Αφηρημένο

Η πιθανή εφαρμογή της πολυπλεξίας κβαντικής επισήμανση τελεία (MQDL) για την ανίχνευση του καρκίνου και την πρόγνωση και την παρακολούθηση θεραπευτικών απαντήσεων έχει προσελκύσει τα συμφέροντα των bioengineers, παθολόγους και βιολόγοι του καρκίνου. Πολλές δημοσιευμένες μελέτες υποστηρίζουν ότι MQDL είναι αποτελεσματική για την ανίχνευση του καρκίνου του βιοδείκτη και χρήσιμη στη διάγνωση του καρκίνου και την πρόγνωση, οι μελέτες αυτές δεν έχουν τυποποιηθεί σε σχέση με ποσοτικούς βιοχημικές και μοριακές αναλύσεις. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα μοριακά χαρακτηριζόμενη μοντέλο ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη που δεικνύουν ενεργοποιημένο c-Met σηματοδότηση με επιθηλιακά να μεσεγχυματικά μετάβασης (ΕΜΤ) και θανατηφόρο μεταστατική εξέλιξη στα οστά και τους μαλακούς ιστούς, όπως το πρότυπο χρυσό, και συνέκρινε την c-Met κύτταρο δίκτυο σηματοδότησης σε αυτό το μοντέλο, σε κλινικά δείγματα ιστών καρκίνου του προστάτη του ανθρώπου και σε ένα ανθρώπινο προστάτη μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου ευνουχισμό ανθεκτικά. Παρατηρήσαμε c-Met σηματοδότηση ενεργοποίηση του δικτύου, που εκδηλώνεται με αυξημένη φωσφορυλιωμένη c-Met σε όλες τις τρεις. Ο μεταγενέστερος δίκτυο σηματοδότησης επιβίωσης επιτεύχθηκε με τη μεσολάβηση του ΝΡ-κΒ και Mcl-1 και ΕΜΤ οδηγήθηκε από ενεργοποιητή υποδοχέα του ΝΡ-κΒ προσδέτη (ΚΑΝΚΕ), στο επίπεδο του ενός κυττάρου σε κλινικά δείγματα καρκίνου του προστάτη και του μοντέλου ξενομοσχεύματος. Τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR και στυπώματα Western σε ένα μοντέλο ανθρώπινων κυττάρων καρκίνου του προστάτη. MQDL είναι ένα ισχυρό εργαλείο για την αξιολόγηση της έκφρασης βιοδεικτών και προσφέρει μοριακή γνώσεις σχετικά με την εξέλιξη του καρκίνου τόσο σε επίπεδο κυττάρων και ιστών με υψηλό βαθμό ευαισθησίας

Παράθεση:. Hu P, Chu GC-Υ, Zhu G, Γιανγκ Η, Luthringer D, Prins G, et al. (2011) Πολυπλεκτικά Quantum Dot Σήμανση των Ενεργός c-Met σηματοδότηση στα Ευνουχισμός-Resistant ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 6 (12): e28670. doi: 10.1371 /journal.pone.0028670

Συντάκτης: Dean G. Τανγκ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας ΜΌ Anderson Κέντρο Καρκίνου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21η Οκτωβρίου του 2011? Αποδεκτές: 12 Νοεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 21, Δεκεμβρίου, 2011

Copyright: © 2011 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις έρευνας 2PO1CA098912 και 1RO1CA122602 των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας /Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, και του καρκίνου του προστάτη Βραβείο Ιδρύματος Challenge (LWK Chung). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ημιαγωγών κβαντικές τελείες (ΚΤ) έχουν φθορίζοντα νανοσωματίδια έχουν αναγνωριστεί ως μία από τις μεγάλες πρόσφατες εξελίξεις για την ικανότητά μας να ανιχνεύσουμε τις σχετικές βιοδεικτών που εκφράζεται από τα κύτταρα, τους ιστούς και οι οροί [1], [2], [3 ], [4], [5]. Οι μοναδικές οπτικές και ηλεκτρονικές ιδιότητες των ΚΤ περιλαμβάνουν στενό και συμμετρικές ζώνες εκπομπών τους, μεγέθους- και το υλικό-ρυθμιζόμενους εκπομπής φωτός, υψηλή αναλογία επιφάνειας προς όγκο, photostability, φωτεινότητα σήματος και ευαισθησία, και ταυτόχρονη διέγερση πολλαπλών χρωμάτων φθορισμού καθιστώντας δυνατή την ανίχνευση πολλαπλούς στόχους ταυτόχρονα στο επίπεδο του ενός κυττάρου [3], [6]. Quantum επισήμανση dot, QDL, είναι ανώτερη από τις συμβατικές οργανικές βαφές για κυττάρων και χρώση των ιστών, ιδίως μετά την τελευταία απόδοση ευρείας ζώνης με επικαλυπτόμενες εκπομπές σήματος και είναι ιδιαίτερα ευαίσθητοι σε φωτολεύκανση. Πολυπλεξία βιοδείκτες με διαφορετικά χρώματα παρέχει σημαντικά πλεονεκτήματα έναντι των παραδοσιακών οργανικών ή φθορίζουσες χρωστικές για την ανίχνευση και την ανάλυση των δυναμικών μεταβολών σε πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα σε κύτταρα ή ιστούς κάτω από παθοφυσιολογικές συνθήκες. QDL έχει εφαρμοστεί με επιτυχία για την ανίχνευση των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων

in situ

συνδέονται με σημαντικές βιολογικές διεργασίες, όπως επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση [6] σε μετάσταση καρκίνου [7], πρωτεΐνη βιοδείκτες στο αίμα, η παρουσία των νουκλεϊκών οξέων, microRNA και μεθυλίωση του DNA σε ορούς ή ιστού εκχυλισμάτων με δείγματα γραμμικό κώδικα για την ταχεία επεξεργασία με αυτοματοποιημένα πρωτόκολλα [8], [9], [10]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε πολυπλεκτικές επισήμανση κβαντική τελεία (MQDL) για την ανίχνευση του ενεργοποιημένου c-Met μεσολάβηση οδός σηματοδότησης των κυττάρων που οδηγεί σε EMT, την ανάπτυξη του καρκίνου και των οστών και τη μετάσταση των μαλακών ιστών σε ένα μοντέλο μετάστασης του καρκίνου του νέου προστάτη [11], [ ,,,0],12], [13]. Επιβεβαιώσαμε τα επίπεδα της γονιδιακής έκφρασης εκτιμήθηκε με MQDL με την έκφραση του γονιδίου, όπως προσδιορίζεται με RT-PCR και στυπώματα western. Στη συνέχεια εφαρμόζεται το πρωτόκολλο MQDL να καθορίσει εάν η οδός σηματοδότησης των κυττάρων c-Met και EMT ενεργοποιούνται σε ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη (CRPC) ζωικό μοντέλο και στην κλινική του προστάτη δειγμάτων καρκίνου που λαμβάνεται από ασθενείς με υψηλές βαθμολογίες Gleason και μετάσταση στα οστά. Παρατηρήσαμε ότι η ενεργοποίηση του c-Met είναι στενά συνδεδεμένη με ΕΜΤ σε καρκινικά κύτταρα και την επακόλουθη αυξημένη μετανάστευση, εισβολή και μετάσταση τους [14], [15], [16]. c-Met ενεργοποίησης σήματος στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη έχει σημαντικές κλινικές επιπτώσεις: 1) c-Met κατάντη σηματοδότησης οδηγεί ΕΜΤ και μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων, εισβολή, μετάσταση και επιβίωση σε αρκετά μοντέλα ανθρώπινων στερεών όγκων, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του προστάτη [15], [17], [18], [19]. 2) Από το στόχευσης c-Met και VEGFR2 κατάντη σηματοδότησης με ένα συνθετικό αναστολέα πολλαπλές κινάσης τυροσίνης, cabozantinib (XL-184), είχε ως αποτέλεσμα αξιοσημείωτη ανάλυση του οστού και των μαλακών ιστών μεταστάσεων σε έναν μεγάλο αριθμό ασθενών με συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων CRPC ασθενών [20 ], [21], θα ήταν σημαντικό να δείξει αν αυτές τις κυτταρικές οδούς σηματοδότησης θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί σε κλινικά δείγματα και σε σχετικά μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου. Χρησιμοποιήσαμε ένα ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή για να αποδειχθεί ότι η ενεργοποίηση c-Met παρέχει ΕΜΤ και τον καρκίνο του προστάτη και οι μεταστάσεις των οστών των μαλακών ιστών και διερευνήθηκε σε βάθος η ενεργοποίηση c-Met σηματοδότηση από μοριακές αναλύσεις με αποτελέσματα επιβεβαιώνονται από MQDL. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση MQDL ενεργοποίηση c-Met σηματοδότηση σε δείγματα καρκινικού ιστού κλινική προστάτη και συσχετίζονται τα αποτελέσματα με ένα ανθρώπινο προστάτη μοντέλο ξενομοσχεύματος καρκίνου ευνουχισμό ανθεκτικά. Δείξαμε ότι MQDL, σε συνδυασμό με Vectra Ανάλυση εικόνας, ενισχύει την ποσοτική ικανότητα χαρακτηριστικών των επιμέρους βιοσημειωτών στο επίπεδο του ενός κυττάρου. Μια σειρά βιοδεικτών που σχετίζονται με EMT, όπως η μειωμένη έκφραση του EpCAM, και αυξημένη έκφραση του Ν-καδερίνης, βιμεντίνη και RANKL, και ενεργοποίηση του σήματος c-Met, συμπεριλαμβανομένων των VEGF, νευροπιλίνη 1, PC-Met και φωσφο (p) -NF -κB p65 [15], [22], αναλύθηκαν. Τα αποτελέσματα αυτών των μελετών έδειξαν μια αξιοσημείωτη παραλληλισμό του ΕΜΤ και ενεργοποίηση c-Met μεταξύ του μοντέλου κύτταρο καρκίνου του προστάτη, του CRPC μοντέλο ξενομοσχεύματος και κλινικά δείγματα καρκίνου του προστάτη. Οι μεθοδολογίες που καθορίζονται στην παρούσα μελέτη θα μπορούσε να έχει σημαντική αξία στο εγγύς μέλλον να χαρακτηρίσει άλλες οδοί ενεργοποιούνται σηματοδότησης σε κλινικά δείγματα, ανακρίνουν μοριακών μηχανισμών που διέπουν την εξέλιξη του καρκίνου, τον εντοπισμό druggable στόχους, και να παρακολουθούν την κλινική ανταπόκριση των ασθενών σε θεραπευτική παρέμβαση.

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση κυττάρων

Η κυτταρική σειρά LNCaP, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον πρώην Δρ Gary Miller του Πανεπιστημίου του Κολοράντο (Ντένβερ, CO), ήταν καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen) συμπληρωμένου με ορό 5% εμβρυϊκό ορό (Atlanta Biologicals, Lowrenceville, GA), πενικιλλίνη (100 μg /ml) και τετρακυκλίνη (100 U /ml) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2. Η δημιουργία των κλώνων που υπερεκφράζουν RANKL πρωτεΐνη αναφέρθηκε προηγουμένως [23]. Εν συντομία, ένα πλήρους μήκους cDNA που κωδικοποιεί την ανθρώπινη RANKL από ΟηΟεηε (Rockville, MD) κλωνοποιήθηκε μονοκατευθυντικά να ρ3 χ FLAG- myc-CMV-25 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) στις θέσεις ενζύμου περιορισμού NotI και XbaI. Μετά την επιμόλυνση των κυττάρων LNCaP σε 75% συρροή με RANKL σημαία-tagged και neo πλασμίδιο χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σε ένα 6-φρεατίων για 48 ώρες, τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν και σπάρθηκαν πάνω σε ένα τρυβλίο 15 εκατοστών. Οι σταθερές LNCaP-neo και LNCaP-RANKL κύτταρα υποβλήθηκαν σε επιλογή με G418 (400 μg /ml) και μεμονωμένοι κλώνοι κυττάρων απομονώθηκαν και διατηρήθηκαν σε 200 μg /ml G418 για RNA και εκχύλιση πρωτεΐνης και ανοσοδοκιμασία χρησιμοποιώντας 8 φρεατίων θαλάμων διαφανειών (Thermo Επιστημονική, Rochester, ΝΥ). επιλέχθηκαν τρεις LNCaP-RANKL και 2 κλώνους κυττάρων LNCaP-neo. Από βιοχημική φαινότυποι τους ήταν παρόμοιες χρησιμοποιήσαμε ένα κλώνο από το καθένα για τη μελέτη.

