Αφηρημένο

λοίμωξη Mycoplasma στον άνθρωπο και τη μόλυνση της σε καλλιέργειες κυττάρων είναι παγκόσμια προβλήματα. Τα φάρμακα που διατίθενται σήμερα για την πρόληψη ή θεραπεία της μόλυνσης από μυκόπλασμα υποφέρουν από χαμηλή ευαισθησία, ισχυρή αντίσταση και υψηλή τοξικότητα. προηγούμενη εργασία μας έδειξε ότι

Mycoplasma hyorhinis

(

Μ

.

hyorhinis

) μόλυνση που προκαλείται από την αλληλεπίδραση μεταξύ Ρ37 του

Μ

.

hyorhinis

και αννεξίνη Α2 (ANXA2) των κυττάρων ξενιστών, ωστόσο η μεταγραφική αξία αυτού του μηχανισμού ήταν άγνωστη. Στο παρόν, έχουμε συνθέσει το Ν-τερματικό του ANXA2 πολυπεπτιδίου (A2PP) και διαπίστωσε ότι A2PP θα μπορούσε να μειώσει τη μόλυνση του

Μ

.

hyorhinis

στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα και μπλοκ

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξη που προκαλείται από τη μετανάστευση των κυττάρων. Επιπλέον, βρήκαμε ότι A2PP θα μπορούσε να μειώσει

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση των κυττάρων πέρασμα. Επιπλέον, σε σύγκριση με τα εμπορικά αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται συνήθως σε κυτταρική καλλιέργεια για την πρόληψη

M

.

hyorhinis

λοίμωξη, A2PP επέδειξε μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα, αλλά χαμηλή τοξικότητα στην ανάπτυξη των κυττάρων. Έτσι, η μελέτη μας για πρώτη φορά αποκαλύφθηκε δυναμικό A2PP για τη θεραπεία και την πρόληψη του

M

.

hyorhinis

λοίμωξη

Παράθεση:. Yuan S, Qu L, Shou C (2016) Ν-τερματικό πολυπεπτίδιο της αννεξίνη Α2 Μειώνει Λοίμωξη του

Mycoplasma hyorhinis

σε καρκινικά κύτταρα του γαστρικού . PLoS ONE 11 (1): e0147776. doi: 10.1371 /journal.pone.0147776

Επιμέλεια: Gernot Zissel, Universitatsklinikum Freiburg, Γερμανία

Ελήφθη: 16 Οκτωβρίου 2015? Δεκτές: 7 Ιανουαρίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 26η Ιανουαρίου 2016

Copyright: © 2016 Yuan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι μέσα στο χαρτί. δεδομένων των μικροσυστοιχιών έχει κατατεθεί στο NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (ένταξη no.GSE73777)

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδοτείται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81572532). https://www.nsfc.gov.cn/publish/portal1/. SCC έλαβαν τη χρηματοδότηση. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν

Εισαγωγή

παθογόνοι μυκοπλάσματα, συμπεριλαμβανομένων Mycoplasma pneumoniae (

Μ

.

pneumoniae

), μυκόπλασμα hyorhinis (

Μ

.

hyorhinis

), από του στόματος μυκόπλασμα (

Μ

.

orale

) και Mycoplasma genitalium (

Μ

.

genitalium

), ανήκουν στην κατηγορία Mollicutes, το οποίο είναι το μικρότερο μικροοργανισμό διαβίωσης στη φύση και μπορεί να αναπαραγάγει ανεξάρτητα [1-2]. Πολλές μελέτες έδειξαν ότι η μόλυνση με αυτά τα μυκοπλάσματα συνδέθηκε με την ανάπτυξη του όγκου [3-8].

Μ

.

orale

προκαλεί χρωμόσωμα ανωμαλία σε ανθρώπινα διπλοειδή κύτταρα και επάγει κυτταρικό μετασχηματισμό [6]. Η μόλυνση με το

Μ

.

hyorhinis

ή

Μ

.

genitalium

μπορούσε να αυξήσει την μετανάστευση και την διεισδυτικότητα του προστάτη επιθηλιακών κυττάρων [3].

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση έχει συνδεθεί με αρθρίτιδα, ορογονίτιδα, στειρότητα και καρκίνο του ανθρώπινου [9-12].

Επιπλέον, μόλυνση μυκοπλάσματος σε καλλιέργεια κυττάρων είναι ένα σοβαρό πρόβλημα και ο ρυθμός των κυττάρων διόδου μολυνθεί από μυκόπλασμα είναι υψηλή. Κυτταρική καλλιέργεια χρησιμοποιείται ευρέως στις επιστήμες της ζωής, όπως στην βασική έρευνα, κλινική δοκιμή έρευνα, την ανάπτυξη και την παραγωγή των βιολογικών προϊόντων, καθώς και στον τομέα της βιοφαρμακευτικής και του εμβολίου της παραγωγής. Πρόληψη των κυττάρων από μικροβιακή μόλυνση είναι κρίσιμης σημασίας για τη διασφάλιση της ποιότητας της έρευνας. Η μόλυνση μυκοπλάσματος είναι το πιο κοινό πρόβλημα σε κυτταρική καλλιέργεια με επίπτωση 30% -60% [1]. Αποδείχθηκε ότι τέσσερα είδη μυκοπλασμάτων αντιπροσωπεύουν περισσότερο από το 95% της μόλυνσης σε καλλιέργεια κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των

Μ

.

orale

, αργινίνη μυκόπλασμα (

Μ

.

arginini

),

Μ

.

hyorhinis

, και του Levin δεν Acholeplasma (

Μια

.

laidlawii

) [13,14,15,16]. Λόγω του μικρού μεγέθους, το μυκόπλασμα είναι δύσκολα να βρεθούν κάτω από το φως του μικροσκοπίου και είναι εύκολα αγνοούνται από τους ερευνητές. Τα τελευταία χρόνια, πολλές αντιβιοτικά που χρησιμοποιούνται για τη θεραπεία του μυκοπλάσματος επανειλημμένα είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση της ανθεκτικότητας μυκοπλάσματος. Για τους λόγους αυτούς, είναι επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη νέων μέσων για την πρόληψη ή τη μείωση λοίμωξη από μυκόπλασμα.

