Αφηρημένο

Ιστορικό

Η επανεμφάνιση του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) είναι συχνές κατά το πρώτο έτος της θεραπευτική χειρουργική εκτομή και μπορεί να είναι αναπόφευκτες. έχουν microRNAs προταθεί να παίξει ρόλο στην καρκινογένεση και την υποτροπή του καρκίνου. Εμείς εντοπίστηκαν πρόσφατα microRNA-29c (miRNA-29γ) ως προγνωστικός δείκτης της πρώιμης υποτροπής σε CRC. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε περαιτέρω τις λειτουργίες και τον ορό επίπεδο των miRNA-29c σε σχέση με τις αρχές της επανάληψης της CRC.

Μέθοδοι

Πρώτα περαιτέρω επιβεβαίωσε υπερέκφραση του miRNA-29c σε μη πρώιμη υποτροπή θέματα. Κέρδος-of-λειτουργία

in vitro

μελέτες χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί η επίδραση των miRNA-29c στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση, εισβολή, και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Η κυτταρική σειρά καρκίνου του παχέος εντέρου Caco2 και ένας σταθερός κλώνος που υπερεκφράζουν miRNA-29c ήταν ξενομόσχευμα να αξιολογηθεί η

in vivo

επίδραση του miRNA-29c σε null ποντίκια. Τέλος, κυκλοφορούν miRNA-29c ερευνήθηκε ως πιθανή βιοδείκτη για τον έγκαιρο εντοπισμό των υποτροπών.

Αποτελέσματα

έκφραση miRNA-29c μειώθηκε σημαντικά κατά την πρώιμη υποτροπή σε σύγκριση με μη-πρώιμη υποτροπή στο στάδιο UICC ΙΙ και ασθενείς III CRC (

P

= 0,021).

In vitro

μελέτες έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miRNA-29c ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση. Οι μελέτες του κυτταρικού κύκλου αποκάλυψαν επίσης ότι miRNA-29c προκάλεσε συσσώρευση του G1 και G2 πληθυσμού.

In vivo

, miRNA-29c κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε null ποντίκια. Η miRNA-29γ του ορού αυξήθηκε σημαντικά σε υποτροπή ασθενείς νωρίς σε σύγκριση με παρήλθε ασθενείς μη-νωρίς (

P =

0,012).

Συμπεράσματα

miRNA-29c δείχνει αντι-ογκογένεση δραστηριότητα, και προεγχειρητική κυκλοφορούντα επίπεδα miRNA-29c μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να προβλέψει μετεγχειρητική πρώιμη υποτροπή της CRC

Παράθεση:. Yang IP, Tsai HL, Huang CW, Huang ΜΟΥ, Χου MF, Juo S-HH, κ.ά. . (2013) Η λειτουργική σημασία των microRNA-29c σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου: Ένα Δυναμικό Κυκλοφορούν βιοδεικτών για την πρόβλεψη πρώιμη υποτροπή. PLoS ONE 8 (6): e66842. doi: 10.1371 /journal.pone.0066842

Επιμέλεια: Alfons Navarro, Πανεπιστήμιο της Βαρκελώνης, Ισπανία

Ελήφθη: τρίτης Δεκέμβρη 2012? Αποδεκτές: 10 Μαΐου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 28 Ιούνη 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Επιστημονικό Συμβούλιο της Δημοκρατίας της Κίνας (NSC 99 έως 2320 B-037-014-my3)? Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο (KMUH98-8I04, KMUH100-OR16)? Biosignature στην παχέος εντέρου, Academia Sinica, Ταϊβάν? και Αριστείας για την Έρευνα του Καρκίνου Κέντρο επιχορήγησης που χρηματοδοτείται από το Υπουργείο Υγείας, Εκτελεστικό Yuan, Ταϊβάν, Δημοκρατία της Κίνας (DOH102 TD-C-111-002). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η υψηλή συχνότητα εμφάνισης και τη θνησιμότητα του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) αποτελούν ένα σημαντικό πρόβλημα δημόσιας υγείας σε όλο τον κόσμο [1]. Αν και η χειρουργική εκτομή μπορεί να είναι ιδιαίτερα αποτελεσματική για ένα εντοπισμένη ασθένεια, 30-40% των ασθενών αναπτύσσουν υποτροπή μετά από χειρουργική επέμβαση [2] και 40-50% των υποτροπών εμφανής εντός του πρώτου έτους μετά την αρχική χειρουργική εκτομή [3], [4]. Ο χρόνος από την αρχική θεραπεία για την ανάπτυξη της υποτροπής έχει αναφερθεί ότι σχετίζεται ισχυρά με την επιβίωση, ιδιαίτερα σε ασθενείς εντός ενός έτους από την χειρουργική εκτομή τους [5]. Οι συνεχείς προσπάθειες έχουν γίνει για να ψάξετε για απλές και αξιόπιστες μεθόδους /βιοδείκτη για την έγκαιρη ανίχνευση των όγκων και για CRC πρόγνωση, προκειμένου να παρέχει έγκαιρη, κατάλληλη και αποτελεσματική θεραπεία.