ανάστροφης μεταγραφάσης (RT) PCR

Το ολικό RNA από κύτταρα απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen Sciences, Inc. ? Germantown, MD) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Συμπληρωματικό DNA (cDNA) παράχθηκε από 3 μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας SuperScript® III First-Strand Synthesis System (Invitrogen? 1 μΙ cDNA υποβλήθηκε σε αναλύσεις PCR χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους εκκινητές: RANKL F, 5′-TGG ATC ACA GCA ΟΑΤ CAG AGC AG-3 ‘? RANKL R, 5′-ΤΟΟ GGC TCA ATC ΤΑΤ ATC TCG AAC-3′? E-cadherin F, 5’-GCC ΑΑΟ CAG CAG TAC ΑΤΤ CTA CAC G-3 ‘? E-cadherin R , 5’-GCT GTT CTT CAC ΟΤΟ CTC ΑΑΑ ATC C-3 ‘? Ν-cadherin F, 5′-GAT GTT GAG GTA CAG ΑΑΤ CGT? Ν-cadherin R, 5′-GGT CGG TCT GGA ΤΟΟ CGA-3′ ? βιμεντίνη F, 5′-GGA CTC GGA GGT CTT CTC? βιμεντίνη R, 5’-CGC ATC TCC TCC TCG TAG-3 ‘, c-Met F, TGGGAATCTGCCTGCGAA?. c-Met R, CCAGAGGACGACGCCAAA Οι κύκλοι PCR αντίδρασης που εμπλέκονται ένας αρχική μετουσίωση στους 94 ° C για 10 λεπτά, 36 κύκλοι των 94 ° C, 1 λεπτό, 55 ° C, 30 sec? για RANKL72 ° C, 1 λεπτό ακολουθούμενο από μια τελική 72 ° C για επέκταση 10 min για το E-cadherin. και ενίσχυση του γονιδίου Ν-καδερίνης, τα PCR αντιδράσεις έτρεξαν για 32 κύκλους και οι θερμοκρασίες ανόπτησης ήταν 55 ° C και 47 ° C, αντίστοιχα, για 30 δευτερόλεπτα. για βιμεντίνη και GAPDH ενίσχυσης, οι αντιδράσεις PCR έτρεξαν για 28 κύκλους με θερμοκρασία ανόπτησης στους 48 ° C για 30 sec. Τα ενισχυμένα προϊόντα της PCR ανιχνεύθηκαν και αναλύθηκαν σε πήκτωμα 1% αγαρόζης

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό RIPA που περιέχει 1 χ κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Thermo Fisher Scientific? Rockford, IL). και φυγοκεντρήθηκαν και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και προσδιορίστηκαν ποσοτικά με τη χρήση της πρωτεΐνης Bradford Assay (Thermo Fisher Scientific). Τα προϊόντα λύσης κυττάρου (20-30 μα) διαχωρίστηκαν σε 4-12% Bis-Tris κλίση SDS-PAGE (Invitrogen? Carlsbad, CA) υπό αναγωγικές συνθήκες, που ακολουθείται από διαστύπωσης σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (BioRad Laboratories? Hercules, CA), και αποκλείστηκαν σε 5% γάλα χωρίς λιπαρά /PBST για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου (RT) και επωάστηκαν με αραιωμένο πρωτογενή Abs σε ρυθμιστικό διάλυμα παρεμπόδισης στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Η πηγή και η αραίωση του πρωτογενούς Abs ήταν: RANKL (SC-74261? 1:400), Ε-καντερίνη (SC-7870? 1:1000), βιμεντίνη (SC-6260? 1:500), c-Met (SC- 10? 1:500) (Santa Cruz Biotechnology? Santa Cruz, CA), Ν-cadherin (# 610920? 1:200) (BD Transduction Laboratories? San Jose, CA και Santa Cruz Biotechnology), π-Met (Tyr-1230 /34/35) (# 44888G? 1:500) (Invitrogen), ρ-ΝΡ-κΒ ρ65 (Ser536) (# 3033? 1:1000), ΝΡ-κΒ ρ65 (# 4764? 1:1000) (κυτταρική σηματοδότηση τεχνολογία? Danvers, ΜΑ). Παραγωγή και χρήση των ανδρογόνων αντισώματος υποδοχέα (PG21? 1:500) έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [24]. Οι μεμβράνες ξεπλύθηκαν 3 χ με PBST, επωάστηκαν με συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-ποντικού ή δευτερογενή Abs αντι-κουνελιού σε RT για μία ώρα και ξεπλένεται 3 χ με PBST. Τα σήματα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ECL Plus (GE Healthcare Βιοεπιστημών? Pittsburg, ΡΑ). Επαναφορά Plus Western Blot απογύμνωσης Buffer (Thermo Fisher Scientific) χρησιμοποιήθηκε πριν από την εκ νέου διερεύνηση με διαφορετικές Abs.

In vivo πειράματα

Όλες οι διαδικασίες ζώων πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με εγκεκριμένο πρωτόκολλο από το Θεσμικό Animal Care και Επιτροπή Χρήσης (IACUC # 2999, Cedars-Sinai Medical Center, και A10-0100, University of British Columbia). LNCaP-RANKL και LNCaP-neo κύτταρα (1 χ 10

6 κύτταρα /50 μΙ PBS) εμβολιάστηκαν ενδοκαρδιακά σε 5- έως 7-εβδομάδων αρσενικών αθυμικών γυμνών ποντικών (Charles River? N = 20 για LNCaP-RANKL και n = 15 για LNCaP-neo). Όλα τα ποντίκια παρακολουθούνται τακτικά για μεταστατικό σχηματισμό όγκου που συνέβη για πρώτη φορά σε 8 εβδ. Τα ζώα θυσιάστηκαν στις 12 εβδ.

