Αφηρημένο

περιτοναϊκή μετάσταση είναι το πιο συχνό τύπο της υποτροπής σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο (GC) και συνδέεται με κακή πρόγνωση. Περιτοναϊκή κυτταρολογία πλύση, χρησιμοποιείται για την αξιολόγηση του κινδύνου της περιτοναϊκής μετάστασης, έχει χαμηλή ευαισθησία. Εδώ, θα εκτιμηθεί το διαγνωστικό δυναμικό της exosomal προφίλ miRNA στο περιτοναϊκό υγρό για την πρόβλεψη της περιτοναϊκή διάχυση σε GC. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από εξωσώματα απομονώθηκαν από έξι γαστρικό κακοήθη ασκίτη (MA) δείγματα, 24 υγρό περιτοναϊκής πλύσης (PLF) δείγματα, και τα υπερκείμενα καλλιέργειας (CM) των δύο ανθρώπινων γαστρικών κυτταρικές γραμμές καρκινώματος που διαφέρουν στο δυναμικό τους για περιτοναϊκή μετάσταση. Έκφραση των exosomal miRNAs αξιολογήθηκε με μικροσυστοιχίες Agilent Ανθρωπίνων miRNA και ποσοτικής αλυσιδωτής πολυμεράσης μεταγραφής αντίδραση της αντίστροφης (qRT-PCR). Η ανάλυση μικροσυστοιχιών έδειξε μία χαμηλή μεταβλητότητα του αριθμού και της έντασης σήμα του miRNAs ανιχνεύθηκαν μεταξύ των δειγμάτων. Στα έξι υγρά MA, miR-21 έδειξε την υψηλότερη ένταση του σήματος. Έχουμε εντοπίσει πέντε miRNAs (miR-1225-5p, miR-320c, miR-1202, miR-1207-5p, και miR-4270) με υψηλή έκφραση σε δείγματα MA, η PLF της ορογόνο-επεμβατική GC, και το CM ενός ιδιαίτερα μεταστατική κυτταρική GC γραμμή? Αυτά τα υποψήφια είδη miRNA φαίνεται να σχετίζεται με την περιτοναϊκή διάχυση. Διαφορική έκφραση του miR-21, miR-320c, και miR-1225-5p επικυρώθηκε στο PLF του ορογόνο-επεμβατική και μη επεμβατική GC από qRT-PCR και miR-21 και miR-1225-5p επιβεβαιώθηκαν να συνδέεται με ορογόνο εισβολή στο GC. PLF μπορούν να χρησιμοποιηθούν για το προφίλ της έκφρασης των miRNAs exosomal. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι το miR-21 και miR-1225-5p μπορεί να χρησιμεύσει ως βιοδείκτες της περιτοναϊκής υποτροπής μετά από θεραπευτική εκτομή GC, παρέχοντας έτσι μια νέα προσέγγιση για την έγκαιρη διάγνωση της περιτοναϊκής διάδοση της GC

Παράθεση:. Tokuhisa Μ, Ichikawa Υ, Kosaka Ν, Ochiya Τ, Yashiro Μ, Hirakawa Κ, et al. (2015) Exosomal miRNAs από Περιτόναιου υγρό πλύσης ως πιθανοί Προγνωστική βιοδείκτες της περιτοναϊκής μετάστασης σε γαστρικού καρκίνου. PLoS ONE 10 (7): e0130472. doi: 10.1371 /journal.pone.0130472

Επιμέλεια: Soheil Σ Dadras, Πανεπιστήμιο του Κονέκτικατ Κέντρο Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 1 Φλεβάρη 2015? Αποδεκτές: 20η Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 24 Ιουλίου 2015

Copyright: © 2015 Tokuhisa et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρές (19-23 νουκλεοτίδια) μη-κωδικοποίησης RNAs που λειτουργούν ως μετα-μεταγραφική ρυθμιστές της γονιδιακής έκφρασης και παίζουν σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του πολλές βιολογικές διαδικασίες, συμπεριλαμβανομένων των κυτταρική διαφοροποίηση, τον πολλαπλασιασμό, και απόπτωση [1]. έχουν miRNAs έχει αποδειχθεί ότι έχουν ογκογόνο ή καταστολής όγκου δραστηριότητα, και απορρυθμισμένη έκφραση πολλών ειδών miRNA έχει ανιχνευθεί σε διάφορους καρκίνους, υποδηλώνοντας πιθανή εφαρμογή των miRNAs ως βιοδείκτες της εξέλιξης του καρκίνου και μετάσταση [2-5].

