Αφηρημένο

Σκοπός

Ο καρκίνος του προστάτη (PCA) χαρακτηρίζεται από την απορυθμισμένη έκφραση αρκετών ογκοκατασταλτικών ή ογκογόνο miRNAs. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν ο προσδιορισμός και ο χαρακτηρισμός του miR-ας-7c ως πιθανή ογκοκατασταλτικό στη ΣΕΣΣ.

Πειραματικός Σχεδιασμός

Τα επίπεδα έκφρασης του miR-ας-7c εξετάστηκαν ανθρώπινες κυτταρικές σειρές και ιστούς προστάτη με χρήση qRT-PCR και

in situ υβριδισμού

. Ας-7c ήταν υπερεκφράζεται ή καταστέλλεται για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις στην ανάπτυξη των ανθρώπινων κυτταρικών σειρών προστάτη. Λεντοϊού μεσολάβηση επανέκφραση του ας-7c χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις επιπτώσεις στην ανθρώπινη ξενομοσχευμάτων προστάτη.

Αποτελέσματα

Εντοπίσαμε miR-ας-7c ως πιθανή ογκοκατασταλτικό στη ΣΕΣΣ. Έκφραση του let-7c ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κύτταρα ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC). Η υπερέκφραση των αφήστε-7c μειώθηκε, ενώ προς τα κάτω ρύθμιση του let-7c αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων, κλωνογενοποιήσεως και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη

in vitro

. Η καταστολή της έκφρασης ας-7c ενισχυθεί η ικανότητα των ανδρογόνων-ευαίσθητα κύτταρα του προστάτη να αναπτυχθούν σε συνθήκες ανδρογόνων-στερηθεί

in vitro

. Ανασύσταση του Let-7c από λεντοϊού μεσολάβηση εντός του όγκου παράδοση μείωσε σημαντικά το φορτίο όγκου σε ξενομοσχεύματα των ανθρώπινων κυττάρων του προστάτη. Επιπλέον, ας-7c έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κλινικές προστάτη δείγματα σε σύγκριση με συμφωνημένα καλοήθεις ιστούς τους, ενώ η έκφραση του Lin28, έναν κύριο ρυθμιστή της ας-7 επεξεργασίας miRNA, υπερεκφράζεται σε κλινικά δείγματα προστάτη.

Συμπεράσματα

Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν ότι microRNA ας-7c ρυθμίζεται προς τα κάτω σε προστάτη και λειτουργεί ως καταστολέας των όγκων, και είναι πιθανό θεραπευτικό στόχο για την PCA

Παράθεση:. Nadiminty Ν, Tummala R, Lou W, Zhu Υ, Shi XB, Ζου JX, et al. (2012) microRNA ας-7c ρυθμίζεται προς τα κάτω σε καρκίνο του προστάτη και καταστέλλει προστάτη ανάπτυξη του καρκίνου. PLoS ONE 7 (3): e32832. doi: 10.1371 /journal.pone.0032832

Επιμέλεια: Gokul Μ Das, Roswell Park Cancer Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 13 Ιουλίου 2011? Αποδεκτές: 2 Φεβ 2012? Δημοσιεύθηκε: 30, Μάρτη 2012

Copyright: © 2012 Nadiminty et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από ΝΙΗ CA140468, CA118887, CA109441, DOD PC080538 (AG) και DOD PC100502, American Cancer Society-IRG (ΝΝ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η πιο συχνά εμφανιζόμενων κακοήθεια και η δεύτερη πιο συχνή αιτία θνησιμότητας σχετίζονται με τον καρκίνο στους άνδρες στις ΗΠΑ. Η πλειοψηφία των ασθενών με προχωρημένο προστάτη ανταποκρίνονται αρχικά στην θεραπεία στέρησης ανδρογόνων, αλλά υποτροπή λόγω της ανάπτυξης των κυττάρων του καρκίνου του ανθεκτικού ευνουχισμό προστάτη (CRPC). Σημαντικές προσπάθειες έχουν επικεντρωθεί στην κατανόηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη και την πρόοδο της CRPC. Τα microRNAs (miRNAs) είναι ενδογενείς μικρά μη-κωδικοποίησης RNA που μπορεί να παρεμβαίνουν με την έκφραση της πρωτεΐνης είτε επάγοντας διάσπαση συγκεκριμένων mRNAs στόχο τους ή με αναστολή της μετάφρασης τους. Ώριμη miRNAs είναι εξελικτικά συντηρημένες ~22nt λανθάνον RNAs και μόνο που προκύπτει από μια πολλαπλών σταδίων επεξεργασίας μεγαλύτερο πρόδρομο μόρια μέσω Drosha και Dicer. Τελικά τα ώριμα miRNAs ενσωματωθεί στο σύνθετο RISC μαζί με τα mRNA στόχο τους, τα οποία αναγνωρίζονται από τη συμπληρωματικότητα αλληλουχία στην 3′-UTR [1]. Κάθε miRNA να στοχεύσετε πολλά διαφορετικά mRNA και κάθε mRNA μπορούν να απευθύνονται από πολλαπλές miRNAs, δημιουργώντας ένα περίπλοκο δίκτυο της ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. έχουν miRNAs δειχθεί ότι ρυθμίζει ένα ταχέως αυξανόμενο κατάλογο των πολύπλοκων βιολογικών διεργασιών συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης, του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση και το μεταβολισμό [2]. Ένα συντριπτικό ποσό της νέας στοιχεία δείχνουν το ρόλο τους ως καταστολείς των όγκων ή ογκογονίδια που παρουσιάζει ένα ολόκληρο φάσμα νέων διαγνωστικών και θεραπευτικών δυνατοτήτων [1], [3].

