Αφηρημένο

καρκίνου της ουροδόχου κύστης διαγνωστεί με κυστεοσκόπηση, μια δαπανηρή και επεμβατική διαδικασία που σχετίζεται με δυσφορία του ασθενούς. Ανάλυση των ογκο-ειδικών δείκτες DNA από ιζήματα του ακυρώνεται ούρων έχει τη δυνατότητα για μη επεμβατική ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης? Ωστόσο, η ευαισθησία περιορίζεται από χαμηλά κλάσματα και μικρούς αριθμούς κυττάρων όγκου απολέπιση στα ούρα από όγκους χαμηλής ποιότητας. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να βελτιωθεί η ευαισθησία για μη επεμβατική ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστεως με σύλληψη και τον εμπλουτισμό των καρκινικών κυττάρων στα ούρα μέγεθος που βασίζεται. Σε μια διάσπαση-δείγμα στήσιμο, ούρα από μία διαδοχική σειρά ασθενών με πρωτογενή ή υποτροπιάζουσα όγκων της ουροδόχου κύστης (Ν = 189) υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μικροδιήθηση χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο μεμβράνης με ένα καθορισμένο μέγεθος πόρων, και καθίζηση με φυγοκέντρηση, αντίστοιχα. DNA από τα δείγματα αναλύθηκε για επτά κύστη δείκτες μεθυλίωση που σχετίζονται με όγκους, χρησιμοποιώντας MethyLight και Pyrosequencing δοκιμασίες. Το κλάσμα του όγκου που προέρχεται από DNA ήταν υψηλότερη στα δείγματα του φίλτρου σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ιζήματα για όλους τους δείκτες (

ρ

& lt? 0,000001). Σε όλα τα στάδια του όγκου, ο αριθμός των περιπτώσεων θετικά για έναν ή περισσότερους δείκτες ήταν 87% σε δείγματα φίλτρο σε σύγκριση με το 80% το αντίστοιχο ιζήματα. Η μεγαλύτερη αύξηση στην ευαισθησία επιτεύχθηκε σε χαμηλού βαθμού Ta όγκους, με 82 από 98 περιπτώσεις θετικών στα δείγματα του φίλτρου (84%) έναντι 74 από 98 στα ιζήματα (75%). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι προ-αναλυτική επεξεργασία ακυρώνεται ούρων με διήθηση μέγεθος με βάση μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία για το DNA με βάση την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

Παράθεση:. Andersson Ε, Steven K, Guldberg P (2014) μεγέθους- Βασισμένο Εμπλουτισμός Κυττάρων όγκου αποφολιδωμένα στα ούρα αυξάνει την ευαισθησία για το DNA-Based Ανίχνευση καρκίνου της ουροδόχου κύστης. PLoS ONE 9 (4): e94023. doi: 10.1371 /journal.pone.0094023

Επιμέλεια: Ludmila Prokunina-Olsson, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 23 Οκτ. του 2013? Αποδεκτές: 12 Μαρ 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 του Απριλίου 2014

