενεργός σηματοδότηση Wnt απαιτείται για τη σταθεροποίηση του σαλιγκαριού [13]. Εδώ συγκρίναμε την ικανότητα των παραγόντων μακροφάγα προερχόμενα να σταθεροποιηθεί σαλιγκάρι σε HCT116 κύτταρα που είχαν μία διαγραφή είτε του WT ή ΜΤ αλληλόμορφο β-κατενίνης. Όπως και σε γονικά κύτταρα HCT116, μακροφάγα, IL-1β και TNF σταθεροποιηθεί Σαλιγκάρι σε HCT116

ΜΤ κύτταρα (Εικ. 5C). Σε αντίθεση, μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες απέτυχε να σταθεροποιηθεί σαλιγκαριών στη HCT116

WT κύτταρα (Σχ. 5C), σύμφωνα με την ανικανότητα των μακροφάγων για την ενίσχυση σηματοδότηση Wnt σε αυτά τα κύτταρα (Εικ. 1). Εμείς σιγήσει σαλιγκάρι σε κύτταρα HCT116 και επιβεβαίωσε ότι, σε συμφωνία με τα δημοσιευμένα δεδομένα μας [13], τα μακροφάγα και IL-1β απέτυχε να διεγείρει σηματοδότηση Wnt σε απουσία σαλιγκάρι (Εικ. 5D).

Τα καρκινικά κύτταρα ενεργοποιούν τα μακροφάγα μέσω ενός Wnt-εξαρτώμενη παράγοντας

Δείξαμε ότι ο παράγοντας (ες) που προέρχονται από όγκους διεγείρουν μακροφάγα ώστε να εκκρίνουν μία ποικιλία διαλυτών παραγόντων, συμπεριλαμβανομένων των IL-1β, μιας κυτοκίνης που ιδρύθηκε ήταν απαραίτητη για την στιχομυθία μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των μακροφάγων [10 ]. Δείξαμε ότι τα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν dnTCF4 απέτυχαν να διεγείρουν μονοκύτταρα περιφερικού αίματος ώστε να εκκρίνουν IL-1β (Σχ. 6Α), επιβεβαιώνοντας ότι σηματοδότηση Wnt απαιτείται για την έκφραση του παράγοντα που προέρχεται από όγκο που διεγείρει τα μακροφάγα.

Ομοίως, αποσιώπηση του σαλιγκάρι, ένα γονίδιο στόχος Wnt, σε HCT116 κύτταρα ή HKE-3 είχε ως αποτέλεσμα την αδυναμία αυτών των κυττάρων για να προκαλέσει παραγωγή IL-1β σε μετασχηματισμένα μονοκύτταρα ΤΗΡ 1 (Σχ. 6Β). Μαζί, αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν ότι τα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου ενεργοποιούν τα μακροφάγα μέσω Wnt /σαλιγκάρι-ρυθμίζονται παράγοντα, η οποία απαιτείται για την παραγωγή της IL-1β.

Συζήτηση

Αν και κατάλληλα μακροφάγα έχουν την εγγενή ικανότητα να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα, έχει καταστεί σαφές ότι τα μακροφάγα προσλαμβάνονται στο μικροπεριβάλλον του όγκου και διαμορφώνεται από τους παράγοντες που προέρχονται από όγκους χάνουν την ικανότητα να καταστρέφουν τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, έχει διαπιστωθεί ότι τα μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους (ΤΑΜ) παρέχουν διαλυτών παραγόντων που προωθούν την ανάπτυξη, την επιβίωση και την μεταστατική εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου [22] – [24]. Αρκετές μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες έχουν ταυτοποιηθεί που ρυθμίζουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Δείξαμε ότι μακροφάγα προερχόμενα IL-1β προάγει σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα και έτσι ρυθμίζει την ανάπτυξη και την επιβίωση τους [10], [13]. Με τη σειρά του, τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν παράγοντες που προσελκύουν και ενεργοποιούν μυελοειδή κύτταρα, και έτσι διαδίδονται μια αυτο-ενίσχυση βρόγχου που στηρίζει την ανάπτυξη του όγκου. Ωστόσο, πολύ λιγότερα είναι γνωστά σχετικά με τη φύση των παραγόντων που προέρχονται από όγκους που καταστέλλουν την κυτταροτοξική ικανότητα των μακροφάγων και να διεγείρει την προώθηση του όγκου τους ιδιότητες. Που προέρχονται από όγκους CCL2 προάγει την στρατολόγηση των φλεγμονωδών μονοκυττάρων και [25], και ογκο-προερχόμενο βερσικάνη έχει αποδειχθεί ότι ενεργοποιούν μυελοειδή κύτταρα μέσω TLR2 εξαρτώμενη σηματοδότηση [26].