προηγούμενη εργασία μας έδειξε ότι

Μ

.

hyorhinis

μόλυνσης εξαρτάται από την αλληλεπίδραση της ρ37 (κύρια πρωτεΐνη της μεμβράνης του

Μ

.

hyorhinis

) και ANXA2 υποδοχής μέσω Ν-τελικές περιοχές τους. Βρήκαμε επίσης πολύκλωνο αντίσωμα να P37 θα μπορούσαν να εμποδίσουν τη μόλυνση του

Μ

.

hyorhinis

και ελάττωση

Μ

.

hyorhinis

-promoted μετανάστευση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων [17]. Με βάση αυτές τις ανακαλύψεις, θέσαμε μια υπόθεση ότι το πεπτίδιο, που συντίθεται σύμφωνα με την αλληλουχία αμινοξέων της ANXA2 Ν-τερματικής περιοχής (από 1

st έως 30

ου αα, εδώ ονομάσαμε αυτό το πεπτίδιο ως A2PP), θα μπορούσε να μπλοκάρει

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξης μέσω του ανταγωνισμού του με ANXA2 και, ενδεχομένως, να χρησιμοποιηθεί ως φάρμακο για την πρόληψη της

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξης σε καλλιέργεια κυττάρων. Σε αυτή τη μελέτη, θα δοκιμαστεί αυτή η υπόθεση και να συγκριθούν επίσης τις επιπτώσεις της A2PP με άλλα φάρμακα για την πρόληψη

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξη.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

AGS γαστρικού καρκίνου κυτταρική γραμμή ήταν από την American Type Culture Collection (ATCC). BGC823 γαστρικού καρκίνου κυτταρική σειρά ιδρύθηκε από το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Λαϊκό Νοσοκομείο και αγοράστηκε από την Cell Πολιτιστικό Κέντρο της Κινεζικής Ακαδημίας Ιατρικών Επιστημών (Πεκίνο, Κίνα). AGS και BGC823 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο 10% βόειο εμβρυϊκό ορό που ελήφθη από την Invitrogen (Carlssbab, CA, USA). δοκιμή Mycoplasma υλοποιήθηκε πριν από κάθε νέο πείραμα με PCR ενίσχυση του

Μ

.

hyorhinis P37

.

Mycoplasma Διάδοση και συν-Πολιτισμού

διάδοσης Mycoplasma και συν-καλλιέργεια διεξήχθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [17,18,19].

αντισώματα και Αντιδραστήρια

Anti-P37 μονοκλωνικό αντίσωμα PD4 δημιουργήθηκε και χαρακτηρίστηκε στο παρελθόν [5,20,21]. Πολυκλωνικό αντίσωμα αντι-P37 ελήφθη από την ανοσοποίηση κουνελιού με πρωτεΐνη σύντηξης GST-P37 μετά την πρότυπο πρωτόκολλο. Αντι-EGFR και αντι-φωσφο-EGFR αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (ΚΣΑ, USA). Anti-ANXA2 ήταν από Novus Βιοτεχνολογίας (Novus Βιοτεχνολογία, USA). Αντι-φωσφο-ANXA2 ήταν από την Santa Cruz (Santa Cruz, CA, USA). A2PP (1

ου σε 30

ου αα) και διάφορα περικομμένο πεπτίδια A2PP, συμπεριλαμβανομένων A2PP-Nd4 (5

ου σε 30

ου αα), A2PP-Nd8 (9

ου να 30

ου αα), A2PP-Nd12 (13

ου και 30

ου αα), A2PP-Nd16 (17

ου σε 30

ου αα), A2PP-CD4 (1

ου έως 26

ου αα), A2PP-CD8 (1

ου σε 22

ου αα), A2PP-CD12 (1

ου σε 18

ου αα), A2PP- CD16 (1

ου σε 14

ου αα), μαζί με τυχαία πεπτίδια ελέγχου (coNP) συντέθηκαν από Sbsbio (Πεκίνο, Κίνα). Αντιμικροβιακά μυκόπλασμα Ι (MYCO Ι) και του μυκοπλάσματος II (MYCO II) αγοράστηκαν από την M & amp? C GENE ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ (Πεκίνο, Κίνα). Η σιπροφλοξασίνη (CIP) ήταν από Double-Crane Pharm (Πεκίνο, Κίνα).

Ανίχνευση

Μ

.

hyorhinis από

Ποσοτική PCR (qPCR)

Το DNA που εξάγεται από AGS ή BGC823 κυττάρων μετά από

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση από ρυθμιστικό λύσης DNA (50 mM Tris ρΗ 8,5, 1 mM EDTA, 0,5% Tween-20, και 200 ​​mg /L πρωτεϊνάση Κ) σύμφωνα με το πρότυπο πρωτόκολλο. qPCR διεξήχθη με 30 ng DNA και SYBR Green PCR πραγματικού χρόνου 2 × κιτ προμίγματος (Takara, Otsu, Ιαπωνία) με τη χρήση Βήμα πρώτο σύστημα από την ΑΒΙ (Foster City, CA, USA). Τα προγράμματα αντίδρασης και

P37

-ειδικών εκκινητών (εμπρός: 5′-TATCTCATTGACCTTGACTAAC-3 ‘αντίστροφη: 5′-ATTTTCGCCAATAGCATTTG-3’) έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [22]. Για να συγκρίνετε

Μ

.

hyorhinis

επίπεδα DNA σε κύτταρα,

GAPDH

(εμπρός: 5′-TGAAGGTCGGAGTCAACGG-3 ‘, αντίστροφη: 5′-CCTGGAAGATGGTGATGGG-3’), ενισχύθηκε ο έλεγχος και τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο. Οι εκκινητές συντέθηκαν με Sangon (Σαγκάη, Κίνα).