Copyright: © 2014 Andersson et al. . Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση: Επιχορήγηση υποστήριξης : Το Ίδρυμα Candy. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι η έβδομη πιο κοινή μορφή καρκίνου παγκοσμίως και ευθύνεται για περισσότερους από 150.000 θανάτους κάθε χρόνο [1]. Περισσότερο από το 90% των όγκων της ουροδόχου κύστης είναι μεταβατικό καρκίνωμα κυττάρων (που ονομάζεται επίσης ουροθηλιακό καρκίνωμα) που προκύπτουν από τις urothelial επιθηλιακά κύτταρα του κύστεως. Τυπικά συμπτώματα του καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι μικροσκοπική και μακροσκοπική αιματουρία, επώδυνη ούρηση και πολυουρία. Ωστόσο, κανένα από αυτά τα συμπτώματα είναι ειδικό για τη νόσο και μπορεί να προκληθεί από μια σειρά άλλων καταστάσεων συμπεριλαμβανομένης της κυστίτιδας, πέτρες στα νεφρά και την ασθένεια του προστάτη. Το χρυσό πρότυπο για τη διάγνωση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης είναι διουρηθρική εκτομή του όγκου της κύστης (TURBT). Οι περισσότεροι ασθενείς που διαγιγνώσκονται με μη διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης (στάδιο Ta), η οποία έχει ένα ποσοστό επιβίωσης πέντε ετών 90%. Ωστόσο, το ποσοστό υποτροπής είναι υψηλό (50-70%) και 10-25% πρόοδο σε διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης, δικαιολογούν τη μακροπρόθεσμη παρακολούθηση από κυστεοσκόπηση σε ασθενείς με μη-επεμβατικές όγκους [2] – [4]. Κυστεοσκόπηση είναι μια επεμβατική μέθοδος που είναι δυσάρεστο για τους ασθενείς και απαιτεί μεγάλη τεχνική και οικονομικών πόρων. Είναι, ως εκ τούτου, σημαντικό να αναπτυχθεί μη επεμβατικές μέθοδοι που είναι απλό και οικονομικά αποδοτικό για τη διάγνωση και παρακολούθηση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Άκυροι δείγματα ούρων από ασθενείς με όγκους της ουροδόχου κύστης συνήθως περιέχουν απολέπιση καρκινικά κύτταρα που μπορεί να να ανιχνευθεί με κυτταρολογική ανάλυση. Τα ούρα κυτταρολογία είναι μια μη επεμβατική μέθοδος που έχει υψηλή εξειδίκευση αλλά χαμηλή ευαισθησία (& lt? 40%), ιδιαίτερα σε ασθενείς με όγκους χαμηλής κακοήθειας [5], [6]. Μια πιο ευαίσθητος μη επεμβατική μέθοδο για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης βασίζεται στην ανάλυση των ογκο-ειδικών αλλοιώσεις στο DNA που απομονώθηκε από ιζήματα ούρα. Χρωμοσωμικές απώλειες και σωματικές μεταλλάξεις σε συγκεκριμένα γονίδια όπως

FGFR3

και

ΤΡ53

έχουν χρησιμοποιηθεί επιτυχώς ως βιολογικοί δείκτες για την ανίχνευση των διαφόρων σταδίων καρκίνου της ουροδόχου κύστης [7] – [9]. Τα τελευταία χρόνια, παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση στο προαγωγέα CpG νησίδων έχει δειχθεί ότι συμβαίνουν συχνά και νωρίς στην ανάπτυξη του καρκίνου και μπορεί ακόμη και να προηγείται γενετικές αλλοιώσεις, όπως οι μεταλλάξεις και γονιδιωματικών αναδιάταξη καρκινογένεσης [10]. Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει υπερμεθυλίωση προαγωγού CpG νησίδων σε όγκους της ουροδόχου κύστης (ανασκόπηση στις αναφορές [11] – [13].) Και οι αλλαγές αυτές μπορούν να ανιχνευθούν στα ιζήματα ούρα από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης [14], [15]. Δεν υπάρχει ενιαίο δείκτη DNA-μεθυλίωση που καθορίζει όλους τους τύπους των όγκων της ουροδόχου κύστης, και οι περισσότερες μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει έναν πίνακα δεικτών για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε κλινικά δείγματα. Η ευαισθησία και η ειδικότητα της ανίχνευσης όγκων της ουροδόχου κύστης με βάση το DNA διαφέρουν σημαντικά μεταξύ των μελετών, η οποία μπορεί να αποδοθεί στην επιλογή των δεικτών και των μεθόδων για την αξιολόγηση αυτών των δεικτών, καθώς και οι διαφορές όσον αφορά την εκπροσώπηση των διαφόρων σταδίων του όγκου σε ομάδες ασθενών [16] – [23].

σε μελέτες όπου ζευγαρωμένα δείγματα όγκου και ιζήματα από ούρα αναλύθηκαν παράλληλα για το ίδιο πάνελ των δεικτών DNA, η ευαισθησία της ανίχνευσης είναι σταθερά χαμηλότερα στα ούρα [15], [17], [20]. Η απολέπιση των κυττάρων του όγκου στα ούρα εξαρτάται από τα χαρακτηριστικά του όγκου, όπως το μέγεθος, το στάδιο και το βαθμό και επίσης δείχνει μεγάλη ενδο-ατομική διακύμανση [24]. Ειδικά τα μικρά μη επεμβατική όγκοι είναι λιγότερο πιθανό να ρίξει αρκετά κύτταρα στα ούρα προς ανίχνευση σε επακόλουθη ανάλυση. Επιπλέον, τα ούρα από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης μπορεί να περιέχει έναν αυξημένο αριθμό άλλων τύπων κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των λευκών κυττάρων του αίματος, η οποία μπορεί να επηρεάσει την ευαισθησία της ανάλυσης ιζημάτων. Ως εκ τούτου, μια μέθοδος που επιτρέπει για εμπλουτισμό των καρκινικών κυττάρων σε δείγματα ούρων μπορεί να αυξήσει την αξιοπιστία και την ευαισθησία για τη μη επεμβατική ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης.