Μια ώριμη microRNA (miRNA) είναι ένα μικρό, μη κωδικοποιητική RNA που περιέχει περίπου 20 νουκλεοτίδια και μπορεί να μετα-μεταγραφικά ρυθμίζουν την έκφραση αρκετών γονιδίων στόχων ταυτόχρονα [6]. Η ογκογένεση του CRC εμπλέκει πολλαπλών σταδίων γονιδιωματικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της ενεργοποίησης των ογκογονιδίων και αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων [7]. Οι miRNAs προταθεί να παίζουν ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων καρκινογένεση, την εξέλιξη, και την επανάληψη [7] – [10]. Οι περισσότερες δημοσιευμένες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην έκφραση ιστού που βασίζεται miRNA [8], [11], [12], και μόνο λίγες μελέτες έχουν διερευνήσει κυκλοφορούν miRNAs σε ασθενείς με CRC [13] – [15]. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα ορισμένων miRNAs ορού μπορεί να χρησιμεύσει ως πιθανοί βιοδείκτες για διάφορες μορφές καρκίνου [16] – [18]

χρησιμοποιείται πρόσφατα ένα συνδυασμό της βιοπληροφορικής και πειραματικές προσεγγίσεις για την πρόβλεψη και την επικύρωση των miRNA-29c. ως υποψήφια βιοδεικτών που σχετίζονται με CRC υποτροπής [19]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά ένα μεγάλο σύνολο δεδομένων που επιβεβαιώνουν τη σχέση μεταξύ της έκφρασης των miRNAs-29c και στις αρχές της επανάληψης CRC. Μια σειρά από

in vitro

και

in vivo

πειράματα διεξήχθησαν για να απεικονίσουν την λειτουργικός ρόλος του miRNA-29c σε CRC ογκογένεση. Στη συνέχεια, θα διερευνηθεί κατά πόσον το επίπεδο των miRNA-29c στον ορό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για την πρόβλεψη πρώιμη υποτροπή CRC.

Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Για να αποφευχθεί η πιθανή επιρροή του εισαγωγική θεραπεία στην έκφραση miRNA, οι ασθενείς αποκλείστηκαν εάν είχαν υποβληθεί σε νέο-επικουρική θεραπεία είτε με χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν την επέμβαση. Τα δείγματα όγκων CRC ελήφθησαν από 107 ασθενείς με πρωτοπαθή CRC στο UICC στάδια II /III (56 μη έγκαιρης υποτροπή ασθενείς και 51 ασθενείς έγκαιρης υποτροπιάσει μετά από ριζική εκτομή). Μεταξύ αυτών των 107 ασθενείς, τα δεδομένα miRNA-29c για 68 άτομα (27 μη έγκαιρης υποτροπή ασθενείς και 41 πρώιμη υποτροπή ασθενείς) έχουν αναφερθεί σε διαπερατό χαρτί μας [19]. CRC πρώιμη υποτροπή ορίστηκε ως τοπική υποτροπή ή μακρινή μετάσταση που εμφανίζεται μέσα σε 1 χρόνο μετά από ριζική εκτομή [5], [20], [21] και οι ασθενείς που υποτροπίασαν μετά το πρώτο έτος και δεν υποτροπή κατά τη διάρκεια της μελέτης ήταν ταξινομούνται σε μη νωρίς υποτροπή ομάδα. Επειδή το ποσοστό υποτροπής CRC στο στάδιο Ι είναι σχετικά χαμηλό, και οι ασθενείς με σταδίου IV CRC έχουν ήδη μεταστατική οντότητες [19], [20], η παρούσα μελέτη προσλαμβάνονται μόνο ασθενείς CRC στο στάδιο ΙΙ και το στάδιο ΙΙΙ. CRC ιστοί καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο μετά από χειρουργική εκτομή. Τα δείγματα ορού από 61 ασθενείς με πρωτογενή CRC CRC στο UICC στάδια II /III (41 μη νωρίς υποτροπιάζον και 20 πρώιμη υποτροπή ασθενείς) πριν από τη λήψη χειρουργείο συλλέχθηκαν και μετρήθηκαν τα επίπεδα ορού miRNA-29c. επίπεδα miRNA-29c ορού μετρήθηκαν επίσης σε 23 υγιή άτομα (14 γυναίκες και 9 άνδρες). Αμφότερα τα δείγματα ορού και CRC όγκου ελήφθησαν από 38 άτομα σε αυτή τη μελέτη. Όλα τα θέματα που είχαν σχέση κινεζικής καταγωγής που κατοικούν στην Ταϊβάν. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε αντικείμενο για τη συλλογή κλινικών δειγμάτων τους και να δημοσιεύουν αυτά τα στοιχεία υπόθεση και όλα τα δεδομένα των ασθενών ήταν ανώνυμα. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο Institutional Review (Αριθμός Πρωτοκόλλου: KMUH-IRB-990343)

RNA εκχυλίσεις από Tissue

Περίπου 100 mg κάθε ιστού ομογενοποιούνται με τη χρήση. ένα πάγκο-top ομογενοποιητή (Polytron PT1600E, Kinematica AG, Lucerne, Switzerland) και το ολικό RNA, συμπεριλαμβανομένων των mRNA και miRNA, καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Qiagen RNAeasy (Qiagen, Αμβούργο,

Γερμανία

), σύμφωνα με τον κατασκευαστή οδηγίες.

miRNA-29c επίπεδα έκφρασης στην πρώιμη και μη έγκαιρης ασθενείς Υποτροπή CRC

Για τη μέτρηση των επιπέδων έκφρασης των miRNAs-29c, cDNA miRNA-29c συντέθηκε από 20 ng ολικού RNA με χρησιμοποιήθηκε μοναδικό εκκινητή (Applied Biosystems Inc., CA) και δοκιμασία TaqMan miRNA RT-qPCR (Applied Biosystems Inc.). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των miRNA-29c σε ιστούς κανονικοποιήθηκαν με εκείνη του U6b ως εσωτερικός έλεγχος χρησιμοποιώντας την εξίσωση: log

10 (2

-ΔCt), όπου ΔCt = (Ct

miRNA-29c – Ct

U6b). Η μέση και τυπική απόκλιση (SD) τιμές του log

10 (2

-ΔCt) υπολογίστηκαν.

Cell Culture

Η άνω και κάτω τελεία κυτταρική σειρά ανθρώπινου καρκινώματος Caco2, Lovo, SW480 και SW620 (ATCC, Manassas, VA) καλλιεργήθηκε σε DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS? Gibco-BRL) και 100 U /mL πενικιλλίνη [21]. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% 2.