miRNAs τυλιγμένο σε εκκριτικά κυστίδια (π.χ. εξωσώματα, αποπτωτικά σώματα, και ρίχνοντας μικροκυστίδια), η οποία miRNAs ασπίδα από την υποβάθμιση από RNAse και να χρησιμεύσει ως οχήματα για την έκκριση των miRNAs σε εξωκυττάρια υγρά χώρο και το σώμα. Τα εξωσώματα είναι μικρές μεμβρανώδη κυστίδια που έχουν ενοχοποιηθεί σε κυτταρικές ανοσοαποκρίσεις? Ωστόσο, πρόσφατα έχει καταστεί προφανές ότι εξωσώματα περιέχουν σημαντικές ποσότητες RNA και μπορεί να εμπλέκεται σε ανοσο-ανεξάρτητη ρυθμιστικών μηχανισμών. Έχει πλέον αποδειχθεί ότι εξωσώματα μπορεί να εκτελέσει μεσοκυττάρια μεταφορά των miRNAs, συμμετέχοντας έτσι σε μηχανισμούς σηματοδότησης miRNA με βάση [6]. Υψηλότερα επίπεδα εξωσωμάτων miRNA περιέχουν έχουν επίσης ανιχνευθεί στο πλάσμα των ασθενών με καρκίνο σε σχέση με εκείνη των υγιών ατόμων [7], υποδηλώνοντας ότι εξωσωμάτων που βασίζεται έκκριση miRNA εμπλέκεται στην ανάπτυξη του καρκίνου. Ανάλυση της ανώμαλης έκφρασης miRNA στον ορό, το σάλιο, τα κόπρανα και τα ούρα έχει χρησιμοποιηθεί για την έγκαιρη ανίχνευση της Β-κυτταρικό λέμφωμα, και από του στόματος, του εντέρου, και καρκίνοι της ουροδόχου κύστης [8-11].

Καρκίνος στομάχου (GC) είναι η δεύτερη πιο κοινή αιτία θανάτου από καρκίνο σχετίζονται παγκοσμίως [12]. Το περιτόναιο είναι η πιο συχνή θέση μετάστασης και την επανάληψη της GC, και κακοήθη ασκίτη (ΜΑ), που προκαλείται από περιτοναϊκή διάχυση των καρκινικών κυττάρων, έχουν συσχετιστεί με φτωχή πρόγνωση. Επί του παρόντος, δεν υπάρχουν αξιόπιστα μέσα πρόβλεψης για την ανάπτυξη του κακοήθους ασκίτη περιτοναϊκής σε ασθενείς GC. εξωσώματα miRNA περιέχουν αντιπροσωπεύουν ένα νέο μηχανισμό διακυτταρικής σηματοδότησης και μπορεί να δώσει πληροφορίες στο περιβάλλον που επιτρέπει τη διάδοση του καρκίνου στο περιτόναιο [13].

Σε αυτή τη μελέτη, εξωσώματα απομονώθηκαν από ΜΑ και την διεγχειρητική υγρό περιτοναϊκής πλύσης δείγματα (PLF) που λαμβάνεται από ασθενείς GC, και το μέσο καλλιέργειας (CM) των ιδιαίτερα επεμβατική περιτοναϊκής κυτταρικές σειρές, και miRNAs στη συνέχεια εξάγεται από τα δείγματα αυτά. επαληθεύτηκαν Η ποιότητα των εξαγόμενων miRNAs exosomal και η συνοχή των προτύπων έκφρασης των miRNAs. προφίλ έκφρασης miRNA στην MA, PLF, και τα δείγματα CM συγκρίθηκαν και εντοπίστηκαν υποψήφιος miRNAs που σχετίζονται με την περιτοναϊκή διάχυση του GC.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς

Όλοι οι ασθενείς ή κηδεμόνες τους, εφόσον έγγραφη ενημερωμένη συγκατάθεση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Yokohama City University Hospital (Έγκριση Αρ A110127001).

MA και διεγχειρητική PLF δείγματα συλλέχθηκαν από ασθενείς GC με τις κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά που παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Όλοι οι ασθενείς είχαν προηγουμένως διαγνωστεί με GC με ιστοπαθολογική ανάλυση δειγμάτων βιοψίας που λαμβάνονται από τις πρωτογενείς βλάβες, και έξι ασθενείς ΜΑ είχε διαγνωστεί για την παρουσία ασκίτη από κοιλιακό υπολογιστικής τομογραφίας (CT) σάρωσης. Ασκίτη αναλύθηκαν επίσης με κυτταρολογική εξέταση και όλες επιβεβαιώθηκαν ως θετικά για κακοήθεια από παθολόγους? τα υπόλοιπα δείγματα ΜΑ χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση miRNA. PLF ήταν διεγχειρητικά συλλέχθηκαν από 24 ασθενείς GC (Πίνακας 1). Μετά λαπαροτομία, 100 mL φυσιολογικού ορού χύθηκε στο θύλακα του Douglas και περιτοναϊκής νερό πλύσης συλλέχθηκε πριν από τη χειρουργική εκτομή του όγκου. PLF αναλύθηκε με κυτταρολογική εξέταση και χρησιμοποιείται για την απομόνωση miRNA. Μεταξύ των 24 PLF δείγματα, έξι αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας miRNA μικροσυστοιχιών και 18 αναλύθηκαν με qPCR

καλά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα (καλά).? μετρίως διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα (mod)? φτωχά διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα (κακή). Κακοήθη ασκίτη (MA)? υγρό περιτοναϊκής πλύσης (PLF)? στάδιο TMN (UICC 7η έκδοση)? Παρόν (Ρ) Απουσία (Α)? Περιτοναϊκή πλύση κυτταρολογική εξέταση (CY)?