δείγματα καρκίνου του προστάτη ιστό

φορμόλη-σταθερές και εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη ελήφθησαν από το Τμήμα Παθολογίας των Κέδρων-Sinai Medical Center (IRB # Pro 00021228). Πρόσθετες δείγματα ιστών κλινική του καρκίνου του προστάτη ελήφθησαν από το Δρ Fouad Habib στο Πανεπιστήμιο του Εδιμβούργου, Σκωτία, και ο Δρ Hua Yang στο Πανεπιστήμιο Jilin, Κίνα. Χρήση των κλινικών δειγμάτων εγκρίθηκε από τις επιτροπές θεσμική αναθεώρηση ανθρώπινο ιστό στα αντίστοιχα όργανα.

CRPC ξενομοσχευμάτων

Για να διαπιστωθεί πρωτόκολλα εργασίας για την ενιαία και διαδοχική επισήμανση πολλαπλές QD, επιλέξαμε να χρησιμοποιήσετε ένα LTL -313 CRPC μοντέλο ξενομοσχεύματος, δεδομένου ότι μιμείται τον ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη και παρέχει συνεπή και άμεσα διαθέσιμα δείγματα πολλαπλές ιστού κρίσιμη για την ανάπτυξη και την δημιουργία ενός νέου πρωτοκόλλου MQDL. FFPE ιστούς από ένα ανθεκτικό ευνουχισμό καρκίνο του προστάτη μοντέλο ξενομοσχεύματος (CRPC) LTL-313 (ζωντανό εργαστήριο του όγκου, www.livingtumorcentre.com) ελήφθησαν από το Βανκούβερ Cancer Center, BC Cancer Agency του, Βανκούβερ του Καναδά. Η γραμμή του όγκου LTL-313 αναπτύχθηκε από δείγμα βιοψίας βελόνα του προστάτη από έναν ασθενή ηλικίας 80 ετών με διάγνωση καρκίνου του Gleason Σχολίων 8 του προστάτη με ένα επίπεδο PSA στον ορό του 17 ng /ml κατά τη στιγμή της διάγνωσης [25]. Το πρωτόκολλο ανάπτυξης γραμμή όγκου εγκρίθηκε από την Κλινική Διοικητικό Συμβούλιο Έρευνας Ηθικής του Πανεπιστημίου της Βρετανικής Κολομβίας, σύμφωνα με τις οδηγίες του εργαστηρίου Ζώων του Ινστιτούτου Πειραματικής Animal Επιστημών (Ανθρώπινη χρήση δείγματος ήταν με εγκρίσεις από το Πανεπιστήμιο της British Columbia, στον Καναδά (IRB # UBC BCCA REB # H04-60131). Εν συντομία, για τη δημιουργία ευνουχισμό ανθεκτικό καρκίνο του προστάτη, φρέσκα ιστούς όγκων LTL-313 από την 5η γενιά μεταμόσχευση κόπηκαν σε κομμάτια 3 × 3 × 1 mm και ξανά εμβολιάζονται υπό τη νεφρική κάψουλες αρσενικών NOD-SCID ποντικούς. τα ζώα διατηρήθηκαν για σχηματισμό όγκου για δύο μήνες πριν από τον ευνουχισμό για να απομακρυνθεί ανδρογόνα. Τρεις εβδομάδες μετά τον ευνουχισμό, όταν ο όγκος του όγκου ήταν σημαντικά μειωμένη, τα υπόλοιπα καρκινικοί ιστοί συλλέχθηκαν και παρασκευάζονται όπως τμήματα ιστού FFPE. Xenongraft ιστοί που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη προήλθαν από 9 όγκους από ευνουχισμένους ποντικούς και 5 όγκους από 5 ανέπαφο ξενιστές ποντίκι συμπληρωμένο με τεστοστερόνη που είχαν υποβληθεί σε εικονική λειτουργία.

αντιδραστήρια ανοσοανιχνεύσεως

Τα πρωτογενή αντισώματα (Ab) και τις πηγές τους ήταν: ποντίκι μονοκλωνικά Abs για την ανθρώπινη EpCAM (VU-1D9) και RANKL (12A668) από Novus Biologicals (St. Charles, MO)? ποντίκι μονοκλωνικό Ab προς c-Met (25H2) και μονοκλωνικών κουνέλι Ab προς Ε-καδερίνης (24E10) από την Cell Signaling Technology? κουνελιού πολυκλωνικό Ab προς υποδοχέα ανδρογόνου, AR, (PG 21), που παρέχονται από τον Δρ Gail Prins από το Πανεπιστήμιο του Ιλλινόις (Urbana, IL)? κατσίκα πολυκλωνικό Ab να νευροπιλίνη-1 (C-19), κουνέλι πολυκλωνικό Abs σε Ν-καντερίνη (H-63), Mcl-1 (S-19), ρ-ΝΡ-κΒ ρ65 (Ser 536) και VEGF (Α -20) από την Santa Cruz Biotechnology, Inc .; και κουνελιού πολυκλωνικό Ab σε ρ-c-Met (pYpYpY1230 /1234/1235) από την Invitrogen. Δευτερεύουσα Abs που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη παρασκευάστηκαν σε ένα κοκτέιλ βιοτινυλιωμένου Abs ποντικού, κουνελιού, και IgG κατσίκας (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA). Φωσφορικό ρυθμισμένο αλατούχο διάλυμα (PBS) και στρεπταβιδίνη συζευγμένη με ΚΤ στο 565-, 585-, 605-, 625- μήκη κύματος, 655- και 705 nm ως 1 μΜ διάλυμα παρακαταθήκης αγοράσθηκαν από την Invitrogen.

Ανοσοϊστοχημική (IHC ) χρώση

IHC ακολούθησε δημοσιευμένο πρωτόκολλο μας [26] με μικρές τροποποιήσεις. τμήματα FFPE (4 μm) αποπαραφινοποιήθηκαν, επανυδατώθηκαν, και υποβλήθηκαν σε ανάκτηση αντιγόνου. Μετά από επώαση σε διάλυμα Διπλή ενδογενές ένζυμο Block (Deeb, Dako, Carpinteria, CA) για 10 λεπτά, το τμήμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία με πρωτογενές αντίσωμα αραιωμένο με διάλυμα αραιωτικό αντισώματος (Dako) ως ακολούθως: RANKL (1:100), c-Met ( δύο παρα δέκα), νευροπιλίνη 1 (1:100), υποδοχέα ανδρογόνου (1:200), Ν-καδερίνη (1:100), Mcl-1 (1:100)? p65 p-NF-κΒ (Ser536) (1:100), VEGF (1:50) και pc-Met [pYpYpY1230 /1234/1235] (1:100), βιμεντίνη (1:100), και Ε-καδερίνη ( 1:200) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Το τμήμα στη συνέχεια πλύθηκε 3 φορές σε PBST (PBS που περιέχει 0.2% Tween 20) για 5 λεπτά ανά πλύση. Για να ανιχνευθεί ειδική χρώση, το τμήμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 30 λεπτά με EnVision

+ διπλής σύνδεσης System-HRP (Dako), το οποίο περιείχε συζευγμένο με υπεροξειδάση αρμορακίας κατσίκα αντισώματα σε ποντικού και κουνελιού Ig. Το τμήμα πλύθηκε 3 φορές για 5 λεπτά η κάθε μία, και ειδικά τους λεκέδες αναπτύχθηκαν με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (Dako).