Κατασκευή πλασμιδίου για την υπερέκφραση των miRNA-29c

Ο φορέας pCDH (Σύστημα CO

βιοεπιστήμες, Mountain View, CA) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τις λειτουργικές συνέπειες των miRNA-29c υπερέκφραση. Κατασκευάσαμε το pCDH- πλασμίδιο miRNA-29c με την εισαγωγή του προϊόντος PCR miRNA-29c στις πολλαπλές περιοχές κλωνοποίησης των pCDH. Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν για να ενισχύσουν miRNA-29c ήταν tcctgaattcgaggatgccctggagtattcgg και ctaggcggccgcgcatgatcttccttccctattc. Το έναυσμα επεκτάθηκε στο 5 ‘άκρο για να συμπεριλάβει την αλληλουχία GAATTC να δημιουργήσει ένα

EcoR1

θέση περιορισμού, και ο αντίστροφος εκκινητής ήταν επίμηκες στο 5′ άκρο για να συμπεριλάβει την αλληλουχία GCGGCCGC να δημιουργήσει ένα

Not1 ιστοσελίδα περιορισμού. Το κατασκεύασμα επιβεβαιώθηκε με άμεση αλληλούχιση του DNA.

Δημιουργία σταθερών κλώνων

κύτταρα Caco2 (5 × 10

5) σπάρθηκαν και επιμολύνθηκαν με 400 ng από τα κατασκευάσματα (είτε η αρνητική κωδικοποιημένο διάνυσμα pCDH ή το πλασμίδιο pCDH-miRNA-29c) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Τα σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα Caco2 περιέχουν το πλασμίδιο pCDH-NC (NC: αρνητικός έλεγχος) ή το πλασμίδιο pCDH-miRNA-29c (O miRNA-29c: υπερέκφραση της miRNA-29c) επιλέχθηκαν για μια περίοδο 4 εβδομάδων με τη χρήση τυποποιημένων μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 12 μg /mL πουρομυκίνη (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, ΜΙ). Σταθερή επιμόλυνση των πλασμιδίων επιβεβαιώθηκε με την εκτέλεση μιας δοκιμασίας miR qRT-PCR.

Ανάλυση Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Caco2 σταθερούς κλώνους κυττάρων ήταν seeded και επωάζονται για 22 ώρες, στη συνέχεια επωάζονται περαιτέρω για ένα άλλο 2 h με 1/10 του όγκου WST-1 αντιδραστηρίου (Roche Diagnostics, Corp., Indianapolis, ΙΝ) πριν από την απορρόφηση στα 450 nm ποσοτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο [21].

Για να εξετασθεί περαιτέρω ο ρόλος του miRNA -29c στον πολλαπλασιασμό, αξιολογήσαμε την επίδραση της miRNA-29c υπερ-έκφραση επί της ανάπτυξης 3 διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου (Lovo, SW480 και SW620). Έχουμε τη μετάβαση που επιμολύνονται έχει-miRNA-29c (μιμούνται miR-29c, Ambion, USA) miRNA ή αρνητικό έλεγχο (NC, mirVana miRNA μιμούνται, Ambion, USA) σε Lovo, SW480 και SW620 κυττάρων. Τα κύτταρα σπάρθηκαν, επωάστηκαν για 22 ώρες και στη συνέχεια περαιτέρω αναλύθηκαν όπως περιγράφεται διαπερατό.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Μετά από επώαση για 36 ώρες, την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου ποσοτικοποιήθηκε με ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ, Sigma -Aldrich Co.) χρώση και επακόλουθη ανάλυση επί FACScan κυτταροφθορισμόμετρο (Becton Dickinson, NJ) με λογισμικό CellQuest (BD Biosciences), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ανάλυση Κυτταρικού Μετανάστευσης

Κυττάρου μετανάστευση εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Transwell ένθετα πολυανθρακικής μεμβράνης (Millipore, GmbH, Schwalbach, Γερμανία) σε πλάκες 24 φρεατίων. Τα κύτταρα (2 χ 10

4) απλώθηκαν σε millicells 24 φρεατίων και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες στους 37 ° C. Τα ένθετα ξεπλύθηκαν σε 1Χ PBS, και τα κύτταρα απομακρύνθηκαν από τις μεμβράνες με 1% θρυψίνη σε αντιδραστηρίου λύσης κυτταρικής καλλιέργειας (Promega, Corp., Madison, WI, USA). Η μετανάστευση των κυττάρων εκτιμήθηκε με ποσοτικοποίηση του πράσινου φθορισμού του φορέα pCDH όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21].

επούλωση πληγών Δοκιμασία

Μετά το σχηματισμό ενός μονοστοιβάδα, ένα τραύμα δημιουργήθηκε στο φύλλο κύτταρο με χειροκίνητη απόξεση με μια άκρη μικροπιπέτα 200 μλ. Το μέσο καλλιέργειας αντικαταστάθηκε στη συνέχεια και τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C. Το κλείσιμο της πληγής καταγράφηκε και φωτογραφήθηκε σε διάφορα χρονικά σημεία (0, 24, και 48 ώρες) κάτω από ένα μικροσκόπιο.

Matrigel Δοκιμασία Invasion

κυττάρων εισβολή αναλύθηκε χρησιμοποιώντας 24 φρεατίων Transwell διαπερατό στηρίγματα ( BD Biosciences, San Jose, CA) με 8-μm ένθετα μεμβράνης πόρων πολυανθρακικό. Τα κύτταρα (1 χ 10

4) τοποθετήθηκαν επί του άνω θαλάμου και αφήνονται να εισβάλουν για 24 ώρες. Κυττάρων εισβολή προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [21]

In vivo μελέτες σε ζώα

Four-εβδομάδων Balb /c γυμνά ποντίκια (βάρος σώματος: 12,6 να 15,6 g). Αγοράσθηκαν από BioLasco Ταϊβάν Co, Ltd (Ταϊπέι, Ταϊβάν) και διατηρήθηκε σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο-ελεύθερο περιβάλλον (πιστοποιητικό αριθ .: 26-99S029). Στις 6 εβδομάδες της ηλικίας τους, κάθε γυμνό ποντίκι ενέθηκε υποδόρια με 1 × 10

7 κύτταρα Caco2 (είτε NC ή Omir-29c?