Η

καλλιέργειας κυττάρων

Η κυτταρική σειρά OCUM-2M ιδρύθηκε από έναν πρωτοπαθή όγκο των σκιρώδης γαστρικού καρκινώματος και την κυτταρική γραμμή OCUM-2MD3 προήλθε από κύτταρα OCUM-2Μ με υψηλό δυναμικό για περιτοναϊκή διάχυση σε γυμνούς ποντικούς [14]. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle (ϋΜΕΜ? Ϋίβ Technologies, Grand Island, ΝΥ) συμπληρωμένο με 10% ορό απενεργοποιημένο με θέρμανση εμβρυϊκό ορό (FBS) και αντιβιοτικά-αντιμυκητιασικό στους 37 ° C σε ένα 5% CO

2 εκκολαπτήριο. Για την απόκτηση των κυττάρων CM, OCUM-2M και OCUM-2MD3 κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με ϋΜΕΜ χωρίς ορό συμπληρωμένο με αντιβιοτικό-αντιμυκητικό και επωάστηκαν στο ίδιο μέσο για 48 ώρες.

Απομόνωση εξωσωμάτων

δείγματα για απομόνωση εξωσωμάτων παρασκευάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Για να αφαιρέσετε τα μεγάλα σωματίδια των κυττάρων και κυτταρικών θραυσμάτων, ΜΑ, PLF, και CM φυγοκεντρήθηκαν στις 2000 χ

g

για 15 λεπτά στους 4 ° C και διηθείται μέσω φίλτρου 0,22 μm-(Millipore, Billerica, ΜΑ). Το υπερκείμενο αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρις ότου απαιτείται για την εκχύλιση miRNA.

Για την καταβύθιση εξωσώματα, τα δείγματα φυγοκεντρήθηκαν σε 110.000 χ

g

για 70 λεπτά στους 4 ° C. Το σφαιρίδιο Εξώσωμα πλύθηκε με 11 κ.εκ. αλατόνερου ρυθμισμένου με φωσφορικό (PBS) και φυγοκεντρήθηκε ξανά όπως περιγράφεται. Το ίζημα χρησιμοποιήθηκε για την εκχύλιση RNA.

Σύνολο εκχύλιση RNA και ανάλυση

Ολικό RNA εκχυλίστηκε από εξωσώματα χρησιμοποιώντας ένα κιτ miRNeasy mini (Qiagen, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και ήταν στη συνέχεια αποθηκεύεται στους -80 ° C μέχρις ότου απαιτείται περαιτέρω ανάλυση.

Η ποιότητα, η συγκέντρωση, και το μέγεθος του συνολικού RNA exosomal αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας μια Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Foster City, CA). Πριν από την ανάλυση, το ολικό RNA παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας μια Agilent RNA 6000 κιτ Pico (Agilent Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

Mirna μικροσυστοιχιών

miRNAs που εξάγεται από τις έξι MA, έξι PLF, και δύο δείγματα CM αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Agilent Ανθρωπίνων miRNA μικροσυστοιχίες (Agilent Technologies), το οποίο περιέχει 1.226 ανθρώπινα miRNAs και 146 ιογενή miRNAs άνθρωπο. Για την ανίχνευση miRNA, 100 ng RNA σημάνθηκε και υβριδοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ Human miRNA μικροσυστοιχιών (Σχετ 16,0? Agilent Technologies) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (miRNA Πλήρης Σήμανση και κιτ Hyb για miRNA μικροσυστοιχιών System). σήματα υβριδοποίησης ανιχνεύθηκαν με G2505C DNA μικροσυστοιχιών Scanner (Agilent Technologies) και τις σαρωμένες εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Λογισμικό Feature Extraction Agilent (ν. 10.7.3.1). Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με τη χρήση του λογισμικού Agilent GeneSpring GX ν. 11.0.2. (Log

2 μετασχηματισμό). Baseline μετασχηματισμός δεν πραγματοποιήθηκε.

Η ποιότητα της εκχύλισης miRNA αναλύθηκε σύμφωνα με τη διακύμανση του αριθμού των μικροσυστοιχιών-ανιχνευθούν είδη miRNA, σηματοδοτούν ένταση, και η συσχέτιση της έκφρασης των miRNAs μεταξύ των δειγμάτων σύμφωνα με την μέση τιμή ± SD, συντελεστής μεταβλητότητας (CV), και συντελεστή συσχέτισης (CC).

Η επιλογή της περιτοναϊκής μετάστασης ειδικά miRNAs

Τα προφίλ έκφρασης των miRNAs exosomal αναλύθηκαν για να επιλέξετε miRNAs που είναι ειδικά για περιτοναϊκή GC διάδοσης χρησιμοποιώντας την ακόλουθη σταδιακή προσέγγιση. Βήμα 1: προφίλ miRNA στο CM των πολύ μεταστατικός περιτοναϊκά κύτταρα OCUM-2MD3 συγκρίθηκαν με εκείνα των γονικών κυττάρων μη μεταστατικό OCUM-2Μ, και εκφράζονται διαφορικά miRNAs (μέση πολλαπλή μεταβολή, & gt? 2) επιλέχθηκαν

Βήμα 2: έξι PLF δείγματα ταξινομήθηκαν σε δύο ομάδες: T4 (n = 4) και Τ1-Τ3 (n = 2), σύμφωνα με το στάδιο του καρκίνου από το μέγεθος και την επέκταση του όγκου (UICC-AJCC, 7

η έκδοση). Στάδιο Τ4 GC χαρακτηρίζεται από την υψηλότερη συχνότητα της περιτοναϊκής μεταστάσεων σε σύγκριση με άλλα στάδια [16]. Τα προφίλ έκφρασης miRNA της ομάδας Τ4 συγκρίθηκαν με εκείνα της ομάδας Τ1-Τ3 και διαφορικά εκφρασμένων miRNAs (μέση πολλαπλή μεταβολή, & gt? 2) επιλέχθηκαν

Βήμα 3:. Οι επιλεγμένες miRNAs που ήταν κοινές για τόσο βήματα και ότι εκφράστηκαν σε ΜΑ περαιτέρω φιλτράρονται ανάλογα με την ένταση του σήματος. Εκείνοι με τιμές έντασης άνω των log

2 10 στο ΜΑ και PLF επιλέχθηκαν ως υποψήφια miRNAs που σχετίζονται με την περιτοναϊκή μεταστάσεις? miR-21 έδειξε την υψηλότερη μέση ένταση του σήματος μεταξύ των δειγμάτων ΜΑ. Η διαφορική έκφραση των ειδών miRNA επιλεγμένων στο Στάδιο 3 ελέγχθηκε στα υπόλοιπα 18 δείγματα PLF με qRT-PCR.

Ποσοτική ανάλυση της περιτοναϊκής έκφρασης miRNA μετάσταση-ειδική με qRT-PCR

TaqMan microRNA δοκιμασίες (Life Technologies) χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση των σχετικών επιπέδων έκφρασης του miR-21 (ID δοκιμασία. 000397), miR-320c (δοκιμασία ID. 241053_mat), miR-1225-5p (ID δοκιμασία. 002764), και miR-16 (ID δοκιμασία. 000391). Αντίστροφη μεταγραφή πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το TaqMan miRNA RT Kit (Life Technologies) υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 30 λεπτά στους 16 ° C, 30 λεπτά στους 42 ° C, και 5 λεπτά στους 85 ° C. PCR πραγματοποιήθηκε σε πλάκες 96 φρεατίων με τη χρήση του 7500 Real Time PCR System (Life Technologies)? Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Τα επίπεδα έκφρασης του miRNAs στόχου κανονικοποιήθηκαν προς εκείνη του miR-16, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως σταθερά εκφράζεται ελέγχου [17]. Κατά την ανάλυση των δεδομένων των μικροσυστοιχιών μας exosomal miRNA σε κακοήθη δείγματα ασκίτη, miR-16 παρουσίασε το χαμηλότερο συντελεστή μεταβλητότητας (CV = 4%) από τα εσωτερικά πρότυπα υποψηφίου, συμπεριλαμβανομένων των miR-638 (CV = 8%), αφήστε-7α (CV = 8%), και 142-3p (CV = 23%).

Η στατιστική ανάλυση

οι συνεχείς μεταβλητές συγκρίθηκαν με τη χρήση του Student

t-test

. Όταν είναι απαραίτητο, η

t-test

τροποποιήθηκε για να συγκρίνετε άνισες διακυμάνσεις. Η διαφορά μεταξύ κατηγορικών μεταβλητών εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. Συσχέτιση μεταξύ δύο μεταβλητών εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Pearson συντελεστής συσχέτισης. Οι διαφορές θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές σε Ρ & lt? 0.05. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση SPSS 21.0 λογισμικό για Windows (ΙΒΜ, Armonk, NY).

Αποτελέσματα

Ποσοτική ανάλυση εξάγεται exosomal RNA

Το συνολικό RNA εξήχθη από εξωσώματα απομονωμένες από MA, διεγχειρητική PLF και κυττάρων CM. Η μέση συγκέντρωση του εκχυλισμένου exosomal RNA ήταν 4,4 ng /μL (που κυμαίνονται από 1,2 ng να 6,1 /μL) για MA και 6,4 ng /μL (από 1,7 να 16,4 ng /μL) για PLF. Ηλεκτροφορήματα αποκάλυψε ένα μεγάλο ποσοστό των μικρών RNA υπάρχει σε όλα τα CM και κλινικά δείγματα, ενώ καθόλου ή πολύ λίγο μόλυνση με 18S και 28S ριβοσωμικού RNA (χωρίς διακριτές κορυφές στο αντίστοιχο μοριακό βάρος) παρατηρήθηκε (Σχήμα 1).

Διακύμανση και τα κοινά στοιχεία μεταξύ των δειγμάτων. Αξιολόγηση της συνολικής exosomal RNA χρησιμοποιείται μια Bioanalyzer 2100. Οι ηλεκτροφορήματα δείχνουν την κατανομή μεγέθους (νουκλεοτίδια, nt) και η ένταση φθορισμού (FU) του συνολικού RNA exosomal απομονωθεί από ΜΑΟ, ΜΑ, και PLF. Το χαμηλότερο ακίδα (περίπου 25 nt) σε κάθε δείγμα είναι ο δείκτης της Agilent RNA 6000 κιτ Pico.

Η

Απόδοση των miRNA microarrays

Για να δοκιμαστεί η έκφραση των μικροσυστοιχιών exosomal miRNA στην κάθε ομάδα δειγμάτων, εξετάσαμε τον αριθμό των εντοπισμένων miRNAs, εκατοστημόριο της έντασης του σήματος, τον αριθμό των συνήθως συλλαμβάνονται miRNAs, και η συσχέτιση της έκφρασης των miRNAs μεταξύ των ομάδων. Οι αριθμοί των miRNA ειδών ανιχνεύεται σε κάθε ομάδα με microarray παρουσιάζεται στο Σχ 2. Στην έξι MA και έξι δείγματα PLF, αυτά σημαίνουν οι αριθμοί ήταν 490,1 (SD = 42.3? CV = 8,6%) και 367,5 (SD = 13.4? CV = 3,6%), αντίστοιχα. Σε κάθε ομάδα, η μεταβλητότητα του αριθμού των διαπιστωμένων miRNAs μεταξύ των δειγμάτων ήταν χαμηλή

Η

κατανομής της έντασης σήματος για κάθε ομάδα παρουσιάζεται στο Σχήμα 3.? αυτό δείχνει τα επεξεργασμένα σήματα ρυθμίζεται σύμφωνα με την 25, 50, 75, και 90

ο εκατοστημόριο σε κάθε ομάδα. Στο 50

ου εκατοστημόριο, το αρχείο καταγραφής

2 σχετικές εντάσεις σήματος για MA (Σχήματα 3-1) και PLF (Σχήματα 3 και 2) δείγματα και μεταξύ των τριών ομάδων (MA, PLF, και CM, σχήματα 3 και 4) ήταν 5,53 ± 0,19 (CV = 3,49%), 6,14 ± 0,24 (CV = 3,87%), και 4,97 ± SD (CV = 5,24%), αντίστοιχα. Η μεταβλητότητα της έντασης του σήματος μεταξύ των δειγμάτων σε κάθε ομάδα, καθώς και μεταξύ των ομάδων ήταν χαμηλή.

Η

Οι αριθμοί των miRNAs κοινή μεταξύ των δειγμάτων στο MA, PLF, και οι ομάδες ΚΕ 327, 263 και 354, αντίστοιχα, ενώ αυτό ήταν 194 για τις τρεις ομάδες (Σχήμα 4).

ο Πίνακας 2 δείχνει τη συσχέτιση της έκφρασης των miRNAs μεταξύ κάθε δύο δείγματα. Τα υψηλότερα και τα χαμηλότερα CC τιμές ήταν 0,94 και 0,68, αντίστοιχα? ο μέσος όρος CC όλων των δειγμάτων ήταν 0,79 (CV = 8,86%). Σε MA, PLF, και ομάδες CM, οι μέσες τιμές CC ήταν 0,85, 0,88 και 0,90, αντίστοιχα, και η μεταβλητότητα στα προφίλ έκφρασης για κάθε ομάδα ήταν χαμηλή.

Η

Η επιλογή των υποψηφίων miRNAs σχετικών σε περιτοναϊκή διάχυση

Μέχρι σήμερα, δεν υπάρχουν στοιχεία ήταν διαθέσιμα στα προφίλ έκφρασης των miRNAs exosomal που σχετίζονται με περιτοναϊκή διάχυση, λόγω της μη διαθεσιμότητας της κανονικής ασκητικά υγρά έναντι των οποίων να συγκρίνουν τα προφίλ έκφρασης ΜΑ. Επιλέξαμε miRNAs που σχετίζονται με την περιτοναϊκή διάχυση χρησιμοποιώντας μια σταδιακή προσέγγιση. Ο αριθμός των miRNAs συνήθως σταματούν σε έξι δείγματα MA ήταν 327. Στα βήματα 1 και 2, 140 και 118 μετάσταση ειδικά miRNAs επιλέχθηκαν στις ομάδες ΚΕ και PLF, αντίστοιχα. Από αυτά τα 327, 140 και 118 miRNAs, επελέγησαν πέντε miRNAs ως υποψήφιες σχετίζονται με περιτοναϊκή διάχυση (Σχήμα 5). Δύο από αυτούς (miR-1225-5p και miR-320c) και miR-21 με την υψηλότερη ένταση του σήματος μεταξύ των ΜΑ-ειδικά miRNAs έχουν επικυρωθεί ως διαφορικά εκφρασμένων σε 18 δείγματα PLF, χρησιμοποιώντας qPCR (Πίνακας 3).

Σχηματική αναπαράσταση της σταδιακή προσέγγιση για την εξέταση miRNAs που σχετίζονται με την περιτοναϊκή διάχυση. Βήμα 1: Επιλογή των miRNAs διαφορικά εκφρασμένων (πολλαπλή μεταβολή, & gt? 2) σε μέσο καλλιέργειας (CM) του άκρως μεταστατικού περιτοναϊκή κυτταρική γραμμή OCUM-2MD3 (OCUM-2Μ γονική κυτταρική γραμμή χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος). Βήμα 2: έξι περιτοναϊκή πλύση ρευστού (PLF) δείγματα χωρίστηκαν σε Τ4 (n = 4) και τις ομάδες Τ1-Τ3 σύμφωνα με το στάδιο του καρκίνου του γαστρεντερικού? miRNAs εκφράζονται διαφορικά (πολλαπλή μεταβολή, & gt? 2) επελέγησαν στην ομάδα Τ4. Βήμα 3: τα επιλεγμένα είδη miRNA κοινό για τα βήματα 1 και 2 και εκφράζεται σε κακοήθη ασκίτη (ΜΑ) με ένταση σήματος & gt? ημερολόγιο

2 10 στο ΜΑ και PLF θεωρήθηκαν ως υποψήφιος miRNAs που σχετίζονται με την περιτοναϊκή μεταστάσεις

Η

Τα κακοήθη ασκίτη (ΜΑ).? υγρό περιτοναϊκής πλύσης (PLF)? μέσο όρο (CM), Τ στάδιο UICC 7

ου έκδοση (Τ4, T1-3)? OCUM-2M (2Μ)? OCUM-2MD3 (D3).

Η

Επικύρωση των υποψήφιων έκφρασης των miRNAs από qPCR

Δεκαοκτώ δείγματα PLF χωρίστηκαν σε δύο ομάδες ανάλογα με το μεταστατικό στάδιο, T4 (διάτρητο ορογόνο, n = 9) και Τ1-Τ3 (subserosa ή λιγότερο, η = 9), και η έκφραση του miR-21, miR-320c, και miR-1225-5p αναλύθηκε με qRT-PCR. Σχήμα 5 δείχνει ότι τα επίπεδα του miR-21 και miR-1225-5p σε ασθενείς GC Τ4 σταδίου ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με αυτές των ασθενών Τ1-Τ3 (miR-21, P = 0,027, και miR-1225-5p, P = 0.008? Σχήμα 5). . Η διαφορά στην έκφραση του miR-320c ανάμεσα σε δύο ομάδες ασθενών ήταν μη σημαντική (P = 0,928, σχήμα 6)

Ο αστερίσκος υποδηλώνει Ρ & lt? 0.05.

Η

Στη συνέχεια, η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των miRNAs και κλινικό υπόβαθρο των ασθενών GC εξετάστηκε (Πίνακας 4). MiR-21 και miR-1225-5p έκφραση ήταν σημαντικά υψηλότερη σε ασθενείς με καρκίνο Τ4-στάδιο από ό, τι σε ασθενείς Τ1-Τ3-στάδιο (Ρ = 0,015). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των miRNAs και άλλες κλινικές παραμέτρους.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε, για πρώτη φορά, το περιεχόμενο miRNA εξωσωμάτων απομονωθεί από ΜΑ και PLF των ασθενών GC. Η μελέτη μας δείχνει ότι exosomal miRNAs μπορούν να εξαχθούν με συνέπεια από το ΜΑ και PLF και ότι τα προφίλ έκφρασης των miRNAs μπορούν να δείξουν την κατάσταση του περιτοναίου σε ασθενείς GC.

Η πρόγνωση του GC με ορογόνο εισβολή παραμένει φτωχή, ακόμη και μετά R0 εκτομή, επειδή του υψηλού ποσοστού υποτροπής, ιδιαίτερα περιτοναϊκή μεταστάσεις (PM) [18]. Μμ σε GC είναι το πιο πολύπλοκο τύπο επανάληψης, επειδή είναι δύσκολο να προβλεφθεί, καθώς και για τη διάγνωση. Αν και ασκίτη είναι το πιο κοινό σύμπτωμα ΡΜ, πολλοί ασθενείς με GC PM δεν αναπτύσσουν ασκίτη. Μεταξύ των διαγνωστικές μέθοδοι απεικόνισης που βασίζονται, υψηλής ταχύτητας σπειροειδής CT χρησιμοποιείται ευρέως για την αξιολόγηση της προεγχειρητικής σταδιοποίησης του GC και μετα-θεραπευτική παρακολούθηση? Ωστόσο, στην περίπτωση των PM διαγνωστική ακρίβεια της είναι ανεπαρκής, κυρίως λόγω της χαμηλής ευαισθησίας [19]. Χρησιμοποιώντας PET-CT για τα PM διάγνωση σε GC είναι επίσης αμφιλεγόμενη, όπως έχει αναφερθεί ότι η FDG-PET έχει χαμηλή ευαισθησία για την ανίχνευση των ΑΣ σε GC [20]. PLF έχει γίνει ο επόμενος στόχος για τη διάγνωση και την πρόβλεψη των ΑΣ στο GC. Κυτταρολογική εξέταση των διεγχειρητικά συλλέγονται PLF χρησιμοποιείται για την πρόβλεψη της περιτοναϊκής υποτροπής [21] και χρησιμοποιείται για τη σταδιοποίηση GC στην Ιαπωνία [22]. Ωστόσο, ορισμένοι ερευνητές έχουν αναφέρει ότι PLF κυτταρολογία δεν επιδεικνύει την ευαισθησία που απαιτείται για την πρόβλεψη και την ανίχνευση των ΑΣ [21], και έχουν προτείνει την χρήση μοριακών διαγνωστικών μεθόδων, όπως RT-PCR, για την ανίχνευση του μικρο-μεταστάσεων σε PLF. Σε μία πολυκεντρική προοπτική μελέτη, η έκφραση του mRNA των γονιδίων που κωδικοποιούν το καρκινοεμβρυϊκό αντιγόνο (CEA) και κυτοκερατίνη 20 (CK-20), αξιολογούνται με RT-PCR, έχει αποδειχθεί ότι είναι χρήσιμος για την πρόβλεψη της συνολικής επιβίωσης και ΑΣ στον GC [23] . Ωστόσο, το μειονέκτημα των διαγνωστικών μεθόδων mRNA που βασίζεται είναι η υψηλή ικανότητα αποικοδόμησης του mRNA κατά τη διάρκεια των χειρουργικών επεμβάσεων.

Σε αντίθεση, miRNAs περικλείονται σε εξωσώματα παραμένουν σταθερές και μπορούν να κυκλοφορούν σε σωματικά υγρά, όπως ορός, πλάσμα , σάλιο, ούρα, μητρικό γάλα, και τα δάκρυα, για μεγάλες χρονικές περιόδους [24, 25]? εξωσώματα έχουν επίσης απομονωθεί από ΜΑ στον καρκίνο των ωοθηκών [26].

Για το καλύτερο της γνώσης μας, δεν έχει υπάρξει καμία έκθεση για miRNAs exosomal απομονώνονται από το PLF των ασθενών GC. Levänen et al. συλλέγονται εξωσώματα από το βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα και αναλύθηκαν exosomal έκφραση των miRNAs για την ανίχνευση αλλεργιών που σχετίζονται με τα είδη miRNA [27]. Liu et al. ανέφεραν ότι εξωσώματα απομονώθηκαν από cervicovaginal υγρό πλύσης περιείχε υψηλά επίπεδα miR-21, το οποίο θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης του καρκίνου του τραχήλου [28]. Εδώ, αναλύσαμε τα προφίλ έκφρασης των miRNAs exosomal στο PLF των ασθενών GC από την τεχνολογία των μικροσυστοιχιών miRNA, προκειμένου να προσδιοριστούν οι υποψήφιες διαγνωστικών βιοδεικτών miRNA για την πρόβλεψη των μεταστάσεων σε GC.

Στην έρευνα μας, ο πρώτος λαϊκός πρόκληση στην ποσοτική απομόνωση exosomal miRNA από PLF. Weber et al. αξιολογήθηκε έκφραση miRNA σε 12 σωματικά υγρά και ανέφεραν ότι η συνολική συγκέντρωση RNA στο περιτοναϊκό υγρό ήταν 775 μg /L [25], η οποία ήταν μικρότερη από εκείνη που θα ληφθεί από ΜΑ και PLF-4400 και 6400 μg /L, αντίστοιχα Ο λόγος για το διαφορά μπορεί να είναι η μέθοδος που χρησιμοποιείται για την απομόνωση του ολικού RNA, επειδή Weber et al. κατευθείαν εκχυλίζεται RNA από περιτοναϊκό υγρό, ενώ απομονώσαμε πρώτα εξωσώματα και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται αυτές για εξαγωγή RNA. Ανάλυση της ποιότητας του RNA που απομονώθηκε από PLF επιδείξει πληθώρα μικρών (& lt? 200 nt) των ειδών RNA σε CM και ΜΑ. Δεν υπήρχαν διακριτές 18S και 28S ριβοσωμικό RNA κορυφές στην προετοιμασία, υποδεικνύοντας την απουσία μόλυνσης με ενδοκυτταρικό RNA.

Το δεύτερο πρόβλημα που αντιμετωπίζουν στην παρούσα μελέτη συμμετείχαν συνέπεια στην ποιότητα των miRNAs exosomal απομονωθεί. Στη μελέτη μας, παρατηρήσαμε χαμηλή μεταβλητότητα του αριθμού των διαπιστωμένων ειδών miRNA και miRNA ένταση του σήματος, και μια υψηλή συσχέτιση της έκφρασης των miRNAs μεταξύ των δειγμάτων σε κάθε ομάδα. Ο μέσος αριθμός των ανιχνεύσιμων miRNAs στο ΜΑ και PLF ήταν 490 και 367, τα οποία ήταν σε συμφωνία με τον αριθμό των miRNAs (397) προηγουμένως ανιχνευθεί σε περιτοναϊκό υγρό [25].

PLF και δείγματα ΜΑ έδειξαν χαμηλή μεταβλητότητα ένταση του σήματος (CV = 3,87% για το 50

ο εκατοστημόριο). Επιπλέον, τα πρότυπα έκφρασης miRNA συσχετίζονταν ισχυρά μεταξύ των δειγμάτων σε κάθε ομάδα (CC & gt? 0.850), καθώς και μεταξύ των ομάδων (0,8 & gt? CC & gt? 0,7). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι PLF θα μπορούσε να είναι μια πηγή υψηλής απόδοσης καλής ποιότητας miRNAs, τα οποία δείχνουν συνεπή πρότυπα έκφρασης στην ανάλυση μικροσυστοιχιών.

Τα προφίλ έκφρασης των miRNAs αναλύθηκαν για να επιλέξετε miRNAs ειδικά για περιτοναϊκή μετάσταση. MiR-21 έδειξε υψηλότερη έκφραση σε ασθενείς με καρκίνωμα Τ4-στάδιο σε σχέση με εκείνα της ομάδας Τ1-Τ3. Fabbri et al. ανέφεραν ότι miR-21 και miR-29a στον καρκίνο κυκλοφορήσει εξωσώματα επηρεάζεται η ανάπτυξη του όγκου και να εξαπλωθεί με σύνδεση προς και ενεργοποίηση TLRs στις γύρω ανοσοκύτταρα και προκαλώντας prometastatic φλεγμονώδη απόκριση [29]? Αυτό υποστήριξε την άποψη ότι εξωσώματα που προέρχονται από όγκους συμβάλλουν στην προ-μεταστατικούς μικροπεριβάλλον [30, 31]. Αυτό μπορεί να σημαίνει ότι η Τ4 εξωσώματα καρκίνωμα που προέρχονται από τη δημιουργία του προ-μεταστατικούς θέση στο περιτόναιο, η οποία στη συνέχεια υποστηρίζει περιτοναϊκής εισβολής μετά την θεραπευτική εκτομή του GC.

Χρησιμοποιώντας μια σταδιακή προσέγγιση, έχουμε επιλέξει πέντε miRNAs exosomal (miR-320c , miR-1202, miR-1225-5p, miR-1207-5p, και miR-7270) και επικύρωσε την έκφραση του miR-320 και miR1225-5p στο PLF 18 ασθενείς CG από qRT-PCR. Mir-1225-5p έδειξε υψηλότερη έκφραση σε Τ4 από ό, τι στην Τ1-Τ3 ασθενείς σταδίου CG, επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με μικροσυστοιχίες, ενώ δεν υπήρχε διαφορά στα επίπεδα του miR-320 μεταξύ των ομάδων ασθενών. Mir-1225 στόχους, η πολυκυστική νόσος των νεφρών γονίδιο,

ΡΚϋ1

, η οποία μεταλλάσσονται συχνά στον αυτοσωματικό κυρίαρχο πολυκυστική νόσος των νεφρών? Έτσι, miR1225 μπορεί να επηρεάσει την εξέλιξη της ασθένειας αυτής [31]. Ωστόσο, η σχέση μεταξύ miR-1225 και ο καρκίνος παραμένει ασαφής. MiR-21 και miR-1225-5p μπορεί να προετοιμάσει ένα προ-μεταστατικούς θέση στο περιτόναιο για τη διάδοση και τον διακανονισμό των καρκινικών μεταστασιάζονται κυττάρων και έτσι μπορεί να υποδεικνύει την προδιάθεση για την περιτοναϊκή υποτροπή μετά από θεραπευτική εκτομή GC.

PLF δίνει πληροφορίες σχετικά με την κατάσταση του περιτοναίου, όπως αλλαγές στον πληθυσμό των κυττάρων του ανοσοποιητικού και η έκκριση παραγόντων ανάπτυξης και κυτοκινών [32, 33]. Οι κυτταρολογία και μοριακές διαγνωστικές δοκιμασίες που βασίζονται στην ανίχνευση των καρκινικών κυττάρων, ενώ προφίλ των miRNAs στο PLF μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόβλεψη της περιτοναϊκής προ-μεταστατικό φαινότυπο σε GC, εξασφαλίζοντας πιο αποτελεσματικά προληπτικά και θεραπευτικά μέτρα.