Ενιαίου QD επισήμανση (SQDL)

Το πρωτόκολλο κηλίδωσης ήταν τροποποιηθεί για την επισήμανση και μόνο QD. Στρεπταβιδίνη συζευγμένη με ΚΤ (565-, 585-, 605-, 625-, 655- και 705 nm) παρασκευάσθηκαν ως 10 ηΜ σε PBS με 6% IgG-free, χωρίς πρωτεάση BSA (Jackson Immunoresearch? West Grove, ΡΑ) . Αντιγόνο αφαιρεθέντες ιστοί ή δείγματα σταθερού κυττάρων επωάστηκαν σε PBS που περιέχει 2.5% ορό αλόγου (Vector Laboratories) και 20% Αντιδραστήριο Στρεπταβιδίνη Block (Invitrogen) για 20 λεπτά, που ακολουθείται από κατεργασία με το πρωτογενές Abs όπως περιγράφεται παραπάνω στην παραπάνω ενότητα ανοσοαντιδραστήρια σε PBS συν 1% ορό αλόγου και 20% Αντιδραστήριο Βιοτίνη Block (Invitrogen) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από 3 × 5 λεπτά PBST (PBS + 0.4% Triton Χ-100) δείγματα έκπλυσης επωάστηκαν με το δευτερεύον κοκτέιλ Ab σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με το αντίστοιχο στρεπταβιδίνη-QD σε 37 ° C για 60 λεπτά. Στο τέλος του κάθε επώαση, τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ρουτίνα 3 × 5 λεπτά PBST (PBS + 0.4% Triton Χ-100) ξέβγαλμα. Μετά την τελική έκπλυση, τα πλακίδια τοποθετούνται σε υδατικά μέσα στερέωσης περιέχουν 4’6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ) (Vector Laboratories) για την απεικόνιση. Οι αραιώσεις Ab περιγράφονται στην ενότητα IHC παραπάνω.

Πολυπλεκτικά QD επισήμανση (MQDL)

Το ενιαίο πρωτόκολλο επισήμανσης QD τροποποιήθηκε για MQDL, στην οποία ένα μόνο τμήμα ιστού υποβλήθηκε σε χρώση για πολλαπλούς δείκτες με διαδοχικό τρόπο. Για κάθε δοκιμή βιοδεικτών, την επισήμανση ξεκίνησε με μπλοκάρισμα στρεπταβιδίνης, ακολουθούμενη από πρωτογενή αντίδραση Ab και βιοτινυλιωμένο δευτερογενές Ab επώαση, και αντίδραση με στρεπταβιδίνη συζευγμένη με QD σε ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος. Οι τομές επωάστηκαν διαδοχικά (με 3 × 5 λεπτά PBST ξέβγαλμα μετά από κάθε επώαση). Πρωτοβάθμια Abs και αραιώσεις σε MQDL ήταν ταυτόσημες με αυτές που χρησιμοποιούνται για SQDL. Οι αλληλουχίες ανοσοαντίδραση ήταν: 1) Αντι-νευροπιλίνη-1 Ab, 2 ώρες, θερμοκρασία δωματίου? βιοτινυλιωμένη αλόγου αντι-κατσίκα IgG, σε θερμοκρασία δωματίου, 30 λεπτά? στρεπταβιδίνη QD705, στους 37 ° C, 1 ώρα. 2) Αντι-ρ-c-Met Ab, στους 4 ° C, όλη τη νύχτα? βιοτινυλιωμένη αλόγου αντι-κουνελιού IgG, σε θερμοκρασία δωματίου, 30 λεπτά? στρεπταβιδίνη QD655 στους 37 ° C, 1 ώρα. 3) Αντι-VEGF Ab, σε θερμοκρασία δωματίου, 2 ώρες? βιοτινυλιωμένη αλόγου αντι-κουνελιού IgG, σε θερμοκρασία δωματίου, 30 λεπτά? στρεπταβιδίνη QD625 στους 37 ° C, 1 ώρα. 4) Αντι-ρ-p65-ΝΡκΒ Ab στους 4 ° C, όλη τη νύχτα? βιοτινυλιωμένη αλόγου αντι-κουνελιού IgG σε θερμοκρασία δωματίου, 30 λεπτά? στρεπταβιδίνη QD565 στους 37 ° C, 1 ώρα. 5) Αντι-RANKL Ab σε θερμοκρασία δωματίου, 2 ώρες? βιοτινυλιωμένη αλόγου αντι-ποντικού IgG σε θερμοκρασία δωματίου, 30 λεπτά? στρεπταβιδίνη QD585 στους 37 ° C, 1 ώρα. 6) Τοποθέτηση σε μέσα στερέωσης υδατικό περιέχει DAPI. Οι συγκεντρώσεις Ab περιγράφηκαν στην ενότητα IHC. Τμήματα του FFPE LNCaP-RANKL καρκινικά κύτταρα ανθρώπινου προστάτη, χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος. Για αρνητικό έλεγχο, πρωτογενείς Abs αντικαταστάθηκαν με isotype- και τα είδη ταιριαστό Abs ελέγχου και εφαρμόστηκε σε μια αμέσως γειτονική τομή ιστού, και MQDL διεξήχθη παράλληλα με την τσουλήθρα ιστό επισημασμένο με τη δοκιμή πρωτογενούς Abs.