N

= 4 ανά επιμολυσμένη κυτταρική γραμμή) στην περιοχή του λαιμού. Η διάμετρος του όγκου μετρήθηκε και ο όγκος του όγκου (cm

3) υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: όγκος = (πλάτος Χ μήκος Χ ύψος) /2 [22]. Τα ζώα θυσιάστηκαν 3 εβδομάδες μετά την ένεση των κυττάρων του όγκου, και οι όγκοι εξετάστηκαν και μετρήθηκαν αμέσως χωρίς προηγούμενη καθήλωση. Πριν από τη θυσία, μια μη επεμβατική σύστημα απεικόνισης (το Ultra Sensitive Μοριακής Απεικόνισης Συστήματος Berthold Nightowl, Berthold Τεχνολογίας, Oak Ridge, ΤΝ) χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της καρκινικών κυττάρων

in vivo

και να επιβεβαιώσει ότι το miRNA-29c υπερεκφράζουν πλασμίδια ήταν ακόμη παρούσες στα καρκινικά κύτταρα. Η στρατηγική αυτή απεικόνισης παρέχει μια μη επεμβατική και υπερευαίσθητη μέθοδο για την ανίχνευση των μορφομετατραπέντων πλασμιδίων που εκφράζουν GFP. Τα πρωτόκολλα χρήσης των ζώων που εγκρίθηκε από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση των Kaohsiung Ιατρικό Πανεπιστήμιο (IACUC Έγκριση No: 99052). Σε συμφωνία με τις Κατευθυντήριες Αρχές με τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου

Ορός Παρασκευής, RNA Extraction και τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs-29c

Το φλεβικό αίμα λήφθηκε πριν από τη λειτουργία. Τα δείγματα αίματος φυγοκεντρήθηκαν στα 3000 rpm για 15 λεπτά και ο ορός δειγματίσθηκε σε 1.7 κ.εκ. σωληνάρια Eppendorf. Σε περίπτωση απουσίας ενός καλά τεκμηριωμένο εκφράζονται σταθερά ενδογενούς κυκλοφορούντος miRNAs για να χρησιμεύσουν ως μάρτυρες ομαλοποίηση,

C. elegans

συνθετικό

lin-4

miRNA (Cel-lin-4, Part Number: 4,398,988, Invitrogen) που προστέθηκε στο παρασκεύασμα ορού πριν από την εκχύλιση RNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ομαλοποίηση όπως σε προηγούμενες μελέτες [ ,,,0],23], [24]. Για την απομόνωση RNA από ορό, 300 μι του ορού ομογενοποιήθηκαν σε 900 μι ΤπζοΙ LS σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen) με μικρές τροποποιήσεις: 6 μι 1 ηΜ Cel-lin-4 προστέθηκαν σε δείγματα ορού. Στη συνέχεια, 250 μλ χλωροφορμίου προστέθηκε στο δείγμα και το μικτό διάλυμα φυγοκεντρήθηκε. Μετά επιπλέον εκχύλιση με χλωροφόρμιο και καθίζηση με ισοπροπανόλη, το σφαιρίδιο πλύθηκε δύο φορές με φυγοκέντρηση με 70% αιθανόλη. Το σφαιρίδιο RNA ξηράθηκε για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και διαλύθηκε σε 30 μι απεσταγμένου νερού. Κατεργασία ϋΝάσης (Qiagen) διεξήχθη για να απομακρυνθεί οποιοδήποτε μολυσματικό DNA.

Για να μετρηθούν τα επίπεδα έκφρασης miRNA-29c, miRNA-29c cDNA συνετέθη και η δοκιμασία TaqMan miR RT-qPCR προσχηματίστηκε ως διαπερατό περιγραφεί. Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των miRNA-29c στον ορό κανονικοποιήθηκαν με εκείνη της Cel-lin-4 χρησιμοποιώντας την εξίσωση: log

10 (2

-ΔCt), όπου ΔCt = (Ct

miRNA-29c – Ct

Cel-lin-4). Η μέση και τυπική απόκλιση (SD) τιμές του log

10 (2

-ΔCt) υπολογίστηκαν.

Στατιστική Ανάλυση

Οι συνεχείς μεταβλητές παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD) αξίες, και οι διχοτομικές μεταβλητές αναλύθηκαν με τη δοκιμασία chi-τετράγωνο του Pearson και παρουσιάζονται ως αριθμός και το ποσοστό αξίες. Ανάλυση συνδιακύμανσης εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό JMP (έκδοση 7.0.1, SAS Institute Inc., Cary, NC) για να συγκρίνουν τα επίπεδα μέσης miRNA-29c μεταξύ νωρίς και μη-πρώιμο υποτροπιάζον ασθενείς CRC. Η ηλικία, το φύλο, και το στάδιο της CRC συμπεριλήφθηκαν ως covariables στα στατιστικά μοντέλα. Ένα 2-tailed

P

αξία μικρότερη από 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Η στατιστική ισχύς υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον Υπολογιστή σε απευθείας σύνδεση DSS Έρευνας στατιστική ισχύ (https://www.dssresearch.com/Home.aspx), με βάση τα εξής: μονόπλευρο τεστ, ένα άλφα 0,05, στον ορό του 20 αρχές του υποτροπή ασθενείς και 41 μη έγκαιρης υποτροπή ασθενείς, και τα εμπειρικά επίπεδα έκφρασης σε κάθε ομάδα.