Ας-7 κωδικοποιεί μια εξελικτικά συντηρημένη οικογένεια 13 ομόλογος miRNAs βρίσκονται σε γονιδιωματικό θέσεις διαγράφονται συχνά σε ανθρώπινους καρκίνους [4]. Έκφραση ας-7 σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του πνεύμονα μειώνεται κυτταρικό πολλαπλασιασμό [5] και ανέστειλε την ογκογένεση του καρκίνου του μαστού κυττάρων καθώς και στη μείωση των μεταστάσεων [6]. Η υπερέκφραση του ας-7 επίσης μειώθηκε πνεύμονα αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στη θεραπεία ακτινοβολίας [7]. Μειωμένη έκφραση του ας-7 σε ανθρώπινους καρκίνους του πνεύμονα έχει συσχετισθεί με μικρότερη μετεγχειρητική επιβίωση, υποδεικνύοντας ότι ας-7 μπορεί να είναι ένας σημαντικός προγνωστικός δείκτης του καρκίνου του πνεύμονα [8]. Ομοίως, το ποσοστό επιβίωσης χωρίς εξέλιξη της 5-ετών βρέθηκε να είναι υψηλότερη σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών με χαμηλότερο HMGA2 7 ας-αναλογίες /σε σύγκριση με εκείνους με υψηλότερα HMGA2 /ας-7 αναλογίες [9]. Υπάρχει μια προφανής σχέση μεταξύ της απώλειας της έκφρασης ας-7 και την ανάπτυξη των κακώς διαφοροποιημένο και επιθετικών καρκίνων [10]. Ας-7 έκφραση βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω σε εντοπισμένη ιστούς προστάτη σε σχέση με καλοήθη ιστό περιφερειακή ζώνη [11], [12]. Οι Ας-7 μέλη έχουν δειχθεί ότι ρυθμίζουν τα επίπεδα έκφρασης των ογκογονιδίων όπως HMGA2 [5], RAS [13] και Myc [14] μαζί με γονίδια που εμπλέκονται στην κυτταρικού κύκλου και τη ρύθμιση της κυτταρικής διαίρεσης. Οι θεραπευτικές στρατηγικές που αναπτύσσονται στόχευσης ας-7, χρησιμοποιώντας είτε lenti-ή αδενο-ιικά κωδικοποιημένων υπερέκφραση ας-7 ή παροδική επιμόλυνση του δίκλωνου προδρόμους ας-7 [15], [16]. Έτσι, ας-7 δείχνει υπόσχονται ως μοριακού δείκτη σε ορισμένους καρκίνους και ως δυνητική θεραπευτική στη θεραπεία του καρκίνου.

Lin28, μια εξαιρετικά διατηρημένη πρωτεΐνη RNA-δεσμευτικές και ένας κύριος ρυθμιστής της ας-7 επεξεργασίας miRNA, είναι υπερεκφράζεται σε πρωτογενείς ανθρώπινους όγκους [17], [18] και ως δεδομένο ότι είναι ένας από τους παράγοντες που εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα που προάγουν την ογκογένεση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, με καταστολή της οικογένειας ας-7 του καταστολείς όγκων [19]. Lin28 συνδέεται με τις τερματικές θηλιές των προδρόμων του ας-7 οικογένεια miRNAs και εμποδίζει την επεξεργασία τους σε ώριμα miRNAs [20], [21]. Lin28 αναστέλλει την καταστολή και c-Myc από την καταστολή ας-7 και C-Myc ενεργοποιεί μεταγραφικά Lin28 [22], [23]. Αυτό Lin28 /ας-7 /c-Myc βρόχου μπορεί να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην απελευθερωμένη miRNA υπογραφή έκφραση που παρατηρείται σε πολλούς καρκίνους [24].

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι αφήνω-7c, ένα από τα τα μέλη της οικογένειας let-7, καταστέλλει την ανάπτυξη του προστάτη

in vitro

και

in vivo

. Η υπερέκφραση του ας-7c οδήγησε σε αναστολή της εξαρτάται από την αγκύρωση καθώς και ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη. Επανέκφραση του ας-7c σε ξενομοσχεύματα ανθρώπινων κυττάρων προστάτη χρησιμοποιώντας σημαντικά lentivirally κωδικοποιημένα ας-7c ανάπτυξη ανέστειλε όγκου. Επιπλέον, η έκφραση ας-7c ρυθμίζεται μειωτικά σε κλινικά δείγματα PCa. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η αύξηση του όγκου του προστάτη ρυθμίζεται από ας-7c και ότι ανασύσταση της ας-7 μπορεί να έχει ευεργετικά αποτελέσματα σε PCa μειώνοντας την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων.

Υλικά και Μέθοδοι

οι κυτταρικές σειρές και αντιδραστήρια

LNCaP, C4-2B, PC-346c και τα κύτταρα DU145 ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). LNCaP, C4-2B και τα κύτταρα PC346C είναι ανδρογόνων υποδοχέων (AR) θετικά και να απαντήσετε σε ανδρογόνων συμπλήρωση, ενώ τα κύτταρα DU145 είναι AR αρνητικά και ανδρογόνων-αναίσθητη. κυτταρικές σειρές LNCaP-S17 και LNCaP-IL6 + παράχθηκαν στο εργαστήριο μας με σταθερή επιμόλυνση του πλήρους μήκους IL-6 cDNA σε κύτταρα LNCaP και από τη χρόνια θεραπεία των κυττάρων LNCaP με 5 ng /ml ανασυνδυασμένης IL-6, αντίστοιχα. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές εμφανίζουν αυτοκρινή IL-6 σηματοδότηση. Αντισώματα έναντι ακτίνης και τουμπουλίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnologies (Santa Cruz, CA). αντισώματα Lin28 ελήφθησαν από Abcam (San Francisco, CA). SYBR Green iQ Supermix ήταν από τη Bio-Rad. Lentivector που βασίζεται κατασκεύασμα ας-7c ελήφθη από σύστημα Biosciences και Lin28 ORF και κατασκευάσματα shRNA ελήφθησαν από Open Biosystems.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα υψηλής συγκέντρωσης άλατος που περιέχει 50 mM Hepes ρΗ 7,9, 250 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% ΝΡ-40, 1 mM PMSF, 1 mM Να βαναδικό, 1 mM NaF και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche) όπως περιγράφεται προηγουμένως [25]. Η συνολική πρωτεΐνη υπολογίστηκε με τη χρήση της πρωτεΐνης Coomassie Αντιδραστήριο Προσδιορισμού (Pierce, Rockford, IL). Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης φορτώθηκαν σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Οι μεμβράνες αποκλείστηκαν με 5% άπαχο γάλα σε PBST (1χ PBS + 0.1% Tween-20) και ανιχνεύθηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε 1% BSA. Το σήμα ανιχνεύθηκε με ECL (GE Healthcare) μετά από επώαση με τα κατάλληλα συζευγμένο με HRP δεύτερα αντισώματα.