Εικόνα απόκτηση

Ένα σύστημα CRI φασματικής απεικόνισης (δαγκάνα Life Sciences, Hopkinton, ΜΑ) με ενσωματωμένο λογισμικό v3.1 Nuance χρησιμοποιήθηκε για να τεκμηριώσει πολυφασματικές εικόνες παρακάτω συνιστώμενο πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Για κάθε πεδίο του καρκινικού ιστού, σειριακές εικόνες αποκτήθηκαν σε ένα διάστημα μήκους κύματος 10 nm 450-800 nm, μια περιοχή που επιλέγεται αντιστοιχεί στο ενεργό φθορισμού ΚΤ. Παράγει μια μη επεξεργασμένη εικόνα «κύβου» ως μια στοίβα από 36 ξεχωριστές εικόνες με κάθε εικόνα περιέχει την πλήρη φασματική πληροφορία για κάθε pixel σε αυτό το συγκεκριμένο μήκος κύματος. Όλες οι εικόνες αποκτήθηκαν στα 400 × μεγέθυνση, με μια έκθεση 50 χιλιοστά του δευτερολέπτου. Για να αποφύγετε διακυμάνσεις στην επισήμανση οφείλεται σε κυτταρική ετερογένεια, ελήφθησαν πέντε εικόνες από διάφορες καρκινικές περιοχές ιστού για κάθε δείγμα ιστού για μετέπειτα ποσοτικοποίηση.

Αποσυνέλιξη Εικόνα

χρησιμοποιήθηκε αποσυνέλιξη εικόνας ή το πρωτόκολλο unmixing να εξαγάγετε ειδική σήμανση με ένα συγκεκριμένο QD. Μια φασματική βιβλιοθήκη για 565, 585, 605, 625, 655, και 705 nm χτίστηκε για αποσυνέλιξη από performimg πολλαπλές SQDLs χρησιμοποιώντας υποδοχέα ανδρογόνων (AR) αντισωμάτων χωρίς τελικό DAPI αντικηλίδωση για σειριακά παρακείμενα τμήματα ιστού. Η θετική επισήμανση των AR επιβεβαιώθηκε με παράλληλη χρώση IHC σε γειτονικούς ιστούς. Το φάσμα του ϋΑΡΙ ελήφθη με την τοποθέτηση του παρακείμενου ιστού μέσα στο υδατικό μέσο στερέωσης περιέχει DAPI. Φάσματα του αυτοφθορισμού ιστού αποκτήθηκαν για κάθε ιστό από μια αρνητική πλάκα ελέγχου (βλέπε παράγραφο MQDL) που παρασκευάζεται από την IHC χωρίς δείκτες φθορισμού. μείωση αυτοφθορισμό πραγματοποιήθηκε με τη χρήση Πραγματική Ανάλυση Component λογισμικό plug-in. Η φασματική βιβλιοθήκη μετά χρησιμοποιήθηκε για να unmix τον κύβο. Οι ξεχωριστές φασματικές εισφορές στο «κύβος» των δεδομένων εξάγεται ως έχει οριστεί χρωματιστά χάρτες ένταση. Αυτές οι εικόνες αντιπροσωπεύουν την κατανομή του καθενός από τα ΚΤ και αυτοφθορισμού στον ιστό. Μετά την αποσυνέλιξη των εικόνων, η επισήμανση φόντο διηθείται και μόνο τα πραγματικά θετικά σήματα που εμφανίζονται στις εικόνες των Σχημάτων παρουσιάζονται.

Signal Ποσοτικοποίηση

Η φασματική βιβλιοθήκη χρησιμοποιήθηκε για να deconvolute η κύβος απεικόνισης για να εξαγάγετε την επισήμανση μεμονωμένων QD χρησιμοποιώντας ενημερώσει λογισμικού v1.3 (δαγκάνα) μετά τη συνιστώμενη στρατηγική. Κατ ‘αρχάς, ένα σύνολο εκπαίδευσης αποτελείται από δύο κατηγορίες ιστού δημιουργήθηκε: «καρκίνος» και «μη-καρκίνου». Το λογισμικό έχει εκπαιδευτεί σε αυτές τις περιοχές με τη χρήση του φάσματος τόσο του επίχρωση DAPI και της πολυπλεξίας ανοσοσήμανση QD και δοκιμάστηκε σε 50 τυχαία επιλεγμένα κύτταρα από κάθε εικόνα για να καθορίσει την ακρίβεια της διαφοροποίησης των δύο κατηγοριών. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε μέχρι την περαιτέρω επαναλήψεις βελτίωσε πλέον την ακρίβεια. Ιστολογική H images /Ε στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό καρκινικών κυττάρων βασίζεται στην επισήμανση των πυρηνικών DAPI. Ένα ενσωματωμένο αλγόριθμο στη συνέχεια χρησιμοποιείται για να καθορίσει την κυτταροπλασματική εναντίον πυρηνικών υποκυτταρική περιοχές. Με βάση την ανάλυση των εικόνων σε 400 × μεγέθυνση, οι βέλτιστες ρυθμίσεις όριο προσέγγιση: σταθερή κλίμακα 200, το ελάχιστο μέγεθος άμορφη μάζα 20, μέγιστο μέγεθος άμορφη μάζα 10.000, όριο κυκλικότητα 0, ευκρίνεια άκρη 0, συμπληρώστε τρύπα ενεργοποιημένη (πυρηνική παράμετροι)? εσωτερική απόσταση πυρήνα 1, εξωτερική απόσταση πυρήνα 7, ελάχιστο κυτταρόπλασμα δείγμα μεγέθους 1, το ελάχιστο εύρος σήματος 0, μέγιστο εύρος του σήματος 65535 (κυτταροπλασματική παραμέτρους). Για την εξάλειψη μη-ειδικά σήματα στην καθορισμένη φάσματος, ενός ακυτταρικού περιοχή μέσα στο πεδίο που αναλύεται χρησιμοποιήθηκε ως επισήμανση φόντο. QD ένταση φθορισμού σε κάθε κύτταρο εξήχθη σε ένα υπολογιστικό φύλλο Excel (Microsoft, Seattle, WA) και υποβλήθηκαν σε στατιστική ανάλυση [27], [28].