Αποτελέσματα

Δημογραφικά στοιχεία

τα χαρακτηριστικά των 107 ανεξάρτητων CRC ασθενών (56 μη πρώιμη υποτροπή και 51 πρώιμη υποτροπή ασθενείς) συνοψίζονται στον πίνακα S1. Οι μέσες ηλικίες (χρόνια) των υποτροπή ασθενείς με πρώιμη υποτροπή και μη έγκαιρης ήταν 67,20 και 64,90, αντίστοιχα, με την περιοχή να είναι 24-88 ετών. Πληροφορίες σχετικά με το στάδιο της νόσου, το φύλο, και την ηλικία των ασθενών υποτροπή νωρίς υποτροπιάζον και μη-νωρίς παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Πρώιμη υποτροπή συσχετίστηκε σημαντικά με τον τύπο του όγκου και την εισβολή περινευρικό (

P

& lt? 0,05, πίνακας 2), αλλά η ηλικία, το φύλο, το μέγεθος του όγκου, το στάδιο UICC των ασθενών ή διανομές ιστολογία δεν ήταν σημαντικά διαφορετικές από τις αρχές και μη πρώιμη υποτροπή ασθενείς (

P

& gt? 0.05, Πίνακας 2)

Εμείς συλλέγονται δείγματα ορού από 61 ασθενείς με CRC (41 ασθενείς με πρώιμη υποτροπή μη έγκαιρης υποτροπιάζον και 20), πριν λάβει την επέμβαση. Τα χαρακτηριστικά των 61 ασθενείς CRC για τη μελέτη του ορού συνοψίζονται στον Πίνακα S2. Από τους 61 ασθενείς που δώρισε προεγχειρητική δείγματα ορού, δείγματα όγκων CRC ήταν επίσης διαθέσιμα για 38 ασθενείς (30 μη έγκαιρης υποτροπιάσει και 8 πρώιμη υποτροπή ασθενείς). Ως εκ τούτου, τα δύο δείγματα ορού και CRC αναλύθηκαν ταυτόχρονα για 38 ασθενείς στην παρούσα μελέτη.

miRNA έκφραση στην Πρώιμη και μη έγκαιρης ασθενείς Υποτροπή

Τα επίπεδα έκφρασης miRNA-29c σε 107 CRC όγκου δείγματα ήταν διαφορετικές από τις αρχές και μη έγκαιρης υποτροπή ασθενείς. Η μέση τιμή του log

10 (2

-ΔCt) ήταν 0,67 στο μη-νωρίς υποτροπή ομάδα και 0,37 στις αρχές της δεκαετίας υποτροπιάζουσα ομάδα (

Ρ = 0,021

, Σχ. 1Α). Ως εκ τούτου, τα επίπεδα miRNA-29c ήταν χαμηλότερα στα δείγματα από την πρώιμη υποτροπή ασθενείς με 2,00 φορές σε σύγκριση με εκείνη σε δείγματα μη-αρχές υποτροπή ασθενείς. Αυτό είναι παρόμοιο με προηγούμενη αναφορά μας αλλαγής 2,04 φορές [19]. Πρώιμη υποτροπή συσχετίστηκε σημαντικά με περινευρικές εισβολή, τον τύπο του όγκου και χαμηλότερη έκφραση του όγκου miRNA-29c με μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση (Πίνακας 2), αλλά τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs-29γ δεν συσχετίστηκαν σημαντικά με κάθε κλινικοπαθολογοανατομικές μεταβλητή (Πίνακας 3). Ως εκ τούτου, η έκφραση των miRNA-29c είναι ένας ανεξάρτητος παράγοντας προγνωστικός δείκτης για την ανίχνευση της πρώιμη υποτροπή της CRC. Αυτά τα αποτελέσματα επαληθεύουν πάλι τα προηγούμενα δεδομένα μας [19], και την υποστήριξη miRNA-29c ως δυνητικό προγνωστικό της πρώιμης υποτροπής του CRC μετά από χειρουργική επέμβαση.

επίπεδα έκφρασης miRNA-29c (Α) σε 56 μη-νωρίς και 51 πρώιμη υποτροπή δείγματα όγκων CRC. Το επίπεδο έκφρασης μειώνεται σημαντικά στους όγκους πρώιμου υποτροπή (

P =

0.021). (Β) WST-1 δοκιμασία δείχνει ότι miRNA-29c καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων (

P =

0.006). Omir-29c δείχνει τον κλώνο κυττάρων Caco2 υπερεκφράζουν σταθερά miRNA-29c, και NC δείχνει τον αρνητικό έλεγχο σταθερό κλώνο. (Γ) Η υπερέκφραση του miRNA-29c προκαλεί σημαντική συσσώρευση κυττάρων στην φάση G2 (

P =

0,02). Μαύρο: G1 /G0 φάση? ανοιχτό γκρι: φάση S? και σκούρο γκρι: G2 φάση. (D) Transwell δοκιμασία που δείχνουν ότι η υπερέκφραση του miRNA-29c καταστέλλει τη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων (

P

& lt? 0,0001). (Ε) Η υπερέκφραση του miRNA-29c δεν επηρεάζει καρκινικών κυττάρων εισβολής (

P =

0,349). (F) Η υπερέκφραση του miRNA-29c μειώνει τη μετανάστευση των κυττάρων, όπως υποδεικνύεται από ένα κενό αυξημένου πλάτους σε O miRNA-29c σε σύγκριση με NC στις 24 και 48 ώρες. Οι φωτογραφίες που δείχνουν την αναστολή της μετανάστευσης των καρκινικών κυττάρων ελήφθησαν από την τραυματίζοντας επούλωση δοκιμασία.

Η

Για να αποσαφηνιστεί ο ρόλος της έκφρασης miRNA-29c σε υποτροπή ασθενείς νωρίς, έχουμε περαιτέρω σύγκριση της έκφρασης miRNA-29γ μεταξύ υποτροπή

vs.