Μέτρηση της PSA

επίπεδα PSA μετρήθηκαν στα υπερκείμενα καλλιέργειας χρησιμοποιώντας ELISA (United Biotech Inc , Mountain View, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

πραγματικού χρόνου ποσοτική RT-PCR

LNCaP κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια ή ολιγονουκλεοτίδια και τα συνολικά RNAs εξήχθησαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ ( Invitrogen). cDNAs παρασκευάστηκαν μετά από πέψη με RNase-free RQ1 DNase (Promega). Τα cDNA υποβλήθηκαν σε αντίστροφη πραγματικό χρόνο μεταγραφή-ΡΟΚ (RT-PCR) χρησιμοποιώντας SYBR Green Supermix iQ (Bio-Rad) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26], [27]. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν με 1 μλ RT-PCR cDNA, 0.5 μΐ καθενός από τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές (10 μmol /L), 10.5 μί διπλά απεσταγμένο νερό, και 12.5 μί iQ SYBR Green Supermix. Κάθε αντίδραση ομαλοποιήθηκε με συνενίσχυση ακτίνης. Τριπλότυπα δείγματα έτρεξαν σε προεπιλεγμένες ρυθμίσεις της Bio-Rad CFX-96 σε πραγματικό χρόνο ανακυκλωτή. Οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση του Lin28 ήταν: Επίθεση 5′- GCCCCTTGGATATTCCAGTC-3 ‘και αντίστροφη 5′-AATGTGAATTCCACTGGTTCTCCT-3’. miRNA qPCR διεξήχθη με τη χρήση του κιτ miRCURY LNA καθολική RT PCR και microRNA LNA-συζευγμένο εκκινητές miRNA (Exiqon) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Northern Blotting

20 μg καθενός από τα συνολικά RNAs από LNCaP, PC-3, τα κύτταρα DU145, LNCaP-S17 και LNCaP-IL6 + έτρεξαν σε γέλες 15% ουρία-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νάϋλον. Μετά UV διασταυρούμενη σύνδεση, οι μεμβράνες υβριδοποιήθηκαν με ένα ανιχνευτή που αναγνωρίζει την ώριμη αλληλουχία του ας-7c. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

miRNA in situ υβριδοποίηση

Σε situ υβριδισμού

(ISH) πραγματοποιήθηκε για να καθορίσει τα πρότυπα έκφρασης των αφήνω-7c σε ανθρώπινο κλινικών μικροσυστοιχιών ιστό του προστάτη που περιέχει 160 πυρήνες το καθένα από απαράμιλλη καλοήθη και τα καρκινικά προστάτες. ISH εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το κλειδωμένο νουκλεϊκό οξύ (LNA), συζευγμένης ας-7c-ειδικό ανιχνευτή από Exiqon σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

κλωνογενείς δοκιμασίες

Anchorage-εξαρτώμενη δοκιμασίες κλωνογόνο ικανότητα διεξήχθησαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [28]. Εν συντομία, κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με είτε κενό φορέα ή αφήστε-7c σπάρθηκαν σε χαμηλές πυκνότητες (400 κύτταρα /τρυβλίο) σε τρυβλία καλλιέργειας των 10 cm. Οι πλάκες επωάστηκαν στους 37

oC σε μέσα που περιέχουν είτε 10% FBS ή 10% απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS (CS-FBS) και αφέθηκαν αδιατάρακτες για 14 ημέρες. Στο τέλος του πειράματος, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη, βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν οι αριθμοί των αποικιών.

Soft-άγαρ Δοκιμασίες Σχηματισμού Αποικίας

Anchorage-ανεξάρτητες δοκιμασίες σχηματισμού αποικίας ήταν πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυττάρων C4-2B και LNCaP-S17 επιμολυσμένα με τα υποδεικνυόμενα πλασμίδια. Μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 0,35% αγαρόζη που επικαλύπτει ένα στρώμα άγαρ 1.2%. Τα κύτταρα τρέφονται δυο φορές την εβδομάδα με πλήρη RPMI1640 και επωάστηκαν στους 37

0 ° Ο για 2 εβδομάδες. Στο τέλος του πειράματος, οι αποικίες βάφτηκαν με 0,005% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν.

δοκιμασίες ανάπτυξης κυττάρου

LNCaP, C4-2B, DU145, LNCaP κύτταρα-S17 και LN-IL6 + ήταν επιμολυσμένα με πλασμίδια που εκφράζουν ας-7c και αριθμοί των βιώσιμων κυττάρων προσδιορίστηκαν σε 0, 24 και 48 ώρες χρησιμοποιώντας ένα μετρητή Coulter κύτταρο.