Western Blotting

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν από τρυβλίο καλλιέργειας με 2 × SDS ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης. ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και κηλίδωση Western έγιναν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23].

Κυττάρων ELISA

96 φρεατίων εμβολιάστηκαν με κύτταρα (1 χ 10

4 /καλά), ακολουθούμενη από επεξεργασία του υποδεικνύεται πεπτιδίων και μόλυνση του

M

.

hyorhinis

για 24 ώρες. Τα κύτταρα ακινητοποιήθηκαν με 0,05% γλουταραλδεΰδη για 10 λεπτά, στη συνέχεια στο κύτταρο ELISA εκτελέστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

Solid-Phase Δοκιμασία Σύνδεσης και pull-down Δοκιμασία

Η ανασυνδυασμένη GST-P37 και πρωτεΐνες GST παράχθηκαν και καθαρίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. GST-P37 και GST αραιώθηκαν σε ρυθμιστικό (0,1 Μ

2CO

3, 0.1Μ NaHCO

3, PH 9,6) και επικαλύπτεται σε πλάκες 96-πηγαδιών σε 4 ° C όλη τη νύκτα. Οι πλάκες πλύθηκαν με PBS τρεις φορές και μπλοκάρεται από 5% αποβουτυρωμένο γάλα /PBS σε θερμοκρασία δωματίου (RT) για 2 ώρες. Μετά την πλύση με PBS, αναφερόμενες συγκεντρώσεις βιοτίνης-συζευγμένο A2PP (συντίθεται με Sbsbio) προστέθηκε και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Μετά από πλύση με PBST 3 φορές, στρεπταβιδίνη συζευγμένη με HRP (Baltimore Pike, West Grove, ΡΑ, USA) προστέθηκε και επωάστηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Μετά την ανάπτυξη χρώματος με ορθο-φαινυλενοδιαμίνη (Sigma), η οπτική πυκνότητα στα 490 nm (OD490) καταγράφηκε με έναν αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad 550). Για δοκιμασία pull-down, 100 ng GST-P37 ή GST πρωτεΐνη συν-επωάστηκαν με 20 μΜ βιοτίνης-A2PP και στρεπταβιδίνη σφαιρίδια (GE Healthcare, Pittsburgh, ΡΑ, USA) σε ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης (50 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% ΝΡ-40, 0,5 mM DTT, 1 mM PMSF, και 1 χ πλήρης αναστολείς πρωτεάσης) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα ιζήματα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης για τέσσερις φορές και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

συνανοσοκαθίζησης

M

.

hyorhinis

μολυσμένα κύτταρα (BGC823 ή AGS) ομογενοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (50 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton Χ-100, 0.5 mM DTT, 1 mM PMSF, και 1 × πλήρης αναστολείς πρωτεάσης) στους 4 ° C για 10 λεπτά. Μετά από 12, 000 g φυγοκέντρηση για 10 λεπτά στους 4 ° C, τα υπερκείμενα ανακτήθηκαν. προϊόντα λύσης πρωτεΐνης (500 μg) επωάστηκαν με 20 μΜ A2PP ή coNP, 1 μ§ σφαιρίδια αντι-ANXA2 συν πρωτεΐνης G-Sepharose (GE Healthcare) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Προ-άνοση IgG (1 μg) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Οι καταβυθισθέντες σφαιρίδια πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης για τέσσερις φορές, που εκλούεται σε 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης, βραστά, και αναλύθηκαν με κηλίδωση Western.

ανοσοφθορισμού Δοκιμασία

Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε καλυπτρίδες και καλλιεργήθηκαν όλη τη νύκτα. Την επόμενη ημέρα, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνύεται πεπτίδια και μολύνθηκαν με

M

.

hyorhinis

για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με παγωμένο PBS τρεις φορές, σταθεροποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη για 15 λεπτά σε RT. Μετά τον αποκλεισμό για 1 ώρα σε 5% BSA /PBS, τα κύτταρα επωάστηκαν με αντισώματα υποδεικνύονται σε RT για 1 ώρα. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν 3 φορές και πάλι με PBST και επωάστηκαν με FITC ή TRITC-επισημασμένο δευτερογενή αντισώματα για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση με PBS και αντικηλίδωση με ϋΑΡΙ, τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 50% γλυκερόλη /PBS. Ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο ZEISS LSM780 (ZEISS Microsystems, Oberkochen, Γερμανία) χρησιμοποιήθηκε για να παρατηρήσει τον εντοπισμό των υποδεικνύεται πρωτεϊνών.

Κυττάρου Μετανάστευση Δοκιμασία

Transwell θάλαμο με 8.0 μm μεμβράνες πόρων (Corning, Νέα Υόρκη, USA) χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων. Το κάτω μέρος του θαλάμου γέμισε με 800 μι μέσου που περιείχε 10% FBS ως χημειοπροσελκυστικό. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε μέσο άνευ ορού που περιέχει

M

.

hyorhinis

συν A2PP ή coNP, στη συνέχεια, μεταφέρθηκαν προσεκτικά πάνω στην κορυφή του θαλάμου της κάθε συσκευής Transwell σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /mL (120 μλ /θάλαμο). Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 24 ώρες στους 37 ° C. Η άνω επιφάνεια της κάθε μεμβράνης απαλλάχθηκε των κυττάρων με μια μπατονέτα. Κύτταρα διεισδύσει στην κάτω πλευρά της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν σε κρύα μεθανόλη, βάφτηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες και μετρήθηκαν σε εννέα τυχαία επιλεγμένα μικροσκοπικά πεδία ανά φρεάτιο. Κάθε δείγμα παρασκευάστηκε σε θαλάμους τριπλούν και κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές.