Τα καρκινικά κύτταρα που προέρχονται από επιθηλιακά κύτταρα είναι συνήθως μεγαλύτερα από τα λευκά αιμοσφαίρια, και αυτή η διαφορά μεγέθους θα μπορούσε δυνητικά να αξιοποιηθούν για τον εμπλουτισμό για κύτταρα όγκου σε ετερογενή βιολογικά δείγματα όπως ούρα. Προηγούμενες μελέτες έχουν χρησιμοποιηθεί φίλτρα για μέγεθος με βάση απομόνωση σπάνιων κυκλοφορούντων κυττάρων όγκου (CTCs) στο περιφερικό αίμα [25], [26]. Η ιδέα της σύλληψης κυττάρων στα ούρα σε ένα φίλτρο εισήχθη περισσότερο από τριάντα χρόνια πριν [27], και μετέπειτα μελέτες έχουν χρησιμοποιήσει φίλτρα μεμβράνης για την προετοιμασία των επιθηλιακών κυττάρων από ούρων για την ανίχνευση του καρκίνου του ουροθηλιακά με κυτταρολογία ή φθορισμό in situ υβριδισμού (FISH) ανάλυση [28] – [30]. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε δοκιμαστεί μία απλή και αποδοτική διαδικασία για την προ-αναλυτική διήθηση των ούρων για την αύξηση του κλάσματος των κυττάρων του όγκου και έτσι την ευαισθησία για ανίχνευση DNA που βασίζονται επί αφιλτράριστο ιζήματα. Σε μια διάσπαση-δείγμα στήσιμο, δείγματα ούρων από ασθενείς με καρκίνο της ουροδόχου κύστης αξιολογήθηκαν για την παρουσία του DNA του όγκου με ένα πάνελ δεικτών μεθυλίωσης ανιχνεύεται συχνά στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Τα κλάσματα των μεθυλιωμένων αλληλίων προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε καθιζάνουν και φιλτράρεται δείγματα με προσδιορισμούς MethyLight και Pyrosequencing. Βρήκαμε ότι αυτή η μέθοδος φιλτραρίσματος αύξησε το κλάσμα του όγκου που προέρχεται από DNA και επίσης βελτίωσε την ευαισθησία και την ευρωστία ανίχνευσης όγκου κύστης από δείγματα ούρων.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας της Κοπεγχάγης, και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και τους ελέγχους κατά την ένταξη.

Η συλλογή των δειγμάτων ούρων

Άκυροι πρωί δείγματα ούρων συλλέχθηκαν από την ουροδόχο κύστη ασθενείς με καρκίνο δεκτοί για TURBT στο Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Κοπεγχάγης, Herlev, Δανία, μεταξύ Ιουνίου 2010 και Οκτώβριο του 2011, και από υγιείς εθελοντές χωρίς να είναι γνωστό ουρολογικές κακοήθειες. Τα δείγματα εστάλησαν στο δανικό Αντικαρκινική Εταιρεία και η επεξεργασία μέσα σε 4-6 ώρες μετά την κένωση.

Επεξεργασία των δειγμάτων ούρων

Πενήντα χιλιοστόλιτρα του κάθε δείγματος ούρων καθιζάνουν με φυγοκέντρηση στα 2.000 g για 10 λεπτά . Το σφαιρίδιο πλύθηκε σε ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο (PBS) που ακολουθείται από άλλα 10 λεπτά φυγοκέντρηση. Το υπερκείμενο απορρίφθηκε και το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε περίπου 200 μΙ PBS. Παράλληλα, τα ούρα από το ίδιο δείγμα αναρροφάται εντός σύριγγας μιας χρήσης και πέρασε μέσω ενός φίλτρου από πολυανθρακικό τροχιάς χαραγμένο Whatman Nuclepore υδρόφιλη μεμβράνη (διάμετρος 25 mm) τοποθετείται στο αντίστοιχο στήριγμα φίλτρου (Whatman, Maidstone, UK). Το δείγμα ούρων περάσει μέσα από το φίλτρο με θετική ισχύ μέχρι αντίσταση έγινε αισθητή (κορεσμού), με ανώτατο όριο τα 125 ml. Όλα τα φίλτρα ξεπλύθηκαν με PBS πριν από την απομάκρυνση από την υποδοχή του φίλτρου. ιζήματα ούρων και φίλτρα με περιεχόμενο φίλτρο φυλάχθηκαν στους -80 ° C μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία.