Α) Ολικά RNAs από LNCaP, PC-3, DU145, LNCaP-S17 και LN -IL6 + κύτταρα αναλύθηκαν με qRT-PCR. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως σχετική μεταβολή φορές σε σύγκριση με τα επίπεδα έκφρασης σε LNCaP. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν το μέσο ± SD δειγμάτων εις τριπλούν από δύο ανεξάρτητα πειράματα. Β) 20 μg καθεμία από τις παραπάνω RNAs επίσης αναλύθηκαν με κηλίδωση Northern. U6 snRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. C) qRT-PCR που δείχνει την μείωση στην έκφραση let-7c σε κύτταρα LNCaP που εκφράζουν Lin28 σύγκριση με κύτταρα LNCaP επιμολυσμένα με τον άδειο φορέα (Con). Ένθετο Western blot δείχνει την έκφραση του Lin28. Δ) qRT-PCR που δείχνει την αύξηση στην έκφραση let-7c σε κύτταρα επιμολυσμένα με C4-2B shRNA έναντι Lin28 σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με C4-2B ελέγχου GFP shRNA. Ένθετο Western blot δείχνει προς τα κάτω ρύθμιση των Lin28. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν το μέσο ± SD δειγμάτων εις τριπλούν από δύο ανεξάρτητα πειράματα. Οι ράβδοι σφάλματος υποδηλώνουν ± SD (*

σ

& lt? 0,05). Ε) κηλίδα Western που δείχνει τα επίπεδα έκφρασης του Lin28 σε κύτταρα PCa. Ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Η απόπτωση Δοκιμασίες χρησιμοποιώντας κυτταρικού θανάτου Ανίχνευση ELISA

κατάτμηση του DNA σε LNCaP, DU145, LNCaP-S17 και τα κύτταρα LN-IL6 + επιμολυσμένα με πλασμίδια όπως υποδεικνύεται σε αριθμούς εκτιμήθηκε με την ανίχνευση κυτταρικού θανάτου κιτ ELISA (Roche, Indianapolis, ΙΝ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δημιουργία σταθερών κυτταρικών σειρών

Σταθερές κυτταρικές γραμμές LNCaP και C4-2B εκφράζουν ας-7c παράχθηκαν με επιμόλυνση πλασμίδια που περιέχουν τα cDNA και επιλογής κλώνων μετά την εφαρμογή επιλεκτικής πιέσεως με τα κατάλληλα αντιβιοτικά.

Α) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του ας-7c μετρήθηκαν με qRT-PCR συνολικά RNAs εξάγεται από 10 ζεύγη καλοήθεις και όγκου ανθρώπινου προστάτη δείγματα. Β) Έστω-7c επίπεδα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας

in situ υβριδισμού

στο TMAs περιέχει 160 πυρήνες το καθένα από απαράμιλλη καλοήθων και καρκινικές βιοψίες του προστάτη. Αντιπροσωπευτικά εικόνες εμφανίζονται για καλοήθη και καρκίνου πυρήνες. Έκφραση του let-7c ήταν υψηλότερη σε καλοήθη προστάτη σε σύγκριση με καρκινικά προστάτες. Γ) Σχετικά επίπεδα έκφρασης του Lin28 στα 10 ζεύγη καλοήθων και καρκινικών δειγμάτων ανθρώπινου προστάτη. τα επίπεδα έκφρασης των Lin28 συσχετίστηκαν αντίστροφα με εκείνα του ας-7c. Οι ράβδοι σφάλματος υποδηλώνουν ± SD (*

σ

& lt? 0,05).

Η

LNCaP (Α), C4-2B (Β), DU145 (C), LN-IL6 + (D κύτταρα) και LNCaP-S17 (Ε) επιμολύνθηκαν με ας-7c ή κενό φορέα (Con) και οι αριθμοί των κυττάρων προσδιορίστηκαν μετά από 24 και 48 ώρες. Η ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη κατεστάλη από let-7c. Ένθετα δείχνουν τα επίπεδα έκφρασης του πλασμιδίου let-7c. ΣΤ) Ο θάνατος των κυττάρων αναλύθηκε σε LNCaP, DU145, LNCaP-S17 και LN-IL6 + κύτταρα επιμολυσμένα με αφήσει-7c ή κενό φορέα (Con). Ας-7c επάγεται αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. κύτταρα G) LNCaP επιμολυσμένα με αντι-νόημα ολιγονουκλεοτίδια έναντι ας-7c ή ομελέτα oligos (Con) αναπτύχθηκαν σε FBS και CS-FBS και προσδιορίζεται αριθμούς κυττάρων. Ένθετο δείχνει την προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης του let-7c από ολιγονουκλεοτίδια αντι-νόημα. LNCaP κύτταρα με μειωτικά την έκφραση του ας-7c παρουσίασαν ταχύτερη ανάπτυξη στο CS-FBS σε σύγκριση με τους μάρτυρες. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν το μέσο ± SD δειγμάτων εις τριπλούν από δύο ανεξάρτητα πειράματα. Οι ράβδοι σφάλματος υποδηλώνουν ± SD (*

σ

& lt? 0,05).

Η

Ζώα

6-8 εβδομάδων αρσενικά γυμνά ποντίκια διατηρήθηκαν στη διευκόλυνση των ζώων σε το Ιατρικό Κέντρο UC Davis. Όλες οι πειραματικές διαδικασίες που χρησιμοποιούν ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση του UC Davis. 1-2 × 10

6 κύτταρα /πλευρό ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές και οι όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν. Μόλις οι όγκοι έφθασαν 0,5 εκατοστά

3, 1×10

7 IFU (μολυσματικές μονάδες) φακοϊών που περιέχουν είτε κενό φορέα με GFP ή πρόδρομο ας-7c εγχύθηκαν εντός του όγκου. Στο τέλος των πειραμάτων, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αποκόπηκαν. Οροί συλλέχθηκαν για μέτρηση του PSA.