Δείξαμε ότι μακροφάγων που προκαλείται από την ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου προωθεί την ανάπτυξη τους και την επιβίωση, σε συνέπεια με ένα εξέχοντα ρόλο του σηματοδότηση Wnt σε καρκίνο του παχέος εντέρου, και επαναλαμβανόμενες μεταλλάξεις του APC ή β-κατενίνης στην πλειονότητα των σποραδικών καρκίνων του παχέος εντέρου [27]. Στην παρούσα μελέτη αποδείξαμε ότι η ενεργοποίηση του σηματοδότηση Wnt σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου δεν είναι μόνο ξεκινά μια πληθώρα κυτταρικών-ενδογενούς μεταβολές στα επιθηλιακά κύτταρα, αλλά επίσης επηρεάζει τον τρόπο επιθηλιακά κύτταρα επικοινωνούν με μακροφάγα. Η αδρανοποίηση του ΜΤ αλληλόμορφο β-κατενίνης σε κύτταρα HCT116 μεταβάλλονται σημαντικά την αλληλεπίδρασή τους με τα μακροφάγα. Δείξαμε ότι τα μακροφάγα απέτυχε να προωθήσει σηματοδότηση Wnt και την προστασία των HCT116

WT κύτταρα από TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Αυτό είναι σύμφωνο με προηγούμενη έκθεση μας ότι η έκφραση του dnTCF4 σε καρκινικά κύτταρα παρεμποδίζεται σηματοδότηση μεταξύ μακροφάγα και κύτταρα όγκου [11], [13] και επιβεβαιώνει ότι η απόκτηση των ογκογόνων μεταλλάξεων μεταβάλλει την αλληλεπίδραση των επιθηλιακών κυττάρων με το γειτονικό στρώμα.

Όπως IL-1β, FGF19 έχει δειχθεί ότι ρυθμίζουν σηματοδότηση Wnt σε κύτταρα HCT116 [28]. Ωστόσο, σε αντίθεση με το εύρημα μας, FGF19 αυξημένη δραστικότητα β-κατενίνης /TCF μεταγραφική μόνο σε γονικά κύτταρα HCT116 και σε HCT116 κύτταρα που διατήρησε την WT αλληλόμορφο β-κατενίνης [28]. Μαζί αυτά τα δεδομένα υπογραμμίζουν τη σημασία των μεταλλάξεων β-κατενίνης για την απόκριση των καρκινικών κυττάρων σε αυτοκρινή και παρακρινή σήματα και κατά συνέπεια για την αλληλεπίδρασή τους με τα κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Τα δεδομένα μας επιβεβαίωσαν ότι η ενεργοποίηση των ογκογόνων οδών, όπως Wnt, όχι μόνο προκαλεί κυτταρική εγγενή αλλαγές, αλλά επάγει επίσης στρωματικά τροποποιήσεις που απαιτούνται για την εξέλιξη του όγκου. Σε αντίθεση με τη β-κατενίνη μεταλλάξεις, ογκογόνο ενεργοποίηση του Kras στα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα δεν επηρέασε την στιχομυθία μεταξύ επιθηλιακών κυττάρων και στρώματος.