Απομόνωση DNA και μετατροπής Bisulfite

DNA απομονώθηκε από δείγματα εναπόθεσης ούρων και φίλτρο χρησιμοποιώντας το κιτ Qiagen Mini Prep (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. δείγματα φίλτρου και ιζήματα επωάστηκαν με ρυθμιστικό ATL και πρωτεϊνάση Κ στους 56 ° C για τουλάχιστον μία ώρα ή 1 για όλη τη νύχτα. Μετέπειτα επεξεργασία έγινε σύμφωνα με το πρωτόκολλο για τον καθαρισμό του DNA από ιστούς. DNA από τα φίλτρα και τα ιζήματα εκλούστηκε σε 50 μΐ και 100 μΐ ρυθμιστικού ΑΕ, αντίστοιχα, και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Η συγκέντρωση του DNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA).

μετατροπή διθειώδους έγινε χρησιμοποιώντας την EZ μεθυλίωσης του DNA-Gold Kit (Zymo Research Corp, Orange, CA, USA) σύμφωνα με με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Το όξινο θειώδες μετατρέπεται DNA εκλούστηκε σε 2 χ 10 μΐ Μ-Ρυθμιστικού Έκλουσης και αποθηκεύεται στους -80 ° C. Για ζευγαρωμένα δείγματα (ιζημάτων και το φίλτρο), χρησιμοποιήθηκε η ίδια ποσότητα του DNA, με ανώτατο όριο τα 500 ng. Σε περιπτώσεις όπου η συγκέντρωση DNA ήταν πολύ χαμηλό ώστε να προσδιοριστεί επακριβώς με τη χρήση του φασματοφωτομέτρου NanoDrop, χρησιμοποιήθηκε το μέγιστο όγκο του δείγματος (20 μΙ). Φυσιολογικό επιθήλιο της ανθρώπινης ουροδόχου κύστης που προέρχεται από ένα 66 ετών αρσενικό αγοράστηκε από Capital Βιοεπιστημών (Rockville, MD, USA).

Cell Culture

Η κυτταρική σειρά Τ24 (DSMZ, Braunschweig, Γερμανία) ήταν καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Λεμφοκύτταρα απομονώθηκαν από αίμα από έναν υγιή δότη ουσιαστικά όπως περιγράφεται [31] και αποθηκεύτηκε στους -80 ° C μέχρι τη χρήση. Κύτταρα σε μονό-κυτταρικό εναιώρημα μετρήθηκαν και μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα μετρητή κυττάρων Countess Automated (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Οι δύο τύποι κυττάρων αναμίχθηκαν στις ενδεικνυόμενες αναλογίες και υποβάλλονται σε επεξεργασία με φυγοκέντρηση και διήθηση, όπως περιγράφηκε παραπάνω για τα δείγματα ούρων.

βαθμιδωτής μετουσίωσης Gel Electrophoresis

Μετάλλαξη ανάλυση του

HRAS

εξόνιο 2 με μετουσιωτική ηλεκτροφόρηση κλίσης γέλης (DGGE) έγινε ουσιαστικά όπως περιγράφεται [32]. Οι αλληλουχίες των εκκινητών και PCR συνθήκες που αναφέρονται στον Πίνακα S1. Τα προϊόντα PCR φορτώθηκαν σε 0% μετουσιωτικού /6% πολυακρυλαμιδίου-90% μετουσιωτικού /9% πολυακρυλαμιδίου διπλό κλίση gel [33]. Τα πηκτώματα έτρεξαν στα 170 V για 4,5 ώρες σε ρυθμιστικό ΤΑΕ διατηρείται σε σταθερή θερμοκρασία 58 ° C, βάφονται με βρωμιούχο αιθίδιο και φωτογραφήθηκαν υπό υπεριώδη ακτινοβολία.