Ανθρώπινο PCa Δείγματα

Paired καλοήθων και καρκινικών ιστών του προστάτη παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Χειρουργικά δείγματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν ριζική προστατεκτομή δείγματα (ένα από ρομποτική χειρουργική) συγκεντρώνονται στο Johns Hopkins University από το 2002 έως το 2007. Τα δείγματα επιλέχθηκαν από την παγωμένη τράπεζα όγκων του προστάτη αν συνδυαστεί κατεψυγμένων όγκων εμπλουτισμένα για ιστολογικά φυσιολογικά και καρκινικά ζώνες ήταν διαθέσιμα. Κατεψυγμένα τεμάχια ήταν το χέρι στολισμένα να εμπλουτίσει περαιτέρω την ιστολογία του ενδιαφέροντος. Κατεψυγμένες τομές (7 μm) παρασκευάστηκαν από κάθε μπλοκ πριν από την εκχύλιση RNA. Η περιεκτικότητα του όγκου των δειγμάτων όγκου ήταν μεγαλύτερη από 80%, ενώ η κανονική δείγματα είχαν τουλάχιστον 60% περιεκτικότητα σε επιθήλιο και δεν υπήρξαν ενδείξεις παρούσας όγκου. Το πρώτο και το τελευταίο τμήματα για κάθε μπλοκ ήταν Η &? Ε χρώση και χρησιμοποιείται για τον υπολογισμό% επιθήλιο. Η χρήση των χειρουργικών δειγμάτων αποχαρακτηριστούν για μοριακή ανάλυση εγκρίθηκε από το IRB.

Στατιστικές Αναλύσεις

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SD. σύγκριση Πολλαπλές ομάδα διεξήχθη με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από την διαδικασία Scheffe για τη σύγκριση των μέσων.

P

& lt?. 0.05 θεωρήθηκε σημαντική

Αποτελέσματα

Ας-7c εκφράζεται σε προστάτη κύτταρα

προηγούμενες μελέτες μας, χρησιμοποιώντας miRNA μικροσυστοιχίες έδειξε ότι let -7c ήταν μεταξύ των πιο συχνά διαμορφώνεται miRNAs στα κύτταρα του προστάτη (αδημοσίευτα δεδομένα). Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης ας-7c σε κύτταρα PCa, απομονώσαμε τα συνολικά RNAs από LNCaP (εξαρτώμενων από ανδρογόνα, AR-θετικά), PC-3, DU145 (ευνουχισμός ανθεκτικά, AR-αρνητική) κύτταρα καθώς και LNCaP -S17 κύτταρα που εκφράζουν IL-6 [30] και τα κύτταρα LN-IL6 + χρόνια θεραπεία με IL-6 [31]. cDNAs αναλύθηκαν με ποσοτική RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές ενίσχυση την ώριμη μορφή της ας-7c (Exiqon) ειδικά. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ας-7c εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε κύτταρα LNCaP σε σύγκριση με τα PC-3 και DU145 κύτταρα ορμονοάντοχου (Εικ. 1Α). Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι η IL-6 και αφήστε-7 επιδεικνύουν αμοιβαία ρύθμιση της έκφρασης. LNCaP κύτταρα-IL6 + και LNCaP-S17 (αυτοκρινείς IL-6 σηματοδότηση) παρουσίασαν μείωση στα επίπεδα let-7c, σύμφωνα με την έκθεση ότι η IL-6 μειώνει την έκφραση ας-7 στα κύτταρα του προστάτη και ότι ας-7 ρυθμίζει IL-6 έκφραση [ ,,,0],18]. Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώθηκαν και από κηλίδωση northern χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή κατά την ακολουθία ώριμη let-7c (Εικ. 1Β), υποδηλώνοντας ότι αφήνω-7c τα επίπεδα μειώνονται σε πιο επιθετική και τον ευνουχισμό-ανθεκτικά κύτταρα του προστάτη.

Πρόσφατες εκθέσεις έδειξαν ότι η έκφραση της ας-7 οικογένεια miRNAs ρυθμίζεται από Lin28, έναν κύριο ρυθμιστή των miRNA επεξεργασίας [18], [20]. Συνεπής με τη διαπίστωση, βρήκαμε ότι η υπερέκφραση του Lin28 οδήγησε σε μείωση των επιπέδων let-7c σε κύτταρα LNCaP (Εικ. 1 C), ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του Lin28 χρησιμοποιώντας Lin28 shRNA οδήγησε σε αύξηση των επιπέδων let-7c (Σχ. 1D) σε C4-2B κύτταρα τα οποία εκφράζουν ενδογενή Lin28 (Εικ. 1 Ε). Προς τα κάτω ρύθμιση ή υπερέκφραση Lin28 επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western (Εικ Ένθετο 1C & amp?. D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι Lin28 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης ας-7c στα κύτταρα του προστάτη.

Ας-7c έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω στα ανθρώπινα προστάτη

Για να καθοριστεί εάν τα επίπεδα της αφήνω-7c έκφρασης μειωτικά στην κλινική PCa, αναλύσαμε RNAs από 10 ζεύγη καλοήθων και καρκινικών ανθρώπινων δειγμάτων προστάτη με ποσοτική RT-PCR. RNAs απομονώθηκαν από ανθρώπινους ιστούς, αντίστροφη μεταγραφή και υποβάλλεται σε qRT-PCR χρησιμοποιώντας LNA-συζευγμένο εκκινητές ας-7c (Exiqon). Τα επίπεδα let-7c ήταν σημαντικά μειωμένη σε 8/10 όγκους σε σύγκριση με συμφωνημένα καλοήθεις ιστούς του προστάτη τους (Εικ. 2Α). Αναλύσαμε επίσης δύο μικροσυστοιχίες ιστό που περιέχει καλοήθεις και καρκινικές βιοψίες του προστάτη, αντίστοιχα, από

in situ υβριδισμού

χρησιμοποιώντας LNA-συζευγμένο ώριμη ας-7c-ειδικό ανιχνευτή (Exiqon). Οι εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο Olympus IX81 και DP Controller Software. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ας-7c ήταν εντόνως εκφρασμένο σε καλοήθεις PCa, ενώ η έκφρασή του ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκινικό προστάτη (Σχ. 2Β). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι η απώλεια της έκφρασης ας-7c μπορεί να σχετίζεται με την ογκογένεση του προστάτη.