Δείξαμε ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες σταθεροποιηθεί σαλιγκάρι σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [13], η οποία ρυθμίζει την επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση και έτσι να προάγει την βλαστική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων και την ικανότητά τους για μεταστατικό σπορά [29], [30]. Σαλιγκάρι είναι ένα γονίδιο στόχος Wnt [15], [16] η οποία, με τη σειρά της, αλληλεπιδρά με β-κατενίνης και έτσι συν-ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων στόχων Wnt [17]. Σε αντίθεση με τα γονικά κύτταρα HCT116, μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες απέτυχε να σταθεροποιηθεί σαλιγκαριών στη HCT116 κυττάρων με διαγράφεται αλληλόμορφο ΜΤ β-κατενίνης (Εικ. 5C). Δείξαμε ότι η ικανότητα των μακροφάγων και IL-1β να αναστέλλουν TRAIL επαγόμενη απόπτωση και να προωθήσει κλωνογόνο αύξηση των κυττάρων του όγκου αναστέλλεται επίσης σε κύτταρα όγκου με σιγήσει έκφραση Σαλιγκάρι [13], αποδεικνύοντας ότι σαλιγκάρι ρυθμίζει αρκετά βήματα στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου και δείχνοντας ένα κρίσιμο ρόλο των σαλιγκαριών στη λογομαχία μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των μακροφάγων. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η ενεργός σηματοδότηση Wnt σε καρκινικά κύτταρα κόλου, και Wnt-εξαρτώμενη σταθεροποίηση του σαλιγκαριού συγκεκριμένα, απαιτούνται για καρκινικά κύτταρα να διεγείρουν τα μακροφάγα για να παράγουν IL-1β (Εικ. 6). Ομοίως, τα τελευταία ευρήματα έδειξαν ότι Σαλιγκάρι ρυθμίζει προς τα πάνω την έκφραση των προφλεγμονωδών μεσολαβητών σε προφορική κερατινοκύτταρα, συμπεριλαμβανομένων IL6, IL-8, CXCL1 και IL-1β [31]. Αυτό είναι σύμφωνο με το εύρημα μας ότι μακροφάγα προερχόμενα παράγοντες προστατεύουν κόλον καρκινικά κύτταρα από TRAIL επαγόμενη απόπτωση μέσω σταθεροποίηση του σαλιγκαριού [13]. Ως εκ τούτου, η έλλειψη της σταθεροποίησης σαλιγκάρι σε HCT116 κυττάρων με αδρανοποιημένο ΜΤ αλληλόμορφο β-κατενίνης αποτελεί τη βάση της αδυναμίας των μακροφάγων να προστατεύσει αυτά τα κύτταρα από TRAIL-επαγώμενη απόπτωση. Αυτά τα δεδομένα επιβεβαίωσαν ότι η ενεργοποίηση της Wnt σηματοδότηση και την επακόλουθη σταθεροποίηση των σαλιγκαριών σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου σημαντικά τις επιπτώσεις της αλληλεπίδρασής τους με τα μακροφάγα, και προτείνει έναν κεντρικό ρόλο των σαλιγκαριών στη λογομαχία μεταξύ καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα και μακροφάγα.

Μαζί, μας στοιχεία δείχνουν έντονα ότι τα καρκινικά κύτταρα διεγείρουν μακροφάγα μέσω Wnt-εξαρτώμενο παράγοντα. Αυτό είναι σύμφωνο με το εύρημα μας ότι τα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν dnTCF4 απέτυχαν να διεγείρουν IL-1β σε μακροφάγα (Εικ. 6) και συνεπώς εμφανίζουν διαταραγμένη στιχομυθία με μακροφάγα [13]. Πράγματι, δείξαμε ότι τα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν dnTCF4 έχουν αυξημένη απόκριση σε TRAIL, και ότι τα μακροφάγα δεν προστατεύουν αυτά τα κύτταρα από TRAIL επαγόμενη απόπτωση [13]. Πειράματα βρίσκονται σε εξέλιξη για τον προσδιορισμό των παραγόντων που προέρχονται από όγκους οι οποίοι διεγείρουν τα μακροφάγα, και να καθοριστεί αν η έκφραση του ΤοΙΙ υποδοχέων (TLRs) επί των μακροφάγων απαιτείται για την στιχομυθία μεταξύ καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα και μακροφάγα (Σχήμα 7).