Δοκιμασία Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού

Γαστρικό καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5 × 10

3/100 μl /φρεάτιο εις τριπλούν, και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνυόμενη αντιδραστηρίων. Πολλαπλασιασμό των κυττάρων ποσοτικά από το κύτταρο συμβολή με CloneSelect Imager (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Microarray Analysis και Real-Time RT-PCR

AGS και BGC823 κύτταρα ( 1 × 10

6 ανά 10 εκατοστά

2 πλάκα) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με A2PP, CIP, MYCO Ι και ΙΙ MYCO για 24 ώρες, πλύθηκαν με PBS, και συλλέγονται σε αντιδραστήριο ΤπζοΙ. RNA δείγματα εξετάστηκαν σε Ο.Ε. Βιοτεχνολογίας (Σαγκάη, Κίνα) χρησιμοποιώντας Affymetrix GeneChip

® PrimeView

™ Ανθρωπίνων Γονιδιακής Έκφρασης Array. δεδομένων των μικροσυστοιχιών έχει κατατεθεί στο NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (ένταξη no.GSE73777). Ανεπεξέργαστα δεδομένα καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας Affymetrix GeneChip Command Console (έκδοση 4.0, Affymetrix). Στη συνέχεια, το λογισμικό Genespring (έκδοση 12.5, Agilent Technologies) χρησιμοποιήθηκε για να τελειώσει τη βασική ανάλυση με τα ανεπεξέργαστα δεδομένα. Κατ ‘αρχάς, το ακατέργαστο δεδομένα ομαλοποιήθηκε με τον αλγόριθμο RMA. Διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια στη συνέχεια προσδιορίζονται μέσω φορές μεταβολής. Το κατώτατο όριο για την πάνω και κάτω-ρυθμιζόμενα γονίδια ήταν μια φορές αλλαγή ≥ 2.0. Στη συνέχεια, πάει και η ανάλυση KEGG εφαρμόστηκαν για να επιλέξετε από τα γονίδια που σχετίζονται με την κυτταρική απόπτωση του κυτταρικού κύκλου και. Real-time RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την επικύρωση των αποτελεσμάτων των μικροσυστοιχιών και εκτελείται σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών (SYBR, ΤΟΥΟΒΟ). Τα επίπεδα έκφρασης των συνδεδεμένων γονιδίων ομαλοποιήθηκαν μέσω

GAPDH

και το 2

-ΔΔCT χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό σχετική έκφραση γονιδίου. Οι εκκινητές για πραγματικού χρόνου RT-PCR (

ATF

, προς τα εμπρός, 5′-GAGTGGCGACAGGATAGAGC-3 ‘, αντίστροφη, 5′-TTTAGCCTCCCTCCCTTAGC-3’?

DDIT3

, προς τα εμπρός, 5 ‘ -GCGCATGAAGGAGAAAGAAC-3 ‘, αντίστροφη, 5′-ACCATTCGGTCAATCAGAGC-3’?

CEBPB

, προς τα εμπρός, 5′-AGCGACGAGTACAAGATCCG-3 ‘, αντίστροφη, 5′-AGCTGCTCCACCTTCTTCTG-3’) συνετέθησαν από Sangon

Στατιστική Ανάλυση

τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD. Οι διαφορές αναλύθηκαν με ANOVA χρησιμοποιώντας SPSS 11.0 λογισμικού και P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

μικροσυστοιχιών Αριθμός προσχώρησης

δεδομένα μικροσυστοιχιών έχει κατατεθεί στο NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) (ένταξη όχι. GSE73777).

Αποτελέσματα

A2PP δεν έχει καμία επίδραση στη βιωσιμότητα ή τη μετανάστευση των καρκινικά κύτταρα του γαστρικού

για να αξιολογηθεί ο ρόλος της Ν-τελικής περιοχής ANXA2 στο

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξη, μπορούμε κατ ‘αρχάς συντίθεται A2PP πεπτίδιο που αντιστοιχεί σε Ν-τερματικό του ANXA2 (Σχήμα 1Α). Βιοτίνη σημασμένο A2PP δείχθηκε να αλληλεπιδρούν ειδικά με ΟδΤ-P37 στην δοκιμασία στερεάς δέσμευσης φάσης (Σχήμα 1Β) και pull-down δοκιμασίας (Σχήμα 1 C). Παρατηρήσαμε ότι A2PP δεν επηρέασε την μορφολογία του AGS και BGC823 κύτταρα (Σχ 1D). Επιπλέον, σε συγκεντρώσεις μικρότερες από 20 μΜ, A2PP δεν αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 1 Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι A2PP έχει ελάχιστη τοξικότητα στα κύτταρα. EGFR έχει εμπλακεί στη ρύθμιση της φωσφορυλίωσης ANXA2 [17,25,26], ενώ A2PP δεν είχε αποτελέσματα επί των φωσφορυλιώσεις ή επίπεδα πρωτεΐνης EGFR και ANXA2 [Σχ 2Α]. Επιπλέον, A2PP δεν είχε επιπτώσεις στη μετανάστευση των ΕΕΑ και BGC823 κύτταρα (Σχήμα 2Β και 2Γ). Κυτταρική εντόπιση της ANXA2 ρυθμίζεται από φωσφορυλίωση της, η οποία είναι κρίσιμη για τη λειτουργία του [17,27,28]. Βρήκαμε A2PP δεν άλλαξε την υποκυτταρική εντόπιση του ενδογενούς ANXA2 (Σχήμα 2D). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι A2PP μόνο έχει καμία επίδραση σε κακοήθη φαινότυπο ή EGFR-ANXA2 σηματοδότηση του γαστρικού καρκίνου κυττάρων.