Δεδομένου ότι Lin28 είναι ένας βασικός ρυθμιστής της έκφρασης ας-7c, εξετάσαμε την έκφραση Lin28 στο 10 ζεύγη καλοήθων και καρκινικών δειγμάτων προστάτη από qRT-PCR με τη χρήση εκκινητών που ενισχύουν Lin28 mRNA συγκεκριμένα. Τα επίπεδα έκφρασης του Lin28 βρέθηκαν να είναι σημαντικά αυξημένα σε 9/10 ζεύγη αντιστοιχισμένων καλοήθων και καρκινικών δειγμάτων του προστάτη (Σχ. 2C). Έκφραση των Lin28 συσχετίστηκε αντίστροφα με την έκφραση της ας-7c με συντελεστή συσχέτισης του -0.4, γεγονός που υποδηλώνει ότι η έκφραση ας-7c ρυθμίζεται κυρίως από Lin28 σε ανθρώπινο προστάτη.

Ας-7c Μειώνει την ανάπτυξη του προστάτη κύτταρα σε Vitro

Για να προσδιορίσετε αν αφήσουμε-7c επηρεάζει την ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη, LNCaP, C4-2B, DU145, LNCaP-S17 και LN-IL6 + κύτταρα επιμολυσμένα με πλασμίδια που κωδικοποιούν ας-7c ή κενό φορέα και κυττάρων αριθμοί μετρήθηκαν μετά από 24 και 48 ώρες. Οι αριθμοί των κυττάρων του όλες τις κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν PCa ας-7c μειώθηκαν κατά -40% στις 48 ώρες (Σχ. 3Α-Ε). Ένθετα δείχνουν τα επίπεδα έκφρασης του πλασμιδίου let-7c σε αυτά τα κύτταρα. Για να καθοριστεί εάν η παρατηρούμενη μείωση στην ανάπτυξη των κυττάρων οφείλεται σε αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο, ο κατακερματισμός DNA αναλύθηκε με Θανάτου Κυττάρου Ανίχνευση ELISA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3F, απόπτωση σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ας-7c ενισχύθηκε σε σύγκριση με τους μάρτυρες, υποδηλώνοντας ότι η αναστολή της αύξησης των κυττάρων που προκαλείται από ας-7c οφείλεται εν μέρει στην αυξημένη αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο.

Κλωνογόνος (Α) και μαλακό άγαρ προσδιορίστηκαν σχηματισμού αποικιών (Β) ικανότητες των κυττάρων LNCaP-S17 και C4-2B επιμολυσμένα με let-7c ή κενό φορέα (Con). Ας-7c ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και την επιβίωση στο Anchorage-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τις συνθήκες. Γ) Κλωνογόνος δοκιμασία-Άνω και κάτω πάνελ αντιπροσωπεύουν τα μεγέθη των αποικιών των κυττάρων C4-2B και LNCaP-S17 εκφράζουν τον έλεγχο (κενό φορέα) ή αφήστε-7c, αντίστοιχα. Δ) μαλακό άγαρ δοκιμασία-Άνω και κάτω πάνελ αντιπροσωπεύουν τα μεγέθη αποικία C4-2B και LNCaP κύτταρα-S17 εκφράζουν τον έλεγχο (κενό φορέα) ή αφήστε-7c, αντίστοιχα. Ε) Αριθμός αποικιών που σχηματίζονται σε δοκιμασία κλωνοποίησης από τα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά C4-2B ας-7c. Ας-7c μειώθηκε ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν από τα κύτταρα του προστάτη. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν το μέσο ± SD δειγμάτων εις τριπλούν από δύο ανεξάρτητα πειράματα. Οι ράβδοι σφάλματος υποδηλώνουν ± SD (*

σ

& lt? 0,05).

Η

Επιπλέον, ελέγξαμε εάν ρύθμιση προς τα κάτω της ας-7c θα ενισχύσει την ικανότητα των ανδρογόνων-ευαίσθητα κύτταρα του προστάτη να μεγαλώνουν σε συνθήκες ανδρογόνων-στερηθεί. Εμείς επιμολυσμένα oligos αντι-νόημα έναντι ας-7c ή ελέγχου κωδικοποιημένο ολίγος σε κύτταρα LNCaP συμπληρωμένο με είτε FBS ή απογυμνωμένο με ενεργό άνθρακα FBS (CS-FBS) και παρακολουθήθηκε κυτταρική ανάπτυξη. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι προς τα κάτω ρύθμιση του let-7c από αντι-νόημα προωθείται εξαρτώμενων από ανδρογόνα κυτταρική ανάπτυξη LNCaP σε συνθήκες στέρησης ανδρογόνων (Σχ. 3G). Προς τα κάτω ρύθμιση let-7c από τα ολιγονουκλεοτίδια αντι-νόημα επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας qRT-PCR (Σχ. 3G, ένθετο). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι ο ευνουχισμός ανθεκτική ανάπτυξη του προστάτη μπορεί να χαρακτηρίζεται από μειορύθμιση της έκφρασης ας-7c.

C4-2B (Α), PC346C (Β) και κύτταρα DU145 (C) εγχύθηκαν σε αμφότερες τις πλευρές του γυμνά ποντίκια και οι όγκοι έλαβαν μία μοναδική ένεση εντός του όγκου φακοϊών εκφράζουν είτε GFP (έλεγχος) ή ας-7c. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε δύο φορές την εβδομάδα επί 3 εβδομάδες. Τα σημεία δεδομένων αναπαριστούν σημαίνουν ± SD του όγκου του όγκου (mm

3) όλων των ποντικών στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία. Δ) Η έκκριση του PSA από C4-2B και ξενομοσχεύματα PC346C μετρήθηκε σε ορούς ποντικού με ELISA. Ανασύσταση του let-7c στους όγκους μειωμένη έκκριση του PSA από τα ξενομοσχεύματα. Στο τέλος των πειραμάτων, οι ιστοί του όγκου αποκόπηκαν, τα συνολικά RNAs παρασκευάστηκαν και υποβλήθηκαν σε qRT-PCR για την εκτίμηση των επιπέδων mRNA του ας-7c (Ε) και Lin28 (F). Οι ράβδοι σφάλματος υποδηλώνουν ± SD (*

σ

& lt? 0,05).