MethyLight

Σε πραγματικό χρόνο ποσοτική μεθυλίωσης-ειδική PCR (MethyLight?. Ref [34]) εκτελέστηκε ουσιαστικά όπως περιγράφεται [20]. Οι αλληλουχίες εκκινητών και ανιχνευτών που παρατίθενται στον Πίνακα S1. Οι αντιδράσεις εκτελέστηκαν με 480 πλατφόρμα LightCycler χρησιμοποιώντας τον LightCycler 480 Probes κύριο Kit (Roche, Mannheim, Germany) και 1 μΙ κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ανά αντίδραση. Η ιδιαιτερότητα της κάθε δοκιμασίας ιδρύθηκε χρησιμοποιώντας το

in vitro

μεθυλιωμένο DNA (IVM? CpGenomeTM Οικουμενική Methylated DNA, Chemicon /Millipore, Billerica, ΜΑ) και το DNA από επιλεγμένες κυτταρικές σειρές καρκίνου ως θετικοί και αρνητικοί έλεγχοι για μεθυλίωση, αντίστοιχα , και το νερό και μη-κατεργασμένο με όξινο θειώδες γενωμικό DNA ως αρνητικοί μάρτυρες για την ενίσχυση. Μία δοκιμασία MethyLight για

ALUC4

και μία σειρά αραίωσης του IVM χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η συγκέντρωση του DNA του δείγματος μετά την κατεργασία όξινου θειώδους [20], [35]. Περιπτώσεις απορρίπτεται εάν κάποιο από τα ζεύγη δειγμάτων ιζημάτων ή φίλτρου είχαν συγκέντρωση κάτω από το ισοδύναμο των 0,25 ng /μl μη κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA. επίπεδα μεθυλίωσης υπολογίστηκαν ως επί τοις εκατό μεθυλιωμένο αναφοράς (PMR?. Ref [35]) με κανονικοποίηση δείκτη-ειδικές τιμές αντίδραση στο

ALUC4

τιμές σε σχέση με τις ίδιες τιμές για πλήρως μεθυλιωμένα ελέγχου (IVM). Οι μικρές ποσότητες του αρχικού DNA για πολλά από τα δείγματα περιορίσει τον αριθμό των δεικτών που θα μπορούσαν να ελεγχθούν, καθώς και όλες οι αναλύσεις διεξήχθησαν ως ενιαίο αντιδράσεις. Το επίπεδο μεθυλίωσης υπόβαθρο για κάθε δείκτη προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας DNA από καθιζάνουν και διηθούνται δείγματα ούρων από 11 υγιείς ελέγχους καθώς και ανθρώπινο γονιδίωμα ΟΝΑ (Roche, Mannheim, Germany). Οι τιμές αποκοπής PMR ήταν 3 για

HOXA9

, 2 για

POU4F2

, 0,5 για

SALL3

και 2 για

VIM2.

Η

Pyrosequencing

Pyrosequencing δοκιμασίες για το

HRAS

p.G12V (c.35G & gt? T) μετάλλαξη και

BCL2

μεθυλίωση υποστηρικτής σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό σχεδιασμού PyroMark δοκιμασία (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Οι αλληλουχίες των εκκινητών και PCR συνθήκες που αναφέρονται στον Πίνακα S1. PCR πραγματοποιήθηκε σε έναν τελικό όγκο 25 μΙ που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα PCR (Qiagen GmbH, Hilden, Γερμανία), 200 μΜ από κάθε dNTP, 0,4 μΜ από κάθε εκκινητή και 1 U Taq του HotStarTaq DNA πολυμεράση (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Pyrosequencing διεξήχθη σε μια πλατφόρμα PyroMark Ε24, χρησιμοποιώντας PyroMark Gold Ε24 Αντιδραστήρια (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έγινε με το λογισμικό PyroMark Ε24 (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). Τα μέσα επίπεδα μεθυλίωσης για

BCL2

υπολογίστηκαν για τις επτά θέσεις CpG που περιλαμβάνονται στην δοκιμασία. Το σήμα υποβάθρου για την

BCL2

δοκιμασία μεθυλίωσης ορίστηκε σε 5% με βάση την ανάλυση του κατεργασμένου με όξινο θειώδες γονιδιωματικό DNA ανθρώπου (Roche, Mannheim, Germany). Για το

BCL2

ανάλυση μεθυλίωσης, μόνο κλινικά δείγματα με συγκέντρωση ισοδύναμη με 5 ng /μl μη κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA ή περισσότερο είχαν συμπεριληφθεί.