Αποτελέσματα

Ανάπτυξη της ποσοτικής QD πρωτόκολλο επισήμανσης για την εκτίμηση της έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την ενεργοποίηση του c-Met σηματοδότηση και EMT σε καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα LNCaP σταθερώς tansfected με RANKL

μοντέλο οστού LNCaP και μεταστάσεις μαλακών ιστών: αναπτύχθηκε μία νέα LNCaP μοντέλο μετάσταση στα οστά με σταθερή επιμόλυνση αυτής της κυτταρικής γραμμής με RANKL (LNCaP-RANKL), η οποία οδηγεί ΕΜΤ στα επιμολυσμένα κύτταρα. Όταν RANKL υπερεκφράζουν LNCaP κύτταρα εγχύθηκαν ενδοκαρδιακά σε ποντίκια εμφάνισαν αυξημένη συχνότητα των οστών και των μαλακών ιστών μεταστάσεις (Πίνακας 1).

Η

Επικύρωση των ενεργοποιημένων συστατικών σηματοδότησης c-Met που οδηγούν σε EMT με ΚΤ- PCR, στύπωμα Western και Single Quantum Dot Επισήμανση, SQDL: Σύγκριση της γονιδιακής έκφρασης μεταξύ σταθερών LNCaP-neo ελέγχου και LNCaP κύτταρα-RANKL χρησιμοποιώντας RT-PCR και κηλίδας Western έδειξε ένδειξη ενεργοποιημένου c-Met σηματοδότηση μέσω αυξημένη έκφραση του c-Met, pc-Met, και ρ-ΝΡκΒ ρ65 (Εικόνα 1). Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μορφολογικές (Πίνακας Α) και βιοχημικές (Πίνακες Β και C) επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβασης, με μειωμένη ενδοκυτταρική συγκόλληση που προκαλείται από Ε-καδερίνης και EpCAM, και αυξημένη Ν-cadherin, βιμεντίνη και RANKL. Αυτές οι εκτιμήσεις της ενεργοποίησης σηματοδότησης c-Met και EMT υποβλήθηκαν σε SQDL αναλύει με ένα ειδικό προσπάθεια να επιβεβαιώσει εάν η ενεργοποίηση c-Met και EMT συνέβη σε αυτό το κελί μοντέλο της εξέλιξης του καρκίνου του προστάτη. SQDL επιβεβαίωσε ότι, σε σύγκριση με τον έλεγχο LNCaP-neo κύτταρα (Σχήμα 2Α), LNCaP-RANKL κύτταρα (Σχήμα 2Β) είχε ενεργοποιημένο c-Met σηματοδότηση όπως αποκαλύπτεται από μια αυξημένη έκφραση του RANKL, c-Met, PC-Met και ρ-ΝΡκΒ ρ65 και ένδειξη ΕΜΤ, ενός διακόπτη καντερίνη της αυξημένης έκφρασης του Ν-καδερίνης, βιμεντίνη και RANKL αλλά μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης και AR. Ποσοτικές αναλύσεις (Σχήμα 3) του 1000 τυχαία επιλεγμένων καρκινικών κυττάρων με ενημερώσει λογισμικού (δαγκάνα) που υποστηρίζονται τα δεδομένα απεικόνισης στην οποία τόσο AR και Ε-καδερίνης έκφραση μειώθηκε δραστικά και ενεργοποιημένο c-Met σηματοδότηση συστατικών οδήγησε σε EMT, όπως αυξημένη έκφραση του c-Met, PC-Met, ρ-ΝΡκΒ ρ65, Ν-cadherin, βιμεντίνη, και ΚΑΝΚΕ παρατηρήθηκαν σε LNCaP-RANKL, σε σύγκριση με LNCaP-neo κύτταρα. Αυτή η ποσοτική πρωτόκολλο SQDL εγκρίθηκε για γονιδιακή έκφραση αναλύσεις ενός καθιερωμένου μοντέλου ξενομοσχεύματος CRPC LTL-313.

RANKL-επιμολυσμένα LNCaP κυττάρων που επάγεται EMT σε histomorphology (Α) και την έκφραση του γονιδίου σε mRNA (Β) και σε πρωτεΐνες (C ). Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν ένα από τα 3 RANKL-σταθερά επιμολυσμένα και 2 νεο-σταθερώς επιμολυσμένων κλώνων κυττάρων LNCaP

Η

Διαφορικό QD επισήμανση των πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε σε LNCaP-neo (Α) και LNCaP-RANKL κύτταρα. (Β) χρησιμοποιώντας πυρηνική χρώση DAPI ως αναφορά. Για κάθε ανάλυση, QD επισημασμένη έκφραση της πρωτεΐνης παρουσιάζεται στο ψευδόχρωμα, με την επικάλυψη της εικόνας των σημάτων DAPI και QD (Συγχωνευόμενων). × 400.

Η

τηλέφωνα που βασίζονται σε μέση ένταση μετράει από το 1000 κάθε ένα από νεο- και RANKL-επιμολυσμένων κλώνων LNCaP μετρήθηκαν με ενημερώσει λογισμικού. παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης (

P

& lt? 0,05)

Η

Επικύρωση ενεργοποίηση c-met και EMT στο-313 LTL μοντέλο CRPC σηματοδότησης με αποτελέσματα επιβεβαιώνονται από. IHC και SQDL

Για να κατανοήσουμε την κλινική σημασία του c-Met ενεργοποίηση και EMT σηματοδότησης στο μοντέλο LNCaP-RANKL και τις σχετικές αυξήσεις στις μεταστάσεις του καρκίνου του προστάτη, ορίσαμε το c-Met μονοπάτι και EMT σηματοδότησης σε έναν CRPC μοντέλο ξενομοσχεύματος LTL-313 που λαμβάνεται από τον όγκο ζωντανό εργαστήριο (livingtumorcentre.com). Συμπεριλάβαμε επιπλέον γονιδίων που σχετίζονται σηματοδότηση c-Met όπως νευροπιλίνη-1, VEGF, ρ-Akt, VEGFR2, Mcl-1 και AR, οι οποίες χαρακτηρίζονται ως μεσολαβητές της c-Met κατάντη σηματοδότησης επιβίωσης [15], [21], [ ,,,0],29], [30]. Το Σχήμα 4 δείχνει ότι η αυξημένη c-Met γονίδια σηματοδότηση σχετιζόμενη και μειωμένη έκφραση AR σε CRPC LTL-313 ξενομοσχεύματα διατηρείται σε ευνουχισμένους αρσενικούς ξενιστές, όπως αξιολογήθηκε από IHC (Πίνακας Α) και SQDL (Πίνακας Β) σε σύγκριση με τα ξενομοσχεύματα διατηρηθεί ανέπαφο ποντίκια με συμπλήρωση ανδρογόνου.