Η

Αναλύσαμε επίσης κλωνογόνο ικανότητα των κυττάρων του προστάτη που εκφράζουν ας-7c και στις δύο αγκύρωση-εξαρτώμενη και αγκύρωση-ανεξάρτητο συνθήκες . LNCaP-S17 και C4-2B κύτταρα επιμολύνθηκαν με let-7c ή κενό δοκιμασίες φορέα και σχηματισμού αποικίας διεξήχθησαν. Αμφότερα κλωνογόνων κυττάρων (Σχ. 4Α) και μαλακό άγαρ αποικία (Εικ. 4Β) ικανότητες σχηματισμό LNCaP-S17 και C4-2B κατεστάλησαν από υπερέκφραση ας-7c. Ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν σε υποστρώματα από κύτταρα LNCaP-S17 μειώθηκε από 142 ± 15 έως 46 του ± 10 και ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν από τα κύτταρα C4-2B μειώθηκε από 122 ± 10 έως 34 ± 7 (Σχ. 4Α). Ομοίως, ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν σε μαλακό άγαρ από κύτταρα LNCaP-S17 μειώθηκε από 82 ± 4 έως 15 ± 2 και ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν από τα κύτταρα C4-2B μειώθηκε από 61 ± 5 έως 21 ± 5 (Σχ. 4Β ) από υπερέκφραση του let-7c. Επιπλέον, το μέγεθος των αποικιών που σχηματίστηκαν από τα κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα ήταν μεγαλύτερη σε σύγκριση με τις αποικίες που σχηματίζονται από ας-7c-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ 4C & amp?. D). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ας-7c μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων του προστάτη σε εξαρτώμενα από αγκίστρωση, καθώς και ανεξάρτητη από τις συνθήκες. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν επίσης με κλωνογονικού δοκιμασία σε κύτταρα C4-2B που εκφράζουν σταθερά ας-7c (Εικ. 4Ε).

Ας-7c αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων του προστάτη Ανθρωπίνων Κυττάρων Ξενομοσχεύματα

Εμείς παράγεται φακοϊών κωδικοποιεί πρόδρομο ας-7c GFP-tagged χρησιμοποιώντας το σύστημα έκφρασης Lentivector (Σύστημα Biosciences). Για να προσδιορίσετε αν αφήσουμε-7c εμφανίζει αντι-πολλαπλασιαστικές επιδράσεις σε προστάτη ξενομοσχεύματα

in vivo

, έχουμε ένεση 2×10

6 C4-2B ή PC346C (και οι δύο κυτταρικές σειρές είναι AR-θετικά) κύτταρα υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές του αρσενικού γυμνών ποντικών και παρακολουθήθηκε η ανάπτυξη όγκων. Μόλις οι όγκοι έφθασαν το μέγεθος 0,5 cm

3, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες. Η πειραματική ποντίκια έλαβαν μία μόνο ένεση εντός του όγκου lentivirally κωδικοποιείται ας-7c, ενώ τα ποντίκια ελέγχου έλαβαν φακοϊούς εκφράζουν GFP. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε επί 3 εβδομάδες, με μετρήσεις του όγκου δύο φορές την εβδομάδα. Στο τέλος της 3 εβδομάδες, οι όγκοι αποκόπηκαν, RNAs παρασκευάστηκαν και qRT-PCR εκτελέστηκε για την εκτίμηση των επιπέδων του ας-7c στα ξενομοσχεύματα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ανάπτυξη του όγκου του C4-2B (Εικ. 5Α) και PC346C (Εικ. 5Β) ξενομοσχεύματα αναστάλθηκε σημαντικά σε ποντικούς που ενέθηκαν με ας-7c που περιέχουν φακοϊούς σε σύγκριση με ποντικούς που έχουν εγχυθεί με φακοϊούς ελέγχου. Επιπλέον, ελέγξαμε επίσης αν αφήσουμε-7c μπορεί να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου του AR-αρνητικών ξενομοσχεύματα. Εμείς ένεση 1×10

6 DU145 κύτταρα /πλαισιώνουν υποδορίως σε αρσενικούς γυμνούς ποντικούς και εκτελείται παρόμοια πειράματα με το ήμισυ των ποντικών που έλαβαν μία μόνο ένεση εντός του όγκου λεντοϊών που κωδικοποιεί ας-7c και το άλλο μισό λαμβάνει φακοϊούς κωδικοποιεί τον κενό φορέα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ας-7c ήταν επιτυχής στην καταστολή της ανάπτυξης του όγκου ξενομοσχευμάτων DU145 παρόμοια με C4-2B ή ξενομοσχεύματα PC346C (Εικ. 5C). Επίπεδα PSA, ένα κλασικό γονίδιο στόχος του AR, που εκκρίνεται από τα AR-θετικών ξενομοσχευμάτων μετρήθηκαν στους ορούς ποντικού χρησιμοποιώντας ένα ανθρώπινο ειδικό PSA kit ELISA και ομαλοποιήθηκαν σε βάρη των όγκων. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η ένεση ας-7c εκφράζουν φακοϊούς μείωσε την έκκριση του PSA από τα ξενομοσχεύματα του όγκου του C4-2B και PC346C σύγκριση με φακοϊών ελέγχου (Σχ. 5D). qRT-PCR έδειξε ότι αφήνω-7c επίπεδα ήταν αυξημένη στους όγκους ένεση με αφήσει-7c-κωδικοποίηση φακοϊούς, ενώ τα επίπεδα της Lin28 μειώθηκαν (Σχήμα 5Ε & amp?. F). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση των αφήστε-7c καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη, και ότι η ανασύσταση των επιπέδων ας-7c μπορεί να παρουσιάσει μια ελκυστική θεραπευτική στρατηγική κατά της ανθρώπινης προστάτη.