(Α) Σχηματικό διάγραμμα αλληλουχίας αμινοξέων του Ν-τελικού του πολυπεπτιδίου ANXA2 (A2PP). (Β) δοκιμασία σύνδεσης στερεής φάσης. OD490 των 15 nM βιοτίνη A2PP σε GST ορίστηκε η 1η και η σχετική δέστρες ήταν υπολογιζόμενου. Η μέση ± SD τριών ανεξαρτήτων προσδιορισμών με δείγματα εις τριπλούν. *** P & lt? 0.001. (Γ) Στρεπταβιδίνη αναλύσεις καθέλκυσης προσδιορίζονται Βιοτίνη-A2PP ως δεσμευτική GST-P37 πολυπεπτίδιο. (D) Cell μορφολογία του AGS και BGC823 εξής υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις της θεραπείας A2PP για 24 ώρες και 48 ώρες. (Ε) Πολλαπλασιασμός κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου (AGS και BGC823) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με αυξανόμενη συγκέντρωση A2PP για 72 ώρες. Η μέση ± SD από τρία πειράματα με δείγματα εις τριπλούν.

Η

(Α) Western στύπωμα της φωσφο-EGFR, φωσφο-ANXA2, EGFR, και ANXA2 από AGS και BGC823 κύτταρα επεξεργασμένα με A2PP για 24 ώρες. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Αντιπροσωπευτικές εικόνες της μετανάστευσης των κυττάρων και AGS BGC823 κατεργάζεται με A2PP για 24 ώρες. Ράβδοι κλίμακας, 200 μm. (C) Στατιστική περίληψη της δοκιμασίας μετανάστευσης. Η μέση ± SD από τρία πειράματα με δείγματα εις τριπλούν. ns, καμία σημασία. (D) ανοσοφθορισμού ANXA2 εντοπισμού (κόκκινο) σε AGS και BGC823 κύτταρα επεξεργασμένα με A2PP για 24 ώρες. Κλίμακα μπαρ, 5 μm.

Η

A2PP Μειώσεις

Μ

.

hyorhinis

Λοίμωξη

προηγούμενη εργασία μας έχει δείξει ότι η Ν-τερματικό μεσολαβεί ANXA2

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση [17]. Όπως φαίνεται από το αποτέλεσμα της δοκιμασίας ELISA κυττάρων, βρήκαμε ότι

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση έχει αποκλειστεί από A2PP με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα BGC823 και AGS, αλλά coNP-επεξεργασμένα κύτταρα εξακολουθούν να είναι εξαιρετικά μολυνθεί από

M

.

hyorhinis

(Σχήμα 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίχθηκαν με δοκιμασίες qPCR (Σχήμα 3Β). Σταθερά, A2PP μειώθηκε επίσης τα επίπεδα πρωτεΐνης ρ37 πρωτεΐνης στην κηλίδωση Western ανάλυση (Σχ 3C και 3D). Εν τω μεταξύ, τα επίπεδα του phophos-AXNA2 και phophos-EGFR στα μολυσμένα κύτταρα κάτω ρυθμισμένα με κατεργασία με A2PP (Σχ 3C και 3Ε), ενώ συνολικά επίπεδα AXNA2 και EGFR ήταν σχετικά σταθερές (Εικ 3C). Στην ανάλυση ανοσοφθορισμού, A2PP βρέθηκε να αναστέλλει

M

.

hyorhinis

λοίμωξη που προκαλείται από τη συσσώρευση P37 και συν-εντοπισμός μεταξύ P37 και ANXA2 (Σχήμα 4Α). Στην δοκιμασία συν-ανοσοκατακρήμνισης με προϊόντα λύσης πρωτείνης από

M

.

hyorhinis

μολυσμένα κύτταρα, A2PP μείωσε την αλληλεπίδραση μεταξύ P37 και ANXA2 (Σχήμα 4Β). Μαζί, αυτές οι αποδείξεις υποστηρίζουν την ιδέα ότι θα μπορούσε να μειώσει A2PP

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση και επιβεβαίωσε την προηγούμενη ανακάλυψη μας ότι απαιτείται η Ν-τερματικό της ANXA2 για τη διαμεσολάβηση

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση [17].

Κυττάρου ανάλυση ELISA της P37 (OD 490 nm) της πρωτεΐνης P37 στο AGS και BGC823 κύτταρα μολυσμένα με 10

5 CCU (αλλάζοντας μονάδες χρώμα) /ml του

Μ

.

hyorhinis

και κατεργάζεται με A2PP ή coNP για 24 ώρες.

Μ

.

hy

,

Μ

.

hyorhinis

. Η μέση ± SD από 3 πειράματα με εις τριπλούν για κάθε δείγμα. (Β) Ποσοτική PCR (qPCR) ανάλυση του

P37

σε AGS και BGC823 κύτταρα που έχουν μολυνθεί και κατεργάστηκε όπως στο (Α). Η μέση ± SD από 3 πειράματα με εις τριπλούν για κάθε δείγμα. (Γ) Western στύπωμα της P37, ρ-EGFR, EGFR, ρ-ANXA2 και ANXA2 από AGS και BGC823 κύτταρα που κατεργάζονται όπως στο (Α). (Δ) Ποσοτικοποίηση των επιπέδων της πρωτεΐνης ρ37 του στο (C). Επίπεδα P37 κανονικοποιήθηκαν με εκείνα του GAPDH. Η μέση ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. (Ε) Ποσοτικοποίηση των ρ-EGFR και τα επίπεδα ρ-ANXA2 στο (C). Επίπεδα ρ-EGFR ή ρ-ANXA2 κανονικοποιήθηκαν με εκείνα του EGFR ή ANXA2. Η μέση ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. ** P & lt? 0,01? ** P & lt? 0.001? ns, καμία σημασία.

Η

(Α) Τοπικές προσαρμογές του ANXA2 (κόκκινο) και Ρ37 (πράσινο) σε BGC823 και AGS κύτταρα μολυσμένα με 10

5 CCU /ml του

M

.

hyorhinis

και κατεργάζεται με A2PP ή coNP για 24 ώρες. Κοινός εντοπισμός δείχθηκε από συγχωνευθείσα σήματα (κίτρινο). Ράβδοι κλίμακας, 5 μm. (Β) δοκιμασία συνανοσοκαθίζησης για την επικύρωση της αλληλεπίδρασης ANXA2-P37 στην BGC823 και AGS κύτταρα μολυσμένα με

Μ

.

hyorhinis

και αντιμετωπίζονται με A2PP ή coNP για 24 ώρες.