Αποτελέσματα

Σύλληψη και Εμπλουτισμός κύστης Tumor Cells επί μεμβράνης φίλτρου

για να ελεγχθεί η ικανότητα των φίλτρων μεμβράνης για να συλλάβει τα κύτταρα όγκου κύστης, χρησιμοποιήσαμε για πρώτη φορά ένα σύστημα μοντέλο που μοιάζουν με δείγματα ούρων που περιέχουν χαμηλά κλάσματα των καρκινικών κυττάρων. Ένα πείραμα δείχνεται στο Σχήμα 1. Το καθαρισμένο καλλιεργημένα λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος (διάμετρος 7-8 μm) εμπλουτίστηκαν με 0,5% τον καρκίνο της ουροδόχου κύστης Τ24 κύτταρα (διάμετρος 16-17 μm). Μέρος αυτού του μίγματος κυττάρων καταβυθίστηκε με φυγοκέντρηση, ενώ το υπόλοιπο διέρχεται μέσω ενός φίλτρου μεμβράνης με μέγεθος πόρων 8 μm (Σχήμα 1Α). Το έκλουσμα από το φίλτρο ήταν επίσης συλλέγεται και καθιζάνει με φυγοκέντριση. Για να εκτιμηθεί αν διήθηση αυξάνει το κλάσμα των κυττάρων όγκου στο δείγμα, το DNA απομονώθηκε και αναλύθηκε για δύο μεταβολές όγκου-ειδικά στα κύτταρα Τ24? η

HRAS

p.G12V μετάλλαξη και υπερμεθυλίωση του

BCL2

υποκινητή. Το σχήμα 1Β δείχνει τη φυσική ανάλυση των μεταλλαγμένων και άγριου τύπου

HRAS

αλληλόμορφα με χρήση DGGE, η οποία έχει ένα επίπεδο ανίχνευσης του περίπου 2% [36]. Το μεταλλαγμένο

HRAS

αλληλόμορφο ήταν σαφώς ανιχνεύσιμη ως ομο- και ετεροδίκλωνων στο δείγμα φίλτρο, αλλά όχι στο ίζημα ή έκλουσμα δείγματα (Σχήμα 1Β). Ποσοτική ανάλυση των ίδιων δειγμάτων χρησιμοποιώντας Pyrosequencing έδειξαν αύξηση στην αναλογία των μεταλλαγμένων (Τ) πάνω από άγριου τύπου (G)

HRAS

αλληλόμορφα από 3-4% στο ίζημα και έκλουσμα δείγματα σε 19% στο δείγμα φίλτρο (Σχήμα 1 C και τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όξινο θειώδες Pyrosequencing έδειξε μια παρόμοια αύξηση στο κλάσμα των

BCL2

υπερμεθυλίωση αλληλόμορφα, ειδικά για τα κύτταρα Τ24, μετά από διήθηση (Σχήμα 1D).

(Α) Σχηματική αναπαράσταση του μικτού δείγματος πειραματική διάταξη -πάνω. δείγμα ούρων ή κυτταρικό εναιώρημα διαιρείται σε δύο και υποβάλλεται σε φυγοκέντρηση και διήθηση, αντίστοιχα. DNA από κύτταρα σε ιζήματα ή συλλαμβάνεται επί του φίλτρου ακολούθως απομονώνεται και αναλύεται για ογκοειδικό δείκτες. (Β) Ανίχνευση του

HRAS

p.G12V μετάλλαξη από DGGE. Η Τ24 κυτταρική γραμμή είναι ομόζυγο για το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο. Ιζημάτων και έκλουσμα δείγματα εμφανίζουν μόνο το αλληλόμορφο άγριου τύπου, ενώ το δείγμα του φίλτρου δείχνει τόσο μεταλλαγμένων και άγριου τύπου αλληλόμορφα. Ετεροδίδυμα είναι υβριδικά μόρια που αποτελούνται από ένα μεταλλαγμένο κλώνο και ένα σκέλος άγριου τύπου. (Γ) Pyrographs που δείχνει την κατανομή μεταξύ άγριου τύπου (G) και μεταλλαγμένων (T)

HRAS

αλληλόμορφα στα δείγματα ιζημάτων και το φίλτρο. (D) Pyrographs του

BCL2

υποστηρικτής CpG ανάλυση νησί μεθυλίωσης σε δείγματα ιζημάτων και το φίλτρο. Οι επιμέρους περιοχές CpG στην περιοχή-στόχο που υποδεικνύεται από σκούρο γκρι σκίαση, και το ποσοστό των μεθυλιωμένο αλληλόμορφα (Γ) ενδείκνυται σε κάθε θέση.