Ανθρώπινο όγκων του παχέος εντέρου εμφανίζουν ετερογενή επίπεδα Wnt δραστηριότητα [32] και έχει δειχθεί ότι μόνο τα κύτταρα με υψηλά επίπεδα Wnt εμφάνισης καρκίνου του παχέος εντέρου σηματοδότηση βλαστοκυττάρων (CSC) ιδιότητες [33], [34]. Πράγματι, αποσιώπηση του β-κατενίνης σε κύτταρα HCT116 έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν τον αριθμό των colonospheres, τα οποία είναι ιδιαίτερα εμπλουτισμένα σε ΚΕΠ [35]. Σε συμφωνία με αυτό, HCT116

WT κύτταρα απέτυχαν να σχηματίσουν σφαιροειδή όταν τοποθετήθηκαν σε συνθήκες χαμηλού ορού [9]. Δείξαμε ότι τα μακροφάγα και IL-1β ενισχυμένη σηματοδότηση Wnt και σταθεροποιήθηκε Σαλιγκάρι σε κύτταρα όγκου [13], η οποία έχει αποδειχθεί να προικίσει τα κύτταρα με ιδιότητες των βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με [18], υποδηλώνοντας ότι προέρχονται macrophage- παράγοντες συμβάλλουν στην ετερογένεια των όγκων του παχέος εντέρου με την επέκταση το κλάσμα των νεοπλασματικών κυττάρων που έχουν ιδιότητες βλαστικών κυττάρων του καρκίνου. Ομοίως, έχουν μυοϊνοβλάστη προερχόμενο παράγοντες έχουν δειχθεί να επιβάλει τον φαινότυπο CSC με την προώθηση σηματοδότηση Wnt σε κύτταρα όγκου [34] και periostin, ένα συστατικό της εξωκυττάριας μήτρας, προωθεί την βλαστική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων και αυξάνει την ικανότητά τους να σχηματίζουν μετάσταση με προς τα πάνω ρύθμιση Wnt σηματοδότηση [36].

Επειδή ένα ενεργό σηματοδότηση Wnt είναι μια υπογραφή των βλαστικών κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, είναι πιθανό ότι τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα έχουν μια αποκλειστική ικανότητα να αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα στο μικροπεριβάλλον του όγκου. Σε συμφωνία με αυτό, καρκίνο που σχετίζεται ινοβλάστες προωθήσει την διεισδυτικότητα του CD133

+ παχέος εντέρου βλαστικά κύτταρα πιο αποτελεσματικά από ότι του CD133

– κύτταρα [37]. Αυτό είναι πιθανό να συμβάλλουν στη μοναδική ικανότητα των καρκινικών βλαστικών κυττάρων για να προπαγανδίσει την ανάπτυξη του όγκου και να προσδώσει αντίσταση σε θεραπευτικές προσεγγίσεις.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές και συγκαλλιέργειας πειράματα

Ο HCT116 και HKE-3 ορθοκολικού καρκινώματος κυτταρικές γραμμές, οι οποίες διαφέρουν μόνον από την παρουσία του μεταλλαγμένου αλληλόμορφου K-RAS [19], καλλιεργήθηκαν σε ΜΕΜ, συμπληρωμένο με 10% FCS. HCT116 με διαταράσσεται WT ή ΜΤ αλληλόμορφο β-κατενίνης δόθηκαν από Kenneth Kinzler [8]. Η ανθρώπινη μονοκυτταρική γραμμή, ΤΗΡ1, καλλιεργήθηκε σε RPMI. Φυσιολογικά ανθρώπινα μονοκύτταρα, & gt? 90% CD14 και CD11c θετική και κυτταρικό υποδοχέα αντι Τ λιγότερο από το 1% θετική, αγοράστηκαν από την

Αστάρτη Βιολογικών

(Redmond, WA). Τα κύτταρα όγκου και τα μονοκύτταρα /μακροφάγα συνκαλλιεργήθηκαν χωρίζονται από παρεμβλημάτων Transwell μιας μεμβράνης πολυανθρακικού με μέγεθος πόρου 0.4 μm, το οποίο αποκλείει την άμεση επαφή κυττάρου-κυττάρου, αλλά επιτρέπουν την ανταλλαγή των διαλυτών παραγόντων (Corning Incorporated, Lowell, ΜΑ).