Η

A2PP Καταστέλλει

Μ

.

hyorhinis

Επαγόμενου Μετανάστευση

προηγούμενες μελέτες μας πρότειναν ότι

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση θα μπορούσε να προωθήσει τη μετανάστευση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων [17, 23]. Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι

Μ

.

hyorhinis

-promoted μετανάστευση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων δεν επηρεάστηκε από coNP, αλλά ήταν δοσοεξαρτώμενο αναστέλλεται από A2PP (Σχήμα 5Α και 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι A2PP ανέστειλε

Μ

.

hyorhinis

επαγόμενη μετανάστευση, η οποία συνδέεται με την ικανότητά του να μειώσει τη μόλυνση-προωθείται φωσφορυλιώσεις των EGFR και ANXA2 (Σχήμα 3C και 3Ε).

(Α) Μετανάστευση 10

5 CCU /ml του

Μ

.

hyorhinis

μολυνθέντα AGS και BGC823 κύτταρα επεξεργασμένα με υποδεικνύεται πεπτίδια για 24 ώρες. (Β) Περίληψη των δοκιμασιών μετανάστευσης (n = 3). Η μέση ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα με δείγματα εις τριπλούν. *** P & lt?. 0.001

Η

A2PP Έχει Αιθέρια Motif για Μείωση

Μ

.

hyorhinis

Λοίμωξη

Για να χαρακτηρίζουν την κρίσιμη μοτίβο της A2PP, επιδιώξαμε να διαπιστωθεί αν διαφορετικές ακρωτηριασμένη πεπτίδια A2PP (Σχήμα 6Α) θα μπορούσε να μειώνει

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξη. Στην ανάλυση qPCR, A2PP και ακρωτηριασμένη πεπτίδια A2PP-Nd4, Nd8, Nd12, CD4, CD8, CD12 και μείωσε

Μ

.

hyorhinis

μόλυνσης σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα, αλλά A2PP-Nd16 και A2PP-CD16 απέτυχαν να μειώσουν

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση (Σχήμα 6Β). Παρόμοιο μοτίβο της αναστολής ελήφθη από δοκιμασία Western κηλίδωση (Σχήμα 6C). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν την ύπαρξη ενός συγκεκριμένου μοτίβου της A2PP είναι απαραίτητη για την ικανότητά του να μειώσει

M

.

hyorhinis

λοίμωξη. Για να χαρτογραφήσει περαιτέρω τις αλληλουχίες πυρήνα αυτού του δυναμικού μοτίβου, συνθέσαμε τα δύο πεπτίδια που αντιστοιχούν σε 11

ου -20

ου αα (όπως ονομάζεται A2PP-10αα) και 13

ου -18

ου αα (όπως ονομάζεται A2PP-6aa) (Εικ 7Α). Σε δοκιμασία qPCR, τα δύο πεπτίδια θα μπορούσε να μειώσει

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση (Σχήμα 7Β), η οποία υποστηρίχθηκε από τη Δυτική δοκιμασία κηλίδωσης (Σχήμα 7C). Αξίζει να σημειωθεί ότι, τα ανασταλτικά αποτελέσματα του A2PP-10αα ήταν καλύτερες από εκείνες των A2PP-6aa, αλλά τα αποτελέσματα των δύο πεπτίδια ήταν λιγότερο ισχυρή με εκείνες του A2PP (Σχ 7Β και 7C). Thesefore, οι κεντρικές σειρές (11

ου -20

ου) των A2PP θα μπορούσε να είναι το βασικό μοτίβο για την αναστολή

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξη.

(Α) Σχηματικό διάγραμμα του κόλουρου πεπτίδια A2PP. (Β) qPCR ανάλυση των

P37

στο AGS και BGC823 κύτταρα μολυσμένα με 10

5 CCU /ml του

Μ

.

hyorhinis

και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 μΜ υποδεικνύεται πεπτίδια για 24 ώρες. Η μέση ± SD από 3 πειράματα με εις τριπλούν για κάθε δείγμα. (Γ) Western στύπωμα της ρ37 από AGS και BGC823 κύτταρα που έχουν μολυνθεί και κατεργάστηκε όπως στο (Β). Η μέση ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Σχηματικό διάγραμμα των δύο ακρωτηριασμένες μορφές της A2PP. (Β) qPCR ανάλυση των

P37

στο AGS και BGC823 κύτταρα μολυσμένα με 10

5 CCU /ml του

Μ

.

hyorhinis

και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 μΜ υποδεικνύεται πεπτίδια για 24 ώρες. Η μέση ± SD από 3 πειράματα με εις τριπλούν για κάθε δείγμα. (Γ) Western στύπωμα της ρ37 από AGS και BGC823 κύτταρα που έχουν μολυνθεί και κατεργάστηκε όπως στο (Β). Η μέση ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. *, P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001.

Η

Σύγκριση A2PP με άλλα φάρμακα για την πρόληψη

Μ

.

hyorhinis

Λοίμωξη

Μ

.

hyorhinis

ήταν μία από τις κύριες πηγές ρύπανσης της καλλιέργειας κυττάρων [13,14,15]. Ο καλύτερος τρόπος για να εξαλειφθεί

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξη είναι να απορρίψει κύτταρα και γρήγορα αποστείρωση όλες τις επικοινώνησε σκάφη, αλλά μερικά μολυσμένα κύτταρα δεν μπορούν να αντικατασταθούν σε αρκετές περιπτώσεις. Κατά συνέπεια, είναι επιτακτική ανάγκη να χρησιμοποιήσει ειδικό αντιμικροβιακό προσεγγίσεις για την πρόληψη ή την εξάλειψη

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξη. Υπήρξαν διάφορες αντιμικροβιακές ουσίες για την πρόληψη

Μ

.

hyorhinis

από τη μόλυνση. Για παράδειγμα, σιπροφλοξασίνη (CIP) θα μπορούσε να εξαλειφθεί

Μ

.

hyorhinis

σε κατάλληλη συγκέντρωση [29]. Δύο αντιμικροβιακές συστατικά όπως ονομάζεται μυκόπλασμα Ι (MYCO Ι) και του μυκοπλάσματος II (MYCO II) θα μπορούσε να μειώσει

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξης από το κλείδωμα της πρωτεΐνης και σύνθεση νουκλεϊκών οξέων. Ωστόσο, ορισμένα προβλήματα, όπως η χαμηλή ευαισθησία, ισχυρή αντίσταση και υψηλή τοξικότητα μπορεί να περιορίσει τις εφαρμογές τους σε κυτταρική καλλιέργεια. Με βάση αυτές τις εκτιμήσεις, πιστεύουμε ότι είναι απαραίτητο να συγκριθούν οι αποδόσεις των A2PP, CIP, MYCO Ι και ΙΙ MYCO στην πρόληψη

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξη. Με Western και αναλύσεις qPCR, διαπιστώσαμε ότι ανασταλτική επίδραση A2PP για

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση ήταν παρόμοια με εκείνη του MYCO Ι, αλλά ήταν καλύτερες από εκείνες του CIP και MYCO II (Εικ 8Α ​​και 8Β). Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε ότι A2PP θα μπορούσε επίσης να εξαλείψει αποτελεσματικά το

Μ

.

hyorhinis

μόλυνσης σε μεγάλο βαθμό μολυσμένα κύτταρα κατά τη διαδικασία των αποσπασμάτων από Ρ

1 προς Ρ

3 (Εικόνα 8C και 8D). Επιπλέον, σε σύγκριση με MYCO Ι και II MYCO, A2PP είχαν λιγότερο ανασταλτική επίδραση στα κύτταρα πολλαπλασιασμού (Σχήμα 9Α). Να διερευνήσει τους μηχανισμούς της A2PP, CIP, MYCO Ι και επιπτώσεις MYCO II για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, εκτελέσαμε ανάλυση μικροσυστοιχιών και προβλήθηκε ένα υποσύνολο των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων σε A2PP, CIP, MYCO Ι και ΙΙ MYCO επεξεργασμένα κύτταρα. Ποσοτική RT-PCR ανάλυση έδειξε αυξημένη έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την απόπτωση (

ATF5

,

DDIT3

,

CEBPB

) με MYCO Ι και θεραπεία MYCO II, αλλά λίγο οι αλλαγές ήταν παρατηρήθηκαν σε A2PP και CIP ομάδες (Σχήμα 9Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι A2PP έχει μικρότερη τοξικότητα και την καλύτερη προληπτική δυναμικό στον αποκλεισμό

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση σε καλλιεργημένα κύτταρα.

(Α) Western στύπωμα της ρ37 από AGS και BGC823 κύτταρα μολυσμένα με 10

5 CCU /ml του

M

.

hyorhinis

και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με A2PP (20 μΜ), CIP (4 μg /ml), MYCO Ι (5 μg /ml), ή MYCO II (10 μg /ml) για 24 ώρες. Η μέση ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Ανάλυση qPCR του

P37

σε AGS και BGC823 κύτταρα που κατεργάζονται όπως στο (Α). Η μέση ± SD από 3 πειράματα με εις τριπλούν για κάθε δείγμα. (C) κηλίδωση Western της ρ37 από κύτταρα AGS μολυνθεί με 10

5 CCU /ml του

Μ

.

hyorhinis

και κατεργάζεται με A2PP στη διαδικασία της κυτταρικής αποσπάσματα από P

1 προς Ρ

3. Η μέση ± SD από 3 ανεξάρτητα πειράματα. (D) qPCR ανάλυση του

P37

σε AGS κύτταρα μολυσμένα και κατεργάστηκε όπως στο (C). Η μέση ± SD από 3 πειράματα με δείγματα εις τριπλούν. ** P & lt? 0,01? *** P & lt? 0.001? ns, καμία σημασία.

Η

(Α) Διάδοση των ΕΕΑ και BGC823 αντιμετωπίζονται με A2PP (20 μΜ), CIP (4 μg /ml), MYCO Ι (5 μg /ml), ή MYCO II (10 μg /ml) για 72 ώρες. Η μέση ± SD από 4 ανεξάρτητα πειράματα με δείγματα εις τριπλούν. (Β) RT-PCR ανάλυση των

ATF5

,

DDIT3

,

CEBPB

στο AGS και BGC823 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με A2PP (10 μΜ), CIP (4 μg /ml ), MYCO Ι (5 μg /ml), MYCO II (10 μg /ml) για 24 ώρες. Η μέση ± SD από 3 πειράματα με δείγματα εις τριπλούν.

Η

Συζήτηση

λοίμωξη Mycoplasma και μόλυνση είναι ακόμα διαδεδομένη σήμερα και φέρει σημαντικούς κινδύνους για τους ασθενείς και την ποιότητα της έρευνας. Κατά τα τελευταία έτη, διάφορες μελέτες πρότειναν ότι η μόλυνση μυκοπλάσματος συσχετίστηκε επίσης με ογκογένεση [3-8]. λοίμωξη Mycoplasma θα μπορούσε να προκαλέσει τη βλάβη του DNA, να επηρεάσουν την έκφραση του γονιδίου, και να διαταράξει το σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και αποπτωτική απόκριση [30].