Η

Για να δοκιμάσετε τη μέθοδο διήθησης σε κλινικό περιβάλλον, τα ούρα δείγματα λήφθηκαν από 15 ασθενείς καρκίνου της ουροδόχου κύστης δεκτά για TURBT. Σε αυτή τη σειρά των δειγμάτων, αξιολογήσαμε επίσης αν το μέγεθος των πόρων θα μπορούσε να επηρεάσει την αναλογία των κυττάρων του όγκου σε φυσιολογικά κύτταρα. Από κάθε δείγμα ούρων, 50 ml παρασκευάσθηκαν με φυγοκέντρηση, ενώ ο υπόλοιπος όγκος χωρίστηκε εξίσου και πέρασε μέσα από δύο φίλτρα με μεγέθη πόρων 8 μm και 10 μm, αντίστοιχα. DNA απομονώθηκε από όλα τα ιζήματα ούρων και δειγμάτων φίλτρου και εξετάστηκαν για

BCL2

μεθυλίωση χρησιμοποιώντας μια πολύ ειδική και ευαίσθητη δοκιμασία MethyLight. Επτά από τα 15 δείγματα ούρων ήταν θετικά για αυτόν τον δείκτη, σε συμφωνία με προηγούμενες εκθέσεις που δείχνουν

BCL2

υπερμεθυλίωση σε ένα μεγάλο ποσοστό των όγκων της ουροδόχου κύστης [16], [22]. Για να εκτιμηθεί το κλάσμα του όγκου που προέρχεται από DNA, τα επίπεδα μεθυλίωσης υπολογίστηκαν για το

BCL2

-θετικό δειγμάτων χρησιμοποιώντας κανονικοποιημένες τιμές (PMR). Υπήρχε μόνο μια μικρή διαφορά στα επίπεδα μεθυλίωσης μεταξύ των φίλτρων 8 και 10 μm, με ελαφρώς υψηλότερα επίπεδα στο φίλτρο 8 μm (Πίνακας S2). Ποσοτική ανάλυση του

BCL2

μεθυλίωση με Pyrosequencing επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα της ανάλυσης MethyLight (Σχήμα 2). Αξίζει να σημειωθεί ότι όλα τα δείγματα φίλτρο (τόσο 8 μm έως 10 μm) παρατηρήθηκαν υψηλότερες

επίπεδα BCL2

μεθυλίωσης από τα αντίστοιχα δείγματα ιζημάτων, υποδεικνύοντας ένα υψηλότερο κλάσμα των κυττάρων όγκου.

Τα μέσα επίπεδα μεθυλίωσης του

BCL2

προαγωγού CpG νησιού σε δείγματα ούρων από τους επτά ασθενείς καρκίνου της ουροδόχου κύστης, όπως προσδιορίζεται με Pyrosequencing. Ιζημάτων και δύο δείγματα του φίλτρου (8 και 10 μm μέγεθος πόρου, αντίστοιχα) παρασκευάστηκαν από κάθε δείγμα ούρων. Το δείγμα ιζήματος από τον ασθενή 2 λείπουν λόγω απέτυχε την εκχύλιση του DNA.

Η

Ούρα διήθησης Αυξάνει το κλάσμα του όγκου DNA σε κλινικά δείγματα

Έχοντας λάβει την απόδειξη της αρχής ότι τα φίλτρα μεμβράνης μπορεί να συλλάβει και τον εμπλουτισμό για κύτταρα όγκου κύστης σε δείγματα ούρων, θα πραγματοποιηθεί μία κλινική μελέτη 220 διαδοχικών ασθενών όγκου κύστης. Οι δημογραφικές και κλινικο-παθολογικών χαρακτηριστικών των ασθενών αυτών παρατίθενται