μη υποτροπή ομάδες. Επτά ασθενείς της μη έγκαιρης υποτροπή της ομάδας είχαν υποτροπιάσει μετά τον πρώτο χρόνο? ως εκ τούτου, εκ νέου κατατάσσονται σε υποτροπή της ομάδας. Τα επίπεδα έκφρασης miRNA-29c μεταξύ υποτροπιάζον και μη υποτροπή ασθενών και η μέση του log

10 (2

-ΔCt) ήταν 0,65 στην μη-υποτροπιάζουσα ομάδα και 0,43 στην υποτροπιάζουσα ομάδα (

P

= 0.099, Σχ. δεν απεικονίζονται).

η υπερέκφραση του Επιρροές miRNA-29c κυτταρικού πολλαπλασιασμού και κυτταρικού κύκλου εξέλιξη

Για να εξεταστεί ο ρόλος των miRNA-29c στην ογκογένεση, αξιολογήσαμε την επίδραση του miRNA-29c για την ανάπτυξη των κυττάρων Caco2. Έχουμε δημιουργήσει ένα Caco2 σταθερό κλώνο (Omir-29c) που υπερεκφράζουν miRNA-29c. Το μέσο επίπεδο miRNA-29c σε Omir-29c ήταν 0,45 (που εκφράζεται ως log

10 (2

-ΔCt)), το οποίο ήταν υψηλότερο από το μέσο επίπεδο των miRNA-29c στον αρνητικό έλεγχο (NC) κλώνος από 2,82 φορές. Όπως φαίνεται στο Σχ. 1Β, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των Omir-29c ήταν μόνο 58,7% του ποσοστού της NC μετά από 24 ώρες (

P =

0.006). Επειδή ορισμένα από τα προβλεπόμενα γονιδίων στόχων miRNA-29c συνδέονται με την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και την ανάπτυξη των κυττάρων, αξιολογήσαμε κατά πόσο miRNA-29c επηρέασαν τον κυτταρικό κύκλο με κυτταρομετρία ροής. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι Omir-29c αύξησε σημαντικά την συσσώρευση του πληθυσμού G2 κυττάρου (19,4% σε Omir-29c

vs

14,7% σε NC,

P = 0,02

?. Εικ. 1 C) , αύξησε ελαφρώς τη συσσώρευση του G1 πληθυσμού /G0 (47,1% το Omir-29γ

vs

. 43,1% σε NC,

P =

0,43), και μείωσε τη συσσώρευση των S- πληθυσμού φάση (33,48% το Omir-29γ

vs

. 42.21% σε NC,

P

= 0,14). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση του miRNA-29c αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου λόγω της μειωμένης φάσης S και προκαλώντας ανακοπή G2.

Με την ανάλυση του πολλαπλασιασμού με τη μετάβαση επιμολυσμένα έχει-miRNA-29c miRNA (miRNA-29γ μιμούνται ) ή αρνητικό έλεγχο (NC, mirVana miRNA μιμούνται) σε Lovo, SW480 και SW620 κυττάρων, βρήκαμε ότι ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των υπερ-έκφρασης κύτταρα miRNA-29c ήταν σημαντικά κάτω σε 50,9% (Lovo) και 51,9% (SW480) του ποσοστό NC μετά από 24 ώρες (

P =

0.016 και 0.009, αντίστοιχα, Εικ. S1). Ωστόσο, ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των SW620 δεν αποδείχθηκε σημαντικά διαφορετική (μέχρι 92,4%) στις υπερ-έκφραση κυττάρων miRNA-29c. Κατά συνέπεια, εκτός από την CaCo2, miRNA-29c θα καταστέλλουν επίσης την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου του παχέος εντέρου:. Lovo και SW480, αλλά όχι SW620

Επιδράσεις της miRNA-29c υπερέκφραση επί Κυττάρων Η μετανάστευση

Τα δεδομένα από την δοκιμασία transwell (Εικ. 1 D) έδειξε ότι Omir-29c εμφανίζεται πιο αργά από ό, τι η μετανάστευση NC κατά 56% (

P

& lt? 0,0001). Η αναστολή της μετανάστευσης αξιολογήθηκε επίσης σε μία δοκιμασία για επούλωση της πληγής στην οποία το πλάτος της πληγής ήταν 800 μm. Τα πλάτη των κενών στην NC και Omir-29c ήταν 100 και 180 μm με 24 ώρες, αντίστοιχα, και ήταν 0 και 100 μm σε 48 ώρες, αντίστοιχα. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η μετανάστευση των κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη σε Omir-29c. Αυτές οι δοκιμασίες με συνέπεια έδειξε ότι η μετανάστευση των κυττάρων μειώθηκε δραματικά όταν miRNA-29c βρέθηκε να υπερεκφράζεται (Εικ. 1 F).

Επιπτώσεις των miRNA-29c υπερέκφραση στην εισβολή των καρκινικών κυττάρων

Τα δεδομένα από την εισβολή Matrigel δοκιμασία δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των Omir-29c και κλώνοι NC όσον αφορά την ικανότητά τους για την εισβολή. Αυτό το εύρημα πρότεινε ότι η υπερέκφραση του miRNA-29c δεν επηρέασε εισβολή από τα κύτταρα όγκου (

Ρ = 0,349

, Σχ. 1 Ε).