Μ

.

hyorhinis

βρέθηκε στο 56% των γαστρικών καρκίνων, 55,1% των καρκίνων του παχέος εντέρου και 39,7% των καρκίνων του μαστού ιστούς [20]. Εκτός αυτού, ορολογική δοκιμή έδειξε ότι το 36% της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΚΥΠ) και 52% καρκινικούς ιστούς του προστάτη ήταν

Μ

.

hyorhinis

θετική [4]. Αυτές οι μελέτες υποδηλώνουν μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ του

Μ

.

hyorhinis

μόλυνσης και της εμφάνισης των όγκων [4,20]. Επιπλέον, κατά τη διαδικασία της κυτταρικής καλλιέργειας, οι πιο κοινές πηγές μόλυνσης είναι μυκόπλασμα, βακτήρια και μούχλα, αλλά ο ρυθμός μόλυνσης του μυκοπλάσματος είναι σχετικά υψηλότερο [13]. Τα αποτελέσματα από διάφορες ομάδες έχουν δείξει ότι το ποσοστό μόλυνσης από μυκόπλασμα κυμαινόταν από 15 έως 80%, μερικές έφθασε ακόμη και το 100% [15,31]. Η ανάλυση των αλληλουχιών DNA από γονιδιώματα 1000 ομάδα εργασίας που συνεπάγεται ότι το 7% των δειγμάτων ήταν μολυσμένα με μυκόπλασμα [32]. Ωστόσο, την πρόληψη της μόλυνσης από μυκόπλασμα και μόλυνσης είναι δύσκολη. Πρώτον, εξαιτίας της πλειομορφικά, πλαστικότητα, διηθησιμότητα και εύκολη διαλυτότητα, μυκοπλάσματα θα μπορούσε να περάσει διαμέσου της μεμβράνης μικροδιήθησης εύκολα, καθιστώντας τα υπάρχουν στην επιφάνεια του κυττάρου ξενιστή ή να ενδοκυτταρώνονται από κύτταρα [1,13,33]. Δεύτερον, μυκόπλασμα στερείται κυτταρικά τοιχώματα, καθιστώντας τα μη ευαίσθητα σε αντιβιοτικά που αναστέλλουν τη σύνθεση του κυτταρικού τοιχώματος, όπως πενικιλίνη. Αποτελεσματικών αντιβιοτικών υπάρχουν, αλλά οι συνεχείς αιτήσεις τους στην κυτταρική καλλιέργεια δεν συνιστάται λόγω της τοξικότητας στα κύτταρα. Τέλος, μυκόπλασμα είναι ένα άτυπο βακτήρια, προκαλώντας difficulities στη σωστή διάγνωση [34].

Πολυάριθμες φάρμακα κατά του μυκοπλάσματος έχουν αναπτυχθεί, όπως η ερυθρομυκίνη, λευκομυκίνη, Roxithromycin, Ofloxacin, και σιπροφλοξασίνη. Ωστόσο, οι αρνητικές συνέπειες, την τοξικότητα και την αντίσταση εξακολουθεί να φέρει προβλήματα για την καταπολέμηση της ρύπανσης [10,11,35-38]. Εκτός αυτού, η συνεχής χορήγηση των αντιβιοτικών αυτών δεν θα μπορούσε να εξαλείψει εντελώς Mycoplasma για μία ή και περισσότερες εβδομάδες [39,40]. Ως εκ τούτου, είναι κρίσιμο να βρούμε νέους τρόπους που μπορεί να εξαλείψει τη λοίμωξη από μυκόπλασμα ή μόλυνση αποτελεσματικά και έγκαιρα. Η λύση σε αυτό το στόχο μπορεί πιθανώς να βρεθεί μέσω του χαρακτηρισμού των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τη μόλυνση του μυκοπλάσματος.

προηγούμενη μελέτη μας διαπίστωσε ότι η αλληλεπίδραση της πρωτεΐνης P37 με AXNA2 μεσολάβηση

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση [17]. Σε αυτή τη μελέτη, πρώτον συντίθεται το Ν-τερματικό πολυπεπτίδιο ANXA2 (A2PP) και να επικυρώνονται ειδική αλληλεπίδραση του με πρωτεΐνη GST-P37 σε δέσμευση η στερεά φάση και προσδιορισμούς στρεπταβιδίνη pull-down. Εμπνευσμένο από τέτοια αλληλεπίδραση, αναρωτηθήκαμε αν A2PP θα μπορούσε να ανταγωνισθεί τη μόλυνση του

Μ

.

hyorhinis

. Βρήκαμε ότι A2PP, σε κατάλληλη συγκέντρωση (20 μΜ), μειώθηκε

Μ

.

hyorhinis

λοίμωξη, ανέστειλε μόλυνση-προωθείται μετανάστευση, και μειωμένη μόλυνση προκάλεσε τις φωσφορυλιώσεις των EGFR και ANXA2 στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα. Αυτές οι επιδράσεις που σχετίζονται με μειωμένη αλληλεπίδραση μεταξύ P37 και ANXA2. Θα πρέπει να σημειωθεί ότι A2PP επέδειξαν μόνος ελάχιστες επιδράσεις επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και φωσφορυλιώσεις των EGFR και ANXA2, γεγονός που υποδηλώνει ότι A2PP είναι πιθανό να είναι ένα χρήσιμο αντιδραστήριο για να μειωθεί

M

.

hyorhinis

λοίμωξη. Αυτή η αντίληψη υποστηρίχθηκε από συγκρίσεις των A2PP και των επιπτώσεων εμπορικών αντιβιοτικών »επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων και

M

.

hyorhinis

λοίμωξη, η οποία έδειξε ότι A2PP είχε πράγματι μικρότερη τοξικότητα στα κύτταρα, αλλά ισχυρή ικανότητα για την αντιμετώπιση της λοίμωξης.

Παρά το A2PP, ένα πολυπεπτίδιο 30 aa, θα μπορούσε να μειώσει

Μ

.

hyorhinis

μόλυνση αποτελεσματικά, χρειάζεται ακόμη να καταλάβουμε αν περικοπεί μορφές A2PP θα μπορούσε να επιτύχει παρόμοια αντι-

Μ

.

hyorhinis

ικανότητα.