για κλωνογονική προσδιορισμούς, HCT116 και τα κύτταρα HKE-3 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 200 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός πλακιδίου έξι μόνο του ή μαζί με τα μονοκύτταρα του περιφερικού αίματος για 7 ημέρες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10], [11]. Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με 6% γλουταραλδεϋδη και 0,5% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν με Total Lab 1.1 λογισμικό (Nonlinear Dynamics, Durham, NC, USA).

Προσδιορισμός απόπτωσης

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ανασυνδυασμένο TRAIL (50 ng /ml, η βέλτιστη συγκέντρωση για την επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα HCT116) μόνο ή με την παρουσία μακροφάγων, IL-1β (5 ng /ml) ή TNFa (10 ng /ml) για 7 ώρες. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε υπότονο ρυθμιστικό διάλυμα (0,1% Triton Χ-100, 0.1% κιτρικό νάτριο) και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (50 μg /ml) για 4 ώρες στους 4 ° C όπως περιγράφεται [38]. Τα δείγματα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής και την κατανομή του κυτταρικού κύκλου και την έκταση της απόπτωσης (κύτταρα με περιεκτικότητα subG1 DNA) αναλύθηκαν με τη

ΜΟϋΡΙΤ

λογισμικού. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με TRAIL για ~ 7 ώρες και συλλέχθηκαν για εκτίμηση με βάση μορφολογικά κριτήρια. Επιβεβαιώσαμε την αποπτωτική φύση των κυττάρων με βιοχημική ανάλυση των προϊόντων λύσης κυττάρου. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση t test unpaired του Student, με τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Παροδική επιμόλυνση και Reporter προσδιορισμό γονιδίου

HCT116 και HKE-3 κύτταρα επιμολύνθηκαν παροδικά με το TOP-. πλασμίδιο FLASH (που φέρει ένα ειδικό προαγωγό TCF) ή TOP-FOP πλασμίδιο (ένα πλασμίδιο ελέγχου που φέρει ένα μεταλλαγμένο υποκινητή) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο του φωσφορικού ασβεστίου. Η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης ομαλοποιήθηκε με συν-επιμόλυνση με ΡΤΚ Renilla και δραστικότητα λουσιφεράσης προσδιορίστηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του πωλητή (δοκιμασία ρεπόρτερ λουσιφεράσης Διπλή, Promega, Madison, WI).

ανοσοφθορισμού

Για την υποκυτταρική ανίχνευση β-κατενίνης με ανοσοφθορισμό, κύτταρα στερεώθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 30 λεπτά. Τα κύτταρα επωάστηκαν με αντι-β-κατενίνης αντίσωμα (BD Biosciences, San Jose, CA, 1:100) για 1 ώρα στους 37 ° C και με δευτερογενές αντίσωμα αντι-κουνελιού συζευγμένο με FITC για 45 λεπτά στους 37 ° C. Οι εικόνες ελήφθησαν με μια φωτογραφική μηχανή SPOT CCD και αναλύθηκαν με λογισμικό SPOT.

Western Blot

στυπώματα Western πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Οι μεμβράνες δεσμεύτηκαν με 5% γάλα σε TBS που περιέχει 0.1% Tween 20, και επωάζονται με αντισώματα ειδικά για κασπάση 8 (Abcam), κασπάσης 9, PARP και Σαλιγκάρι (Cell Signaling Technology), pGSK3 (Millipore, Billerica, ΜΑ), το σύνολο των β κατενίνης (BD Biosciences, San Jose, CA), και β-ακτίνης (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Ανοσοαντιδραστικές ζώνες έγιναν ορατές με χημειοφωταύγεια (Amersham ECL

TM δυτική kit κηλίδωση ανίχνευση, Piscataway, NJ).