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, διαπίστωσε ότι η έκφραση ας-7c ρυθμίζεται προς τα κάτω σε ευνουχισμό-ανθεκτικά κύτταρα του προστάτη και κλινικά δείγματα. Επιμόλυνση λεντοικής-κωδικοποιημένα let-7c ανέστειλε την ανάπτυξη και ικανότητας κλωνισμού των κυττάρων προστάτη και παράλληλα να ενισχύσει αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο. Αντιστρόφως, προς τα κάτω ρύθμιση ας-7c από αντι-νόημα ολιγονουκλεοτίδια προσέφερε ένα πλεονέκτημα επιβίωσης σε κύτταρα προστάτη σε ανδρογόνα γεμάτος καθώς και περιβάλλοντα ανδρογόνο εξαντληθεί. Εντός του όγκου ένεση lentivirally κωδικοποιούνται ας-7c ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ξενομοσχεύματος προστάτη, γεγονός που αποδεικνύει ότι οι λειτουργίες ας-7c ως καταστολέας των όγκων που αναστέλλει την ανάπτυξη των όγκων του προστάτη. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι miRNA ας-7c παίζει σημαντικό ρόλο στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του προστάτη και μπορεί να αξιοποιηθεί για θεραπευτικές εφαρμογές.

Οι μηχανισμοί καταστολής της ανάπτυξης του όγκου του προστάτη από ας-7c μπορεί να περιλαμβάνει την άμεση ή έμμεση ρύθμιση της έκφρασης επίπεδα ογκογονιδίων όπως Myc και Lin28. Σε μια πρόσφατη έκθεση, δείξαμε ότι αφήνω-7c στοχεύει την έκφραση του AR μέσω στοχεύει την έκφραση του Myc [32]. Το AR είναι ένας βασικός παράγοντας επιβίωσης για τα κύτταρα του όγκου του προστάτη και μείωση της έκφρασης της έχει αποδειχθεί ότι καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη [33]. Σε επιβεβαίωση αυτών των ευρημάτων, η έκφραση του PSA, ένα από τα κλασικά γονιδίων στόχων του AR, βρέθηκε να καταστέλλεται από ας-7c σε ξενομοσχεύματα του C4-2B και κυττάρων PC346C σε αυτή τη μελέτη.

Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι Lin28 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της έκφρασης let-7c [18], [21]. Αυτό είναι σύμφωνο με τις μελέτες μας δείχνουν ότι Lin28 καταστέλλει την έκφραση ας-7c στα κύτταρα του προστάτη. Η υπερέκφραση του Lin28 ανέστειλε την έκφραση ας-7c στα κύτταρα LNCaP, ενώ νοκ ντάουν της έκφρασης Lin28 αυξημένη ας-7c στα κύτταρα C4-2B. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι η υπερέκφραση των αφήστε-7c μείωσε τα επίπεδα έκφρασης Lin28 στους όγκους του προστάτη μοντέλα ξένου μοσχεύματος (Εικ. 5F), που δείχνει ότι υπάρχει μια αρνητική αλληλεπίδραση μεταξύ Lin28 και αφήστε-7c.

Αρκετές αναφορές έχουν καθιερώσει το σημαντικό ρόλο του let-7, που δείχνει ότι τα μέλη της οικογένειας ας-7 προς τα κάτω σε καρκίνους του πνεύμονα, και ότι αυτή η προς τα κάτω ρύθμιση συσχετίζεται με κακή επιβίωση [8]. Ένας ρόλος ογκοκατασταλτικό έχει αποδοθεί στην let-7 οικογένεια miRNAs και φαίνεται να αμφισβητείται, εκτός από σπάνιες περιπτώσεις, όπως ας-7α, η οποία έχει αναφερθεί ότι στοχεύουν κασπάσης-3 σε καρκίνους του ανθρώπου [34], καταστέλλοντας έτσι την ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων σε χημειοθεραπευτικούς-επαγόμενο κυτταρικό θάνατο. Στο κακόηθες μεσοθηλίωμα, αφήστε-7b * βρέθηκε να εκφράζεται έντονα [35] και η ρύθμιση προς τα πάνω του ας-7b και αφήστε-7i συνδέθηκε με μετασχηματισμό υψηλής ποιότητας σε λέμφωμα [36]. Αυτά τα αντικρουόμενα στοιχεία σχετικά με την απορρύθμιση της ας-7 σε διάφορους ανθρώπινους καρκίνους δείχνουν ότι η ατομική let-7 μέλη της οικογένειας μπορεί να έχουν διακριτές και διαφορετικές δραστηριότητες σε διαφορετικά κύτταρα και δεν απλά εμφανίζουν περιττές λειτουργίες.

Μια προηγούμενη μελέτη από Dong et al. [37] ανέφερε ότι αφήνω-7α καταστέλλει την ανάπτυξη όγκων του προστάτη με τη στόχευση E2F2 και CCND2. Οι μελέτες μας δείχνουν ότι αφήνω-7c καταστέλλει την ανάπτυξη του όγκου του προστάτη από διάφορες οδούς συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης της IL-6, myc, Lin28 και το AR [32]. Επιπλέον, η άμεση ανασύσταση της ας-7c με ένεση lentivirally κωδικοποιούνται 7c αφήσει-σε καθιερωμένους όγκους ξενομοσχεύματος σηματοδοτεί ένα σημαντικό βήμα προς την κατεύθυνση των μελλοντικών θεραπευτικών στρατηγικών μέσω αφήστε-7c. Ακόμη και αν τα μέλη της οικογένειας let-7 μπορεί να παρουσιάζει κάποιες περιττές λειτουργίες, μεμονωμένων συστατικών μπορεί να υπόκειται σε διαφορική και ιστο-ειδική ρύθμιση σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων.