Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι ανώμαλη ενεργοποίηση του Hedgehog (Hh) σηματοδότηση από παράγοντες μεταγραφής Gli είναι χαρακτηριστική μιας ποικιλίας των επιθετικών ανθρώπινων καρκινωμάτων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών. Ως εκ τούτου, χημειοθεραπευτικούς παράγοντες που αναστέλλουν την ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής Gli έχουν αναδειχθεί ως πολλά υποσχόμενη νέα θεραπευτικά φάρμακα για τον καρκίνο των ωοθηκών.

Αποτελέσματα

Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η ενεργοποίηση σηματοδότησης Hh προωθείται κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, ενώ αποκλεισμός της σηματοδότησης Hh με GANT61 κατέστειλε την κυτταρική μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Μετά τη θεραπεία με GANT61, cDNA μικροσυστοιχιών αναλύσεις αποκάλυψαν αλλαγές σε πολλές γονίδια όπως Ιντεγκρίνης β4 υπομονάδα (ITGB4), κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ), κ.λπ. Επιπλέον, ITGB4 έκφραση ρυθμίζεται προς τα πάνω με Sonic hedgehog (Shh) συνδέτη και ρυθμισμένα προς τα κάτω από αναστολέα σηματοδότησης Hh. Η Shh με τη μεσολάβηση της μετανάστευσης των ωοθηκών κυττάρων και εισβολή έχει αποκλειστεί από αντισώματα εξουδετέρωσης σε ITGB4. Επιπλέον, φωσφορυλιώσεις του FAK αυξήθηκε κατά Shh και μειώθηκε κατά αναστολέα σηματοδότηση Hh. Η αναστολή της έκφρασης Gli1 χρησιμοποιώντας siRNA μιμήθηκε τα αποτελέσματα της θεραπείας GANT61, υποστηρίζοντας την ειδικότητα του GANT61. Περαιτέρω έρευνες έδειξαν ότι η ενεργοποίηση της FAK απαιτήθηκε για την Shh με τη μεσολάβηση της μετανάστευσης κυττάρων και εισβολής. Τέλος, βρήκαμε ότι τα κάτω ρύθμιση Gli μείωσε την έκφραση του ITGB4 και φωσφορυλιωμένης FAK, με αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

.

Συμπεράσματα

Η Hh μονοπάτι σηματοδότησης επάγει κυτταρική μετανάστευση και εισβολή μέσω ITGB4 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΡΑΚ στον καρκίνο των ωοθηκών. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η ελάττωση της στιχομυθία μεταξύ φωσφορυλιωμένη FAK και ITGB4 οφείλεται στην προς τα κάτω ρύθμιση του Gli παράγοντες οικογένειας μεταγραφής μπορεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο για την αναστολή της εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Chen Q, Xu R, Ζενγκ C, Lu Q, Huang D, Shi C, et al. (2014) Down-κανονισμού του Gli μεταγραφικού παράγοντα οδηγεί στην αναστολή της μετανάστευσης και της εισβολής των κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών μέσω ιντεγκρίνη β4 Μεσολαβεί FAK σηματοδότησης. PLoS ONE 9 (2): e88386. doi: 10.1371 /journal.pone.0088386

Επιμέλεια: Frédéric André, Πανεπιστήμιο Aix-Marseille, Γαλλία

Ελήφθη: 16η Οκτωβρίου 2013? Αποδεκτές: 6 Ιανουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από την China National πρόγραμμα βασικής έρευνας (2010CB535001), το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81060095, 31171359), το Ταμείο εξειδικευμένη έρευνα για το Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης (2010360111007) και το NIH (P30 CA054174 ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι ένα από τα πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια σε όλο τον κόσμο. Λόγω των μη ειδικά συμπτώματα, οι περισσότερες των περιπτώσεων καρκίνου των ωοθηκών παρόν με προχωρημένη νόσο στάδιο και συνδέονται με ένα υψηλό ποσοστό θνησιμότητας [1]. Σε προχωρημένο καρκίνο των ωοθηκών, τα καρκινικά κύτταρα είναι ιδιαίτερα επεμβατική και μετέπειτα μεταστάσεις του καρκίνου οδηγεί στο θάνατο [2]. Η απορρύθμιση κυτταρική μετανάστευση και εισβολή συμβάλλουν στην επίτευξη της μεταστατικής ικανότητας των κυττάρων του όγκου και του μοριακού μηχανισμού που ρυθμίζει τη μετάσταση παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Ως εκ τούτου, είναι ζωτικής σημασίας για τον εντοπισμό μοριακών μεσολαβητές που προσδίδουν μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών και τελικά να χρησιμοποιούν αυτά τα μόρια ως βιοδείκτες για την πρόβλεψη του κινδύνου της εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών [3].

σκαντζόχοιρος σηματοδοσίας (Hh) έχει κινηθεί από η σύνδεση του συμπλοκοποιητού δηλαδή Sonic hedgehog (Shh), Ινδικού Hedgehog (Ihh) ή Desert Hedgehog (Dhh) στον υποδοχέα του, το Patched (Ptch), η οποία με αυτόν τον τρόπο, μειώνει τις ανασταλτικές επιδράσεις του Ptch επί της smoothened (SMO), [4]. ΠΕΑ κατόπιν εντοπίζεται στον πρωτογενή cilium, ένα οργανίδιο που παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην σηματοδότηση Hh [5] ως απόδειξη εκ SMO διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση ενός ενδοκυτταρικού καταρράκτη σε cilium που οδηγεί σε πυρηνική μετατόπιση του Gli2, ένας παράγοντας οικογένεια μεταγραφής Gli [6]. Με τη σειρά του, μετατοπίζεται Gli2 επάγει την μεταγραφή των γονιδίων στόχων Hh όπως Gli1, ένα κρίσιμο συστατικό της σηματοδότησης Hh [6], [7]. Η ικανότητα αυτών των παραγόντων μεταγραφής Gli να ενεργοποιήσετε τα γονίδια στον πυρήνα μπορεί να προωθήσει πράγματι κυτταρικού πολλαπλασιασμού, κυτταρική επιβίωση, βλαστική ικανότητα και ο προσδιορισμός των κυττάρων μοίρα σε μια ποικιλία οργάνων [8], [9]. Το πιο σημαντικό, Hh με γνώμονα καρκίνοι προκύπτουν από μία ποικιλία μεταλλάξεων που επηρεάζουν διαφορετικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων των βασικών μεταγραφικών τελεστές Gli πρωτεΐνες [10] – [12]. Ιδιοσυστατικά, HH-Gli σηματοδότηση είναι υπερκινητικά σε καρκινώματα βασικών κυττάρων, μυελοβλαστώματα και καρκίνους του οισοφάγου, λόγω μετάλλαξης στο Patched ή smoothened [13]. Επίσης, η παρουσία του απελευθερωμένης άξονα σηματοδότησης Hh-Gli παρατηρήθηκε σε μελανώματα και καρκινώματα του προστάτη [14], [15]. Επιπλέον, πολλές εκθέσεις δείχνουν ότι σηματοδότηση Hh συμμετέχει στις μεταστάσεις ωοθηκικού [16], του προστάτη [17], γαστρικό [18], του οισοφάγου [19] και παγκρεατικής [20], [21] καρκινωμάτων. Μαζί, αυτές οι παρατηρήσεις υπονοούν ότι απορυθμισμένη σηματοδότηση Hh συσχετίζεται με τη σοβαρότητα της που σχετίζονται με όγκους και συμβάλλει στην διατήρηση μεταστατική συμπεριφορά. Παρ ‘όλα αυτά, ο ρόλος της σηματοδότησης Hh σε εισβολή και τη μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών παραμένει ασαφής. Επιπλέον, οι μηχανισμοί με τους οποίους σηματοδότηση Hh προάγει εισβολή όγκου και θα πρέπει να διευκρινιστεί περαιτέρω μετάστασης.

Υπάρχουν πολλές ενδείξεις ότι η οδός σηματοδότησης Hh είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων. Για το λόγο αυτό, η αναστολή της σηματοδότησης Hh με νέους θεραπευτικούς παράγοντες έχει επιχειρηθεί σε πολλές ανθρώπινους καρκίνους [22] – [24]. Ο αποκλεισμός του σηματοδότηση Hh με GDC-0449 [24], [25], η κυκλοπαμίνη [24], ΙΡΙ-926 [23], ή Smo shRNA [26] ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την επιβίωση, και κατέστειλε το σχηματισμό όγκων. Ωστόσο, ένας αριθμός των όγκων έχει δειχθεί ότι είναι πυρίμαχα στην άμεση επίδραση της φαρμακολογικής αναστολής Hh με ανταγωνιστές Smo λόγω φυσικών ή επίκτητη μεταλλάξεις σε Smo [27], [28] ή ενίσχυση του καθοδικός τελεστής Gli2 [29]. Οι παρατηρήσεις αυτές υπογραμμίζουν την ανάγκη για τον εντοπισμό των καλύτερων θεραπευτικών στόχων που θα μπλοκάρει αποτελεσματικά το μονοπάτι σηματοδότησης Hh. GANT61 (Gli-ανταγωνιστής 61) αναγνωρίστηκε από μία οθόνη που βασίζεται σε κύτταρα για αναστολείς του Gli μεσολάβηση μεταγραφή [29]. Πρόσφατα, GANT61 έχει αναγνωριστεί ως ένας ισχυρός αναστολέας οδού σηματοδότησης Hh για τη θεραπεία διαφόρων μορφών καρκίνου [22], [24].

Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε GANT61, ένα μικρό αναστολέα μόριο τόσο Gli1 και Gli2 [29 ], για να εντοπίσει το μοναδικό προς τα κάτω τους στόχους των

GLI

γονίδια που λειτουργούν ειδικά στην κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή στον καρκίνο των ωοθηκών. Τα αποτελέσματά μας που λαμβάνονται από ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών SKOV3 κυττάρων, η οποία παρουσιάζει υψηλή διεισδυτική συμπεριφορά [30], υποστηρίζουν την σηματοδότηση Hh προάγει την προσβολή καρκινικών κυττάρων μέσω της ιντεγκρίνης β4 (ITGB4) ενεργοποίηση του κινάσης εστιακής προσκόλλησης (ΡΑΚ) στον καρκίνο των ωοθηκών. Στην πραγματικότητα αυξανόμενες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι ITGB4 παίζει κεντρικό ρόλο στις λειτουργίες που σχετίζονται με την εξέλιξη καρκίνωμα [31] – [33]. Είναι ενδιαφέρον ότι, ΡΑΚ έχει συνδεθεί με οδούς ιντεγκρίνης σηματοδότησης μέσω αλληλεπιδράσεων με ιντεγκρίνη που σχετίζονται πρωτεΐνες όπως παξιλλίνη και Talin [34] – [37] με προκύπτουσα επιδράσεις στην κυτταρική μετανάστευση [37], [38]. Επιπλέον, σε μοντέλα ξενομοσχεύματος ποντικού ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών, η αναστολή του μονοπατιού σηματοδότησης Hh μπορεί να προωθήσει εκτεταμένο κυτταρικό θάνατο και να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι η ελάττωση της στιχομυθία μεταξύ φωσφορυλιωμένη FAK και ITGB4 οφείλεται στην προς τα κάτω ρύθμιση του Gli παράγοντες οικογένειας μεταγραφής μπορεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο για την αναστολή της εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών.

Αποτελέσματα

Down-ρύθμιση της έκφρασης Gli παρεμποδίζει τη μετανάστευση των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων και εισβολή

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι ανώμαλη ενεργοποίηση σηματοδότησης Hh εμπλέκεται σε μία ποικιλία επιθετικών ανθρώπινων καρκινωμάτων [10], [12], [16]. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε πρώτα τις επιπτώσεις των GANT61, ένας ειδικός αναστολέας του Gli1 και Gli2 [29], [39], από την οδό σηματοδότησης Hh μετρώντας την έκφραση των υποδοχέων Hh (Ptch και Smo) και τελεστές (Gli1 και Gli2 ). GANT61 ανέστειλε την έκφραση του παράγοντα μεταγραφής Gli1 και Gli2 (Εικόνες 1Α και Β). Ομοίως, GANT61 ανέστειλε την έκφραση του Ptch, μια προς τα κάτω στόχος του Gli [40]. Επίσης, χρησιμοποιήσαμε την τεχνική ανοσοφθορισμού να εξετασθούν τα αποτελέσματα του GANT61 στην έκφραση του Gli. Ανοσοφθορισμός έδειξε εικόνα GANT61 ανέστειλε την έκφραση του Gli2 (Σχήματα 1 C και D). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι GANT61 μπορεί να αναστείλει την οδό σηματοδότησης Hh

(Α) Έκθεση σε GANT61. (30 μΜ? 48 hr) μειώνει την έκφραση του τόσο Gli1 και πρωτεΐνη Gli2, προσδιορίζεται με κηλίδα Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Έκφραση τόσο Gli1 και Gli2 mRNA μειώνεται μετά από αγωγή με GANT61 (30 μΜ? 48 hr), που προσδιορίζεται με πραγματικού χρόνου PCR. (C, D) GANT61 αναστέλλει την έκφραση Gli2 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. ES2 και SKOV3 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα ελέγχου (DMSO) ή GANT61 (20 μΜ) για 48 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Gli2 και οπτικοποιήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο συνεστιακό. μπαρ κλίμακα, 10 μm. (Ε, F) αποκλεισμός της σηματοδότησης Hh αναστέλλει τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. μονοστοιβάδες κυττάρων Συρρέουσες ES2 τραυματίστηκαν με ένα ρύγχος πιπέτας και κατεργάστηκε έπειτα με Ν-Shh όρους μέσου συν όχημα ελέγχου (0,2% DMSO) ή GANT61. Κυττάρων μετανάστευση προς την περιοχή του τραύματος παρακολουθήθηκε με μικροσκοπία. Το ποσοστό της συνολικής έκτασης καλύπτεται από τα κύτταρα στη συνέχεια αξιολογήθηκε με τη χρήση του προγράμματος Image ΝΙΗ. (G, H) αποκλεισμός της σηματοδότησης Hh αναστέλλει την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. κύτταρα SKOV3 (1 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο. Το μέσο ανάπτυξης που περιέχει Ν-Shh (0,5 μg /ml) μόνο του ή μαζί με GANT61 (20 μΜ), όχημα ελέγχου (0,2% DMSO) προστέθηκαν στον κατώτερο θάλαμο. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα που εισέβαλαν την κάτω επιφάνεια του ενθέματος χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν με μικροσκοπία. Οι αντιπροσωπευτικές εικόνες από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται. μπαρ κλίμακα, 200 μm. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD για τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές. **

P & lt?.

0,01, σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε τα αποτελέσματα της σηματοδότησης Hh για την κινητικότητα των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών χρησιμοποιώντας ένα

στο vitro

επούλωση της πληγής δοκιμασία. Δύο ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών SKOV3 και ES2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με την υπό όρους μέσο που περιέχει Ν-Shh (0,5 μg /ml) και το μέσο ελέγχου. Βρήκαμε ότι η Ν-Shh σημαντικά ενισχυμένη ES2 και μετανάστευση κυττάρων SKOV3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να επιβεβαιωθεί η συνεισφορά των σηματοδότηση Hh στην κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με έναν αναστολέα του μονοπατιού σηματοδότησης Hh. Η πρόσθετη επώαση των Ν-Shh-κατεργασμένα κύτταρα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις GANT61 ανέστρεψε την διεγερτική δράση της Ν-Shh για τη μετανάστευση των κυττάρων σε κύτταρα ES2, έναντι κύτταρα επεξεργασμένα με Ν-Shh συν όχημα ελέγχου (Σχήματα 1 Ε και F), γεγονός που υποδηλώνει ότι GANT61 ανέστειλε την κυτταρική μετανάστευση ES2. Επιπλέον, η επίδραση της σηματοδότηση Hh στην επεμβατική ικανότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μετρήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία εισβολή Matrigel. Η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών να εισβάλουν Matrigel ήταν σημαντικά ενισχυμένη με κατεργασία με Shh (Σχήματα 1 G και Η). Αντιστρόφως, το Shh επαγόμενη διηθητικότητα των κυττάρων SKOV3 μειώθηκε κατά σχεδόν 64% σε κύτταρα τα οποία υποβλήθηκαν επίσης σε αγωγή με GANT61 (Σχήματα 1 G και Η), γεγονός που υποδηλώνει ότι σηματοδότηση Hh έχει ουσιαστικό ρόλο στην κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

αναστολή της σηματοδότησης Hh μεταβάλλει τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του ωοθηκικού καρκινικών κυττάρων

για να ερευνηθεί ο ρόλος του μονοπατιού σηματοδότησης Hh στην έναρξη και την πρόοδο του καρκίνου των ωοθηκών, μετρήσαμε τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε απόκριση προς την αναστολή της Hh σηματοδότηση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών χρησιμοποιώντας μια τεχνική cDNA μικροσυστοιχιών. κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε αγωγή είτε με 20 μΜ GANT61 ή DMSO ως έλεγχος οχήματος για 60 ώρες. Στη συνέχεια, συγκρίναμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του GANT61 κατεργασμένα κύτταρα SKOV3 και DMSO-κατεργασμένα κύτταρα με συστοιχίες Illumina® Sentrix® BeadChip. Η έκφραση του 18401 ανθρωπίνων γονιδίων περίγραμμα σε κύτταρα ελέγχου σε αγωγή με φορέα και σε κύτταρα επεξεργασμένα με GANT61. Γονίδια με ένα

DiffScore

μικρότερη από -20 ή περισσότερες από 20 (δηλ

P

-τιμή & lt? 0,01) θεωρήθηκαν διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων (βαθμούς με) που προκαλείται από GANT61 σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος. Από τους 412 βαθμούς με μοναδική για SKOV3 (20 μΜ GANT61 για 60 hr), 208 γονίδια (50,5%) ήταν τα επάνω ρυθμισμένη και 204 γονίδια (49,5%) ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω (Σχήμα 2Α). Και, το σύνολο σχεδόν των

βαθμούς με

(392/412) παρουσίασαν σημαντική αλλαγή έκφρασης μετά GANT61-θεραπεία (fold αλλαγή & gt? 2.0). Γονίδια με σημαντικές αλλαγές στην έκφραση μετά από θεραπεία GANT61 ταξινομήθηκαν σε διαφορετικές κατηγορίες με βάση καλά τεκμηριωμένες και καθιερωμένες βιολογικές ή παθολογική λειτουργία (Σχήμα 2Β). Αυτές βαθμούς με σε απόκριση σε θεραπεία με GANT61 ανήκουν κυρίως στις εξής κατηγορίες: εστιακή προσκόλληση, σηματοδότηση ΜΑΡΚ, του κυτταρικού κύκλου, σηματοδότηση ρ53, εξωκυτταρική μήτρα (ECM) υποδοχέα αλληλεπίδραση, σηματοδότηση Wnt, σηματοδότηση ErbB, σηματοδότηση υποδοχέα ΤοΙΙ, NOD- όπως σηματοδότηση του υποδοχέα και την αλληλεπίδραση υποδοχέα κυτοκίνης. Οι βαθμούς με λειτουργούν στο εστιακό προσκόλληση σε κύτταρα GANT61 κατεργασμένα παρουσιάζονται σε ένα χάρτη θερμότητας (Σχήμα 2C). Μέσω αυτής χάρτη, βρήκαμε ότι 19 γονίδια ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο, μεταξύ των οποίων επτά up-ρυθμιζόμενα γονίδια και 12 κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SKOV3. Είναι ενδιαφέρον ότι ορισμένες βαθμούς με παρατηρείται στην εστιακή πρόσφυση, όπως LAMC2, ITGA5, LAMA3, ITGB4, COL1A1, THBS1 και COL5A1 βρέθηκαν επίσης μεταξύ των βαθμούς με στην αλληλεπίδραση ECM-υποδοχέα. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι το εστιακό αλληλεπίδραση πρόσφυση και ECM-υποδοχέα cross-talk στα κύτταρα SKOV3 μετά τη θεραπεία με GANT61, και την αλλαγή της έκφρασης των «εστιακών προσκόλλησης»-σχετικών γονιδίων παίζει σημαντικό ρόλο στην αντιμετώπιση GANT61-θεραπεία.

(Α) Αναγνώριση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων (βαθμούς με) σε GANT61-επεξεργασμένα κύτταρα SKOV3. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GANT61 (20 μΜ) ή DMSO για 60 ώρες, και το συνολικό RNA εκχυλίστηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Αλλαγές στην έκφραση γονιδίου προσδιορίστηκαν με προφίλ γονίδιο cDNA μικροσυστοιχιών χρησιμοποιώντας την Illumina Ανθρώπινα HT BeadChip έκφραση V4 (Illumina Inc., San Diego, CA). Οι εκφράσεις διαφορά για τους βαθμούς με εμφανίζονται. (Β) Οι κορυφαίοι 11 κανονικών μονοπατιών σηματοδότησης επηρεάζονται από την αναστολή της λειτουργίας Gli1 /Gli2 σε κύτταρα SKOV3. Οι κορυφαίες 11 κανονικά μονοπάτια σηματοδότησης, που προσδιορίζεται από το ΙΡΑ, που ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα ή προς τα κάτω ρυθμισμένα με κατεργασία GANT61 σε κύτταρα SKOV3, φαίνονται. Τα 412 βαθμούς με χαρτογραφήθηκαν στο ΙΡΑ-καθορισμένου δικτύου. Οι σημαντικές

P

-τιμές που καθορίζουν την πιθανότητα ότι η σχέση μεταξύ των γονιδίων στο σύνολο δεδομένων και την κανονική οδός είναι από τύχη και μόνο υπολογίστηκαν με την ακριβή δοκιμή του Fisher, και εκφράζονται ως -log (

P

-τιμή). (C) Heat χάρτη της βαθμούς με το εστιακό σηματοδοτικό μονοπάτι πρόσφυσης σε GANT61-επεξεργασμένα κύτταρα SKOV3. Ο χάρτης δείχνει ότι θερμότητα 17 γονίδια ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο, μεταξύ των οποίων επτά up-ρυθμιζόμενα γονίδια και 12 γονίδια ρυθμισμένα προς τα κάτω, στην GANT61 αγωγή σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου SKOV3. (D) Επιλεγμένα βαθμούς με από την έκφραση του γονιδίου σειρά cDNA διαμόρφωση της γενικής εικόνας αναλύθηκε με πραγματικού χρόνου PCR. κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ή GANT61 για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, ολικό RNA εκχυλίστηκε για PCR πραγματικού χρόνου, όπως περιγράφεται στις Μεθόδους με τη χρήση των σετ εκκινητή στον Πίνακα 1. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD τριών προσδιορισμών, και GAPDH χρησιμοποιήθηκε για να ομαλοποιήσει τα σχετικά επίπεδα mRNA.

η

για να προσδιοριστεί η ευρωστία του γονιδίου μικροσυστοιχιών cDNA προφίλ έκφρασης μετά από αγωγή των κυττάρων SKOV3 με GANT61, real-time PCR χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό αλλαγές στην έκφραση της επιλεγμένης ομάδας των έξι βαθμούς με προσδιορίζονται από τις μικροσυστοιχίες cDNA. Τα εμπλεκόμενα γονίδια και συντίθενται αρχικά τεμάχια παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Σε πραγματικό χρόνο PCR πραγματοποιήθηκε σε cDNA που δημιουργήθηκε με τη χρήση ολικού RNA που απομονώθηκε από ανεξάρτητα GANT61-επεξεργασμένα κύτταρα SKOV3 για 0 ​​ώρες, 36 ώρες, και 60 ώρες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε για την κανονικοποίηση όλων των δεδομένων PCR πραγματικού χρόνου (Σχήμα 2D). Οι αλλαγές προσδιορίζονται με πραγματικού χρόνου PCR βρέθηκαν να είναι συνεπής με την ανάλυση μικροσυστοιχίας, την επικύρωση έτσι τη σημασία του. Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το μονοπάτι σηματοδότησης Hh μπορεί να παίζει ένα κεντρικό ρόλο στην κινητικότητα και διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών.

Η

ITGB4 μεσολαβεί Shh επαγόμενη μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

Πολυάριθμες μελέτες έχουν δείξει ότι η σηματοδότηση ITGB4-ΡΑΚ θα μπορούσαν να ρυθμίζουν τη μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με το σπάσιμο των φραγμών βασικής μεμβράνης και την προώθηση της κυτταρικής κινητικότητας [41] – [43]. Για να καθοριστεί εάν η Shh που διεγείρεται κυτταρική μετανάστευση και εισβολή προέκυψαν από αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης ITGB4, εξετάσαμε το επίπεδο έκφρασης του ITGB4 χρησιμοποιώντας ανάλυση Western blot και PCR πραγματικού χρόνου. Η έκφραση ITGB4 αυξήθηκε μετά Ν-Shh διέγερση, με τα επίπεδα 3 φορές μεγαλύτερη από ό, τι τα μη επεξεργασμένα κύτταρα που παρατηρήθηκαν μετά από 24 ώρες (Σχήματα 3Α, Β και C). Αντίθετα, η έκφραση ITGB4 ήταν σημαντικά μειωμένη με την παρουσία GANT61 (Εικόνες 3D και Ε). Για να προσδιορίσετε αν κατάργηση της σηματοδότησης ITGB4 θα μπορούσε να εμποδίσει την Shh-διεγείρεται κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή, θα μπλοκαριστεί ITGB4 σηματοδότησης με τη χρήση ενός αντισώματος αποκλεισμού αντι-ITGB4. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3F, τα διεγερτικά αποτελέσματα του Ν-Shh για τη μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή καταργήθηκαν πλήρως από αντι-ITGB4 ανασταλτικό αντίσωμα, αλλά όχι από την κανονική IgG.

(Α, Β) Διέγερση Ν-Shh up-ρυθμίζει την έκφραση ITGB4. κύτταρα SKOV3 επωάστηκαν με την παρουσία ή απουσία Ν-Shh (0,5 μg /ml) για 24 ώρες. Western blots Στη συνέχεια διεξήχθησαν για τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Η έκφραση της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε με Image J και ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH. (C, D) Αναστολή της Gli1 ρυθμίζει προς τα κάτω την έκφραση ITGB4. κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GANT61 ή DMSO για 48 ώρες. κηλίδα Western στη συνέχεια διεξήχθη με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. Η έκφραση της πρωτεΐνης ποσοτικοποιήθηκε με Image J και ομαλοποιήθηκε ως προς GAPDH. (Ε, F) Αποκλεισμός της ITGB4 αναστέλλει τον κυτταρικό εισβολή σε κύτταρα SKOV3. κύτταρα SKOV3 αναπτύχθηκαν σε χαμηλή ορού (2% FBS) μέσο ανάπτυξης σπάρθηκαν εντός των άνω θαλάμους. Η χαμηλή ορού μέσο ανάπτυξης που περιέχει Ν-Shh (0,5 μg /ml) μαζί με αντίσωμα αντι-ITGB4 (0,2 μg /ml) ή IgG μάρτυρας προστέθηκαν στον κάτω θάλαμο. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα που εισέβαλαν την κάτω επιφάνεια του ενθέματος χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν με μικροσκοπία. (G) Gli1 miRNAi αναστέλλει την έκφραση ITGB4 σε κύτταρα SKOV3. κύτταρα SKOV3 επιμολύνθηκαν παροδικά με το φορέα (λιποφεκταμίνη μόνον), ελέγχουν miRNAi και Gli1 miRNAis (MIR-Gli1-720 και miR-Gli1-1863), αντίστοιχα. κηλίδα Western έδειξε ότι Gli1 miRNAi ανέστειλε την έκφραση των γονιδίων ITGB4. έκφραση (H) κατασιγάσει Gli1 εξασθενίζει Shh επαγόμενη εισβολή καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. κύτταρα SKOV3 επιμολύνθηκαν με Gli1 miRNAi ή ελέγχουν miRNAi για 24 ώρες που ακολουθείται από διέγερση με Ν-Shh (0,5 μg /ml) ή μέσο ελέγχου για άλλες 24 ώρες. Κυττάρων εισβολή μετρήθηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. (I, j) Σίγαση ITGB4 έκφραση εξασθενεί Shh που προκαλείται από την εισβολή καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. κύτταρα SKOV3 επιμολύνθηκαν με ITGB4 miRNAi κατασκευάσματα (MIR-ITGB4-2255 και miR-ITGB4-4027) ή ελέγχουν miRNAi για 24 ώρες που ακολουθείται από διέγερση με Ν-Shh (0,5 μg /ml) ή μέσο ελέγχου για άλλες 24 ώρες. κηλίδα Western έδειξε ότι ITGB4 miRNAis ανέστειλε την έκφραση του γονιδίου ITGB4 (Ι). Κυττάρων εισβολή μετρήθηκε όπως περιγράφεται στις Μεθόδους (J). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD για τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές. **

P & lt?.

0,01, σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου

Η

Για να επιβεβαιωθεί ο ρόλος του μεταγραφικού παράγοντα Gli στη διαμεσολάβηση ITGB4 έκφραση, μπορούμε επιμολυσμένα κύτταρα SKOV3 με miRNAi κατασκευές στόχευσης της Gli1 . Η ανάλυση ανοσοστυπώματος στο Σχήμα 3G έδειξε miR-Gli1-720 και miR-Gli1-1863, η οποία μείωσε την έκφραση της Gli1 από 5- και 4 φορές, αντίστοιχα, μειώθηκαν σημαντικά ITGB4 έκφραση υπομονάδας. Στη συνέχεια, θα αξιολογηθούν τα αποτελέσματα της άμεσης αποσιώπηση της έκφρασης Gli1 στη συμπεριφορά των κυττάρων. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Η, μια σημαντική μείωση στην κυτταρική εισβολή παρατηρήθηκε σε Gli1 miRNAi-επεξεργασμένα κύτταρα όπως εκτιμάται από τον προσδιορισμό κυτταρικής εισβολής. Τέλος, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν ITGB4 συμβάλλει στην επεμβατική φαινότυπο διαμεσολαβείται από το σηματοδότησης Hh. Για αυτά τα πειράματα, χρησιμοποιήσαμε πολύ διηθητικού καρκίνου των ωοθηκών SKOV3 κύτταρα [30]. ITGB4 έκφραση κατεστάλη χρησιμοποιώντας ειδικά κατασκευάσματα miRNAi, και η Shh που διεγείρεται κυτταρική εισβολή των κατεργασμένων κυττάρων σε μη στόχευσης (miR-έλεγχος) ή μη κατεργασμένα κύτταρα συγκρίθηκε. Η απώλεια της έκφρασης ITGB4 (Σχήμα 3θ) μείωσε την Shh που διεγείρεται κυτταρική εισβολή των κυττάρων SKOV3 κατά ~ 60% σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα ή μη στόχευσης (MIR-έλεγχος) miRNAi-επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 3J), γεγονός που υποδηλώνει ότι ITGB4 είναι σημαντική για καρκινικών κυττάρων εισβολής.

Shh προωθεί την κινητικότητα και τη διεισδυτικότητα των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μέσω ITGB4 μεσολάβηση ενεργοποίηση της FAK σηματοδότησης

Για την διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν την Shh-διεγείρονται απάντηση ITGB4 στην κυτταρική κινητικότητα και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, αξιολογήσαμε έκφρασης πρωτεΐνης FAK και ενεργοποίηση με ITGB4 για να προσδιοριστεί αν είχαν επηρεαστεί από σηματοδότηση Hh. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, φωσφορυλίωση των FAK (Tyr397) βρέθηκε να ενισχυθεί σημαντικά ως αποτέλεσμα της Ν-Shh διέγερση. Ωστόσο, παρά την παρουσία του Ν-Shh, κατεργασία των κυττάρων με αντίσωμα SKOV3 αποκλεισμού αντι-ITGB4 μειώθηκε σημαντικά φωσφορυλίωση των FAK (Tyr397) (Σχήματα 4Α και Β). Επιπλέον, διεγείροντας τα κύτταρα SKOV3 με αυξανόμενες συγκεντρώσεις Ν-Shh αποκάλυψε ότι η έκφραση του ITGB4 και φωσφορυλίωση FAK (Tyr397) αυξήθηκε με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, η φωσφορυλίωση των FAK (Tyr397) ήταν μειωμένη σε κύτταρα τα οποία είχαν συν-επεξεργάζονται με GANT61 σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα με Ν-Shh συν όχημα ελέγχου (Σχήματα 4C, D και F). Επανα-ανίχνευση με ένα αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι συνολικού FAK δεν αποκάλυψε καμία σημαντική αλλαγή στην πρωτεϊνική και τα επίπεδα του mRNA (Σχήματα 4C, D και Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι οι παρατηρούμενες αυξήσεις στην έκφραση δεν προκύψει ως αποτέλεσμα της αύξησης της ποσότητας του συνολικού FAK πρωτεΐνη, η οποία είναι συνεπής με τα αποτελέσματα που ο αποκλεισμός της σηματοδότησης Hh μείωσε την έκφραση του ITGB4 (Εικόνες 3D και G). Είναι ενδιαφέρον ότι, όταν η οδός σηματοδότησης Hh μπλοκαρίστηκε χρησιμοποιώντας GANT61, μια μειωμένη έκφραση παξιλλίνης, η οποία είναι προς τα κάτω του FAK [44], παρατηρήθηκε (Σχήμα 4C και D). Ομοίως, η αναστολή της σηματοδότησης Hh είχε ως αποτέλεσμα την διατάραξη της οργάνωση του κυτταροσκελετού σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (Εικόνα 4G). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι σηματοδότηση Hh παίζει ένα κρίσιμο ρόλο στην επαγωγή της φωσφορυλίωσης FAK και η κυτταροσκελετική οργάνωση.

(Α, Β) σηματοδότηση Hh ενεργοποιεί FAK μέσω ITGB4. κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με αντίσωμα ITGB4 ή IgG ελέγχου με την παρουσία ή απουσία Ν-Shh (0,5 μg /ml) για 24 ώρες. Έκφραση και φωσφορυλίωση των FAK (Tyr397) ελέγχθηκαν με κηλίδα Western. (Ο-Ε) αποκλεισμός του Gli ρυθμίζει προς τα κάτω τα επίπεδα φωσφορυλίωσης του FAK (Tyr397), αλλά η έκφραση δεν FAK πρωτεΐνης. κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GANT61 ή DMSO για 24 ώρες. Κατόπιν στυπώματος Western πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. N.s, καμία σημασία. (F, G) Καταστολή της έκφρασης Gli μειώνει τη φωσφορυλίωση της FAK (Tyr397) και την οργάνωση του κυτταροσκελετού. κύτταρα SKOV3 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GANT61 για 48 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αντίσωμα έναντι φωσφορυλίωση των FAK (Tyr397) και οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο συνεστιακό (F). Για χρώση F-ακτίνης, τα κύτταρα επωάστηκαν με Alexa Fluor 488 φαλλοϊδίνη (Invitrogen, A12379) για 20 λεπτά και κατέστησαν ορατά χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο συνεστιακό (G). (H) Απώλεια Gli-ΡΑΚ σηματοδότηση Shh εξασθενεί επαγόμενη εισβολή καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. κύτταρα SKOV3 επιμολύνθηκαν με miRNAi έλεγχο ή Gli1 miRNAi (MIR-Gli1-720) για 24 ώρες που ακολουθείται από διέγερση με Ν-Shh (0,5 μg /ml) μαζί με PF573228 (5 μΜ), ένας ειδικός αναστολέας του ΡΑΚ, ή όχημα ελέγχου (DMSO) για άλλες 24 ώρες. Κυττάρων εισβολή μετρήθηκε με δοκιμασία εισβολής όπως περιγράφεται στις Μεθόδους. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD για τα πειράματα εκτελέστηκαν τρεις φορές. **

P & lt?

0,01, σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου. μπαρ κλίμακα, 20 μm.

Η

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω ο ρόλος της ITGB4-ΡΑΚ σηματοδότησης σε Shh διεγείρεται κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή, θα αναστέλλεται επίσης και γκρέμισε FAK στα κύτταρα SKOV3 και αναλύθηκαν για την κυτταρική κινητικότητα και εισβολή. Σημαντικά, πρόσθετη θεραπεία με PF573228, ένας ειδικός αναστολέας του ΡΑΚ [45], αντιστρέφεται εντελώς τα κινητικά και επεμβατικές επιπτώσεις των σηματοδότηση Hh σε κύτταρα SKOV3 (Σχήμα 4Η). Επιπλέον, παροδική έκφραση ΡΑΚ miRNAi μείωσε την ικανότητα του Ν-Shh να διεγείρει τη μετανάστευση και την εισβολή αυτών των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με miRNAi ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Αξίζει να σημειωθεί ότι η μείωση της έκφρασης της FAK με ένα συγκεκριμένο miRNAi κατασκεύασμα που χρησιμοποιείται εδώ δείχθηκε προηγουμένως [46]. Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά αποδεικνύουν ότι σηματοδότηση Hh ρυθμίζει τη μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μέσω ITGB4 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΡΑΚ σηματοδότησης.

Αποκλεισμός σηματοδότηση Hh αναστέλλει την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών

in vivo

Για την εκτίμηση των πιθανών ανασταλτικά αποτελέσματα αύξησης της GANT61

in vivo

, μπορούμε στη συνέχεια εμφυτεύονται κύτταρα SKOV3 SC σε ποντικούς. Η θεραπεία με GANT61 (25 mg /kg, τρεις φορές την εβδομάδα) μείωσε σημαντικά την ανάπτυξη των όγκων συγκριτικά με τον έλεγχο διαλύτη (Σχήμα 5Α). Αυτό αντανακλάται επίσης τελικών βαρών όγκου την ημέρα 15, τα οποία ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην ομάδα που έλαβε αγωγή GANT61 (Σχήμα 5Β). Ερευνήσαμε επίσης εάν Gli θα μπορούσε να είναι κάτω-ρυθμίζονται από αυτή τη θεραπεία. κηλίδος Western αναλύσεις ιστών όγκων αποκάλυψε ότι η θεραπεία με GANT61 πράγματι κάτω ρυθμισμένα Gli1 και Gli2 σε ιστούς (Σχήμα 5C και D). Επιπλέον, η ένταση των δύο ITGB4 και φωσφορυλίωση FAK (Tyr397) ήταν σημαντικά μειωμένη σε τομές όγκων της ομάδας GANT61 σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου διαλύτη (Σχήμα 5Ε και F). Το αποτέλεσμα αυτό υποδεικνύει ότι τα κάτω ρύθμιση Gli μειώνει την έκφραση του ITGB4 και το φωσφορυλιωμένο FAK, με αποτέλεσμα την αναστολή της ανάπτυξης του όγκου

in vivo

.

κύτταρα SKOV3 (2 × 10

7) εμφυτεύθηκαν υποδορίως στο πλευρό του BALB /c ποντίκια ηυ /ηυ. Στη συνέχεια ελήφθησαν οι ποντικοί είτε GANT61 (25 mg /kg υποδορίως, τρεις φορές την εβδομάδα) ή διαλύτη (αραβοσιτέλαιο: αιθανόλη, 4:01). Η θεραπεία ξεκίνησε σε όλες τις ομάδες (n = 8 σε κάθε ομάδα), όταν ο μέσος όγκος του όγκου είχε φθάσει τα 100 mm

3. (Α) Η θεραπεία με GANT61 οδήγησε σε σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των ξενομοσχευμένων ανθρώπινων όγκων καρκίνου των ωοθηκών. n = 8? **

P

& lt? 0,01. (Β) Το πείραμα την ημέρα 15 και οι όγκοι αποκόπηκαν. Τελική βάρη όγκου στην ομάδα αγωγής GANT61 (n = 8) ήταν σημαντικά χαμηλότερα σε σύγκριση με εκτομή όγκων της ομάδας ελέγχου διαλύτη (n = 8). **

P

& lt? 0,01. Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. (C, D) κηλίδα Western αναλύσεις για Gli1 και Gli2 σε ιστούς όγκων. Η θεραπεία με GANT61 μειωμένη έκφραση Gli1 και Gli2. (Ε, F) Ανοσοϊστοχημική εικόνα του τμήματος του ιστού του όγκου. Η θεραπεία με GANT61 μειωμένη έκφραση του ITGB4 (Ε). Μία σημαντική μείωση στην φωσφορυλίωση του ΡΑΚ (Tyr397) επίσης επιτευχθεί αποτελεσματικά με GANT61 θεραπείας (F). μπαρ κλίμακα, 20 μm

Η

Συζήτηση

Αν και έχει τονιστεί ο κρίσιμος ρόλος της σηματοδότησης Hh στην ογκογένεση [47] -. [50], οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους η σηματοδότηση Hh μονοπάτι διαμεσολαβεί μετάσταση δεν είναι καλά κατανοητός. Εδώ, αναφέρουμε ότι το μονοπάτι σηματοδότησης Hh προάγει τη μετανάστευση των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων και εισβολή

in vitro

και

in vivo

. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση του Hh σηματοδότησης που επάγεται μονοπάτι έκφραση ITGB4 και ενεργοποίηση των ΡΑΚ. Τέλος, δείξαμε ότι η διάσπαση του ITGB4-FAK σηματοδότηση οδήγησε σε καταστολή της Hh μεσολάβηση κυτταρική μετανάστευση και εισβολή. Με βάση αυτά τα ευρήματα, προτείνουμε ότι η οδός επάγει σηματοδότηση Hh μεταστατικό λειτουργίες του καρκίνου των ωοθηκών μέσω ITGB4 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της ΡΑΚ.

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι σηματοδότηση Hh παίζει ένα ρόλο στον έλεγχο της κινητικότητας των πολλαπλών τύπους κυττάρων [51] – [53]. Η διακοπή της σηματοδότηση Hh με κυκλοπαμίνη έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει την ΕΜΤ και τη μείωση της μετάστασης σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [20]. Gli υπερέκφραση επαγόμενη λεμφικού μετάσταση, ενώ η αναστολή της σηματοδότησης Hh μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων και την κινητικότητα [19]. Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι η μετανάστευση και εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών επάχθηκαν με Ν-Shh διέγερση και μπλοκάρεται από την κατάργηση σηματοδότηση Hh με GANT61 (Σχήμα 1). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε επίσης ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού σηματοδότησης Hh σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών γονιδιακή μεταγραφή επαγόμενη ITGB4 (Σχήμα 3). Περαιτέρω, ο αποκλεισμός της σηματοδότησης ITGB4 με αντίσωμα ITGB4-blocking καθιστά ωοθηκών καρκινικά κύτταρα δεν ανταποκρίνονται σε Shh διεγείρεται μετανάστευση και εισβολή, υποδηλώνοντας ότι η ITGB4 διαμορφώνει σηματοδότηση Hh σε μετανάστευση των ωοθηκών καρκίνο και εισβολή (Σχήμα 3). Σε συνδυασμό, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η ανώμαλη ενεργοποίηση αυτής της σηματοδότησης μπορεί να συμβάλει στην μετάσταση σε μία ποικιλία καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών, και ότι η αναστολή του μονοπατιού σηματοδότησης Hh μπορεί να είναι χρήσιμη για την πρόληψη της μετάστασης. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η ενίσχυση της γονιδιακής έκφρασης ITGB4 προκλήθηκε με Ν-Shh διέγερση (Σχήμα 3). Ως εκ τούτου, σηματοδότηση Hh πρέπει να αξιολογηθεί περαιτέρω για να προσδιοριστεί εάν επηρεάζει την δραστικότητα του υποκινητή ITGB4 μέσω φυσική αλληλεπίδραση μεταξύ της πρωτεΐνης Gli και μια συγκεκριμένη περιοχή του υποκινητή ITGB4.

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι οι ιντεγκρίνες μπορεί να αλλάξει κυτταρικής συμπεριφοράς μέσω της πρόσληψης και ενεργοποίησης σηματοδότησης πρωτεϊνών όπως κινάσες τυροσίνης μη υποδοχέα, συμπεριλαμβανομένων των FAK και c-Src που σχηματίζουν ένα διπλό σύμπλεγμα κινάση [54]. Το σύμπλοκο FAK-Src συνδέεται με και μπορεί να φωσφορυλιώσει διάφορες πρωτεΐνες προσαρμογέα όπως p130C και παξιλλίνης [55]. Η ενεργοποίηση του FAK και από τα δύο ιντεγκρίνη και παράγοντες ανάπτυξης διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο σε μία ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής επιβίωσης, τον πολλαπλασιασμό, προσκόλληση, μετανάστευση και εισβολή [56] – [58]. Η υπερέκφραση του FAK πρωτεΐνη έχει αναφερθεί σε μεταστατικό ανθρώπινο ορθοκολικό, του μαστού, του προστάτη και του καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα [59] – [62].