Επίδραση υπερέκφραση του miRNA-29c σε γυμνά ποντίκια

για να επικυρώσετε περαιτέρω την επίδραση αντι-ογκογένεση των miRNA-29c, εξετάσαμε την επίδραση της miRNA-29c υπερέκφραση στην ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Μετά από υποδόρια ένεση του Omir-29c και οι κλώνοι NC στο λαιμό γυμνών ποντικών, οι μάζες του όγκου έγιναν ψηλαφητή 7 ημέρες μετά τον εμβολιασμό και αφέθηκαν να αναπτυχθούν μέχρι το τέλος της τρίτης εβδομάδας (Σχ. 2Α). Τα ποντίκια που έλαβαν κύτταρα Omir-29c είχαν σημαντικά μικρότερες καρκίνο κομμάτια από ό, τι εκείνοι που έλαβαν κύτταρα NC (

P = 0,018

? Εικ. 2Β και 2Γ). Τα δεδομένα από Ultra Sensitive στρατηγική Μοριακής Απεικόνισης επιβεβαίωσε την υπερέκφραση των miRNA-29c στον κλώνο Omir-29c 3 εβδομάδες μετά τη σπορά τα καρκινικά κύτταρα μέσω της ανίχνευσης του πράσινου φθορισμού

πρωτεΐνη

(Σχ. 2D). Τα αποτελέσματα από το

in vivo

πείραμα παρείχε περαιτέρω υποστηρίζουν το γεγονός ότι η υπερέκφραση του miRNA-29c οδηγεί σε μείωση του πολλαπλασιασμού των όγκων σε πειραματόζωα.

Omir-29c είναι ο κλώνος Caco2 υπερεκφράζουν σταθερά miRNA-29c, και NC είναι ο έλεγχος σταθερό κλώνο. (Α) Φωτογραφίες null ποντίκια υποδόρια ένεση με κύτταρα NC (

Ν =

4, άνω φωτογραφία) ή με κύτταρα Omir-29c (

Ν =

4, κάτω πάνελ) ελήφθησαν 21 ημέρες μετά την ένεση. (Β) Οι σβώλοι του όγκου ήταν μικρότερες στην ομάδα Omir-29c (κάτω πίνακας) από ότι στην ομάδα NC (άνω πάνελ) μετά από 21 ημέρες. (Γ) Ο όγκος (cm

3) καμπύλες ανάπτυξης για Omir-29c (- – -? Γκρι) και τα κύτταρα NC (-? Μαύρο) πάνω από 21 ημέρες (

P =

0.018). (D) Χρησιμοποιώντας το Ultra Sensitive στρατηγική Μοριακής Απεικόνισης, τη δραστηριότητα λουσιφεράσης στα κομμάτια μπορεί να σαρωθεί χωρίς εισβολή από φωτογραφίες null ποντίκια υποδόρια ένεση με κύτταρα Omir-29c λαμβάνεται 21 ημέρες μετά την ένεση.

Η

κυκλοφορούν miRNA έκφραση στην πρώιμη και μη έγκαιρης ασθενείς υποτροπή

επίπεδα miRNA-29c προεγχειρητική ορού ήταν σημαντικά διαφορετικές από τις αρχές και μη έγκαιρης υποτροπή ασθενείς. Η μέση τιμή του log

10 (2

-ΔCt) ήταν -3,841 στην ομάδα μη-πρώιμης υποτροπής και -3,216 στην ομάδα πρώιμης υποτροπής (Σχ. 3Α). Ορός miRNA-29c επίπεδα δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των υγιών υποκείμενα της ομάδος και την ομάδα μη-νωρίς-υποτροπής (

P

= 0,256), αλλά το miRNA-29c αυξήθηκε σημαντικά σε υποτροπή ασθενείς νωρίς σε σύγκριση με την ομάδα υγιών ατόμων και μη έγκαιρης υποτροπιάζουσα ομάδα (

P

& lt? 0,0001 και

P =

0,012, αντίστοιχα). Με βάση τα δεδομένα του ορού, το μέγεθος του δείγματος μας του 61 πέτυχαν στατιστική ισχύ από 83,1%. Η ανάλυση επανάληψης της πρόωρης υποτροπίασαν (κενή γραμμή) και μη-νωρίς υποτροπίασαν (γκρι γραμμή) ομάδες εκτιμήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και τα μοτίβα επανάληψης είχαν φαίνεται στο Σχ. 3Β.

(Α) Τα επίπεδα έκφρασης των κυκλοφορούντων miRNA-29c απελευθερωθεί στα δείγματα ορού από 23 υγιή άτομα, 41 μη έγκαιρη και 20 ασθενείς πρώιμης υποτροπής CRC. Ορός επίπεδα miRNA-29c δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ υγιών υποκείμενα της ομάδος και την ομάδα μη-νωρίς-υποτροπής (

P

= 0,256). Το επίπεδο έκφρασης αυξάνεται σημαντικά στα δείγματα ορού της πρώιμης-υποτροπής των ασθενών σε σύγκριση με την ομάδα υγιών ατόμων (

P

& lt? 0.0001) και μη-πρώιμης υποτροπής ομάδα (

Ρ = 0,012

). (Β) Η ανάλυση υποτροπών σε ασθενείς CRC εκτιμήθηκε με τη μέθοδο Kaplan-Meier και έχουν δείξει ότι τα σχέδια της πρώιμης υποτροπίασαν (κενή γραμμή) και μη-πρώιμη υποτροπή (γκρι γραμμή) ομάδες.

Η

Συζήτηση

αύξηση της έρευνας σχετικά με τη λειτουργία των miRNAs έχει δημιουργήσει μια νέα εποχή στην οποία ογκογένεση μπορεί να γίνει καλύτερα κατανοητή. Ωστόσο, ο ρόλος του miRNAs στην επανάληψη της CRC, ιδιαίτερα στις αρχές υποτροπιάζον CRC, παραμένει ασαφής. Πρόσφατα, χρησιμοποιώντας υπολογιστική ανάλυση του προφίλ έκφρασης του mRNA, που ανέφερε ότι miRNA-29c είναι ένα προγνωστικό παράγοντα της πρόωρης υποτροπιάζον CRC [19]. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήσαμε ένα αυξημένο μέγεθος του δείγματος για να επιβεβαιώσει ότι η έκφραση miRNA-29c στον ιστό του όγκου και του ορού μπορεί να προβλέψει CRC πρώιμη υποτροπή, και πραγματοποιήσαμε μια σειρά

in vitro

και

in vivo

λειτουργικές μελέτες για να διευκρινιστεί περαιτέρω ο ρόλος των miRNA-29c στο CRC ογκογένεση.