το c-Met ενεργοποιούνται και συνδέονται EMT πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν στο μοντέλο ξενομοσχεύματος CRPC LTL-313 με συμβατικές IHC (Α) και SQDL (Β). Ο ευνουχισμός αυξημένο μια ομάδα γονιδίων σε LTL-313 ξενομοσχεύματος καρκίνου του προστάτη και μειωμένη έκφραση AR σε σύγκριση με ξενομοσχεύματα που προέρχονται από άθικτα οικοδεσπότες τόσο IHC και SQDL. × 400.

Η

ανάλυση MQDL έδειξαν ενεργοποιημένο c-Met και EMT σε μια LTL-313 μοντέλο ξενομοσχεύματος CRPC και δείγματα καρκινικού ιστού πρωτογενή και μεταστατικό ανθρώπινο προστάτη. Μια σειρά ανθρώπινου προστάτη ξενομοσχεύματα καρκίνου που λαμβάνεται από το Εργαστήριο Living Tumor χρησιμοποιήθηκε για να δοκιμαστεί η ποσοτική πρωτόκολλο MQDL. Έχουμε επιλέξει το μοντέλο LTL-313 για το έργο αυτό, επειδή το μοντέλο αυτό παρουσιάζει CRPC χαρακτηριστικά με τάση για κυρίως λεμφαδένες, πνεύμονες και το συκώτι μεταστάσεις με σπάνια μετάσταση στα οστά, όταν οι όγκοι εμφυτεύονται και αναπτύσσεται κάτω από τις νεφρικές κάψουλες. Ελέγξαμε την υπόθεση ότι οι όγκοι που αναπτύσσονται σε ευνουχισμένους ποντικούς θα αναπτύξουν αντίσταση ευνουχισμός και έχουν ενεργοποιημένο c-Met σηματοδότηση οδηγώντας σε EMT, σε σύγκριση με τους όγκους που αναπτύσσονται σε ποντικούς συμπληρωμένο με εξωγενές ανδρογόνο (Σχήμα 5Α). ελήφθησαν τρεις προσεγγίσεις: 1) να θεσπιστεί ένα ισχυρό πρωτόκολλο MQDL για την ανίχνευση και τον ποσοτικό προσδιορισμό ενός πάνελ της γονιδιακής έκφρασης στα-313 LTL δείγμα μοντέλο ιστού CRPC με τα αποτελέσματα σε σύγκριση με SQDL? 2) Για να χρησιμοποιήσετε αυτή καθιέρωσε ποσοτικούς πρωτόκολλο MQDL να επιβεβαιώσει εάν η ενεργοποίηση του c-Met και EMT συμβαίνουν στα CRPC LTL-313 ιστοί διατηρούνται σε ευνουχισμένους φιλοξενεί? και 3) για να αποδειχθεί με την τυποποιημένη πρωτόκολλο MQDL την ενεργοποίηση του c-Met και επαγωγή EMT τόσο πρωτογενή και μεταστατικό σκελετικών ανθρώπινους ιστούς καρκίνου του προστάτη. Η Εικόνα 5Β δείχνει το ποσοτικό MQDL αναλύσεις neuropili-1, PC-Met, VEGF, ρ-ΝΡκΒ ρ65, και RANKL, έχουν αναφερθεί στο παρελθόν να σχετίζεται με την ενεργοποίηση του σήματος c-Met [15], [22] και EMT [26], [31] σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη και στην LTL-313 μοντέλο CRPC. Δείξαμε ενεργοποιημένου c-Met σηματοδότηση και EMT, όπως παρουσιάζεται από την αυξημένη έκφραση του νευροπιλίνη-1, VEGF, και RANKL πρωτεϊνών και ενεργοποίηση της PC-Met και π-ΝΡκΒ ρ65 στο μοντέλο όγκου CRPC LTL-313 με υψηλότερη έκφραση και ενεργοποίηση του Αυτά τα γονίδια σε ξενομοσχεύματα όγκου LTL-313 διατηρήθηκαν σε ευνουχισμένους σε σύγκριση με άθικτα ποντικούς. Ως εσωτερικός έλεγχος για την ελαχιστοποίηση της πιθανής παρεμβολής φθορισμό πολλαπλούς ανιχνευτές QD, εκτελέσαμε πλευρά MQDL πλάι με το πρωτόκολλο SQDL (βλέπε παραπάνω). Η αυξημένη έκφραση των 5 μελετήθηκαν γονίδια βρέθηκε να είναι στατιστικά σημαντική με inFom ποσοτικές αναλύσεις (Σχήμα 5Β). Προσδιορίσαμε αυτό το πάνελ 5 γονιδίων σε πρωτογενή προστάτη δείγματα καρκίνου με διαφορετικές βαθμολογίες Gleason και διαπίστωσε ότι η έκφραση του νευροπιλίνη-1, VEGF, pc-Met, RANKL, και ρ-ΝΡκΒ ρ65 ήταν πιο αυξημένα σε ελάχιστα διαφοροποιημένα (Gleason στείλει 10) από μετρίως διαφοροποιημένα (Gleason score 7, 3 + 4) του καρκίνου του προστάτη (Σχήμα 6). Αυτά τα αποτελέσματα, λαμβανόμενα μαζί, επιβεβαίωσε ότι η επισήμανση QD είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη και ευέλικτη και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πολυπλεξία προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε πειραματικά μοντέλα στο επίπεδο του ενός κυττάρου.

τομές Single ιστού του όγκου από ανέπαφα και ευνουχισμένους ξενιστές υποβλήθηκαν με διαδοχική MQDL. Ενισχυμένη έκφραση του c-Met ενεργοποιούνται γονίδια ανιχνεύθηκε σε ιστούς όγκου από ευνουχισμένα ξενιστές. (Α) Μια στοίβα των πολλαπλών εικόνων (κύβος), πυρηνική χρώση (DAPI), και έκφραση μεμονωμένων γονιδίων (σε pseudocolors) δείχνονται. σήματα έκφρασης γονιδίου επάλληλα με DAPI πυρηνική σήματα για να δώσει μία σύνθετη εικόνα για ανάλυση. × 400.