In vitro,

δείξαμε ότι miRNA-29c αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό σε περίοπτη θέση καρκίνο του παχέος εντέρου κυττάρων και τη μετανάστευση, αλλά δεν εισβολή. Η υπερέκφραση του miRNA-29c μπορεί να συλλάβει τον κυτταρικό κύκλο στη φάση G2, που οδηγεί στην αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού. Σε γυμνούς ποντικούς, καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα που υπερεκφράζουν miRNA-29c εμφανίζεται ένα σημαντικά βραδύτερο ρυθμό ανάπτυξης από ό, τι τον έλεγχο του καρκίνου κύτταρα. Επιπλέον, οι προεγχειρητική επίπεδα των miRNA-29c στον ορό σε περίοπτη θέση που σχετίζεται με τη μετεγχειρητική πρώιμη υποτροπή. Κατά συνέπεια, τα αποτελέσματα μας από κυτταρικές, ζώο, και μελέτες σε ανθρώπους με συνέπεια έδειξαν ότι miRNA-29c εξασκεί ένα αποτέλεσμα αντι-ογκογένεση, και μπορεί να είναι ένα χρήσιμο βιοδείκτη για την πρόβλεψη της πρώιμης υποτροπής σε ασθενείς CRC μετά την επέμβαση.

Πρόσφατες μελέτες έχουν αποκαλύψει ότι miRNA-29c εμπλέκεται σε μία ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης καρκινογένεσης διαφόρων ανθρώπινων καρκίνων, όπως η χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία [25], ο καρκίνος του πνεύμονα [26], του καρκίνου του προστάτη [27], και διηθητικό καρκίνο του μαστού [ ,,,0],28]. Ωστόσο, εκτός από την πρόσφατη δημοσίευση μας [19], μελέτες που σχετίζονται με το ρόλο των miRNA-29c στο CRC παθογένεια και στην επανάληψη είναι περιορισμένες. Ο κρίσιμος ρόλος των miRNA-29c στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης σε ογκογένεση μένει να διερευνηθεί μέσω προφίλ ειδικών mRNA. άλφα-προκαλείται από πρωτεΐνη παράγοντα νέκρωσης όγκων 3 (TNFAIP3), ένα βασικό ρυθμιστή σε φλεγμονή και ανοσία, βρέθηκε να συσχετίζεται αντιστρόφως με τα επίπεδα miRNA-29c και αναγνωρίστηκε ως στόχο του miRNA-29c [29]. Η υπερέκφραση του miRNA-29c σε κύτταρα ηπατοκυτταρικού καρκινώματος που σχετίζονται με ιό ηπατίτιδας Β κατασταλεί αποτελεσματικά έκφραση TNFAIP3 και αντιγραφής του HBV DNA, καθώς και την αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού και επαγωγή απόπτωσης [29]. miRNA-29c μπορεί να επηρεάσει ογκογένεση δουλεύοντας μέσα στα όρια των γνωστών ογκοκατασταλτικών (δηλαδή, p53) οδών. Η ρ53 ογκοκατασταλτικό, που κωδικοποιείται από το

TP53

γονίδιο, αναγνωρίζεται ως θεματοφύλακας του ανθρώπινου γονιδιώματος, διότι ρυθμίζει πολλές κατάντη γονίδια για να ασκεί τα καθήκοντά της στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και κυτταρικό θάνατο. Kumar

et al

επεσήμανε ότι η ανθρώπινη

TP53

γονίδιο μπορεί να ρυθμίζεται αρνητικά από αρκετούς miRNAs:. MiRNA-125β, miRNA-504, miRNA-25 και miRNA-30D [30] . Μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι miRNA-29 συμμετέχει επίσης στην οδό p53, και miRNA-29 μέλη της οικογένειας (miRNA-29α, miRNA-29b, και miRNA-29c) μπορούν να ρυθμίζουν προς τα πάνω επίπεδα p53 και επάγει την απόπτωση σε ρ53-εξαρτώμενο τρόπο με την άμεση καταστολή ρ85 άλφα (η ρυθμιστική υπομονάδα της κινάσης ΡΙ3) και CDC42 (μια οικογένεια Rho ΟΤΡάσης [31]. πρόσφατο έργο μας σχετικά με τα γονίδια-στόχους miRNA-29c πρότεινε ότι Dnmt3a, DNMT3B, και ρ53 είναι πιθανόν να εμπλέκονται στην πιθανή οδό της CRC ανάπτυξη [19]. Οι ανωτέρω μελέτες παρέχουν ενδείξεις για το ρόλο των miRNA-29c στην καταστολή CRC εξέλιξη ή επανάληψη. Ομοίως, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε ότι miRNA-29c ήταν συχνά μειωτικά σε ιστούς που επηρεάζονται από οισοφαγικό καρκίνωμα των πλακωδών κυττάρων, και miRNA-29c θα μπορούσε να καταστείλει την ανάπτυξη του όγκου μέσω επαγωγής του κυτταρικού κύκλου G (1) /G (0) σύλληψη κυρίως μέσω της διαφοροποίησης της έκφρασης κυκλίνης Ε [32]. Ομοίως, αποδείξαμε ότι η υπερέκφραση του miRNA-29c μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου, μειώνοντας η συσσώρευση του πληθυσμού φάσης S.

τα δεδομένα μας δείχνουν ότι miRNA-29c αναστέλλει εμφανώς την πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου, αλλά δεν έχει καμία επίδραση στην κυτταρική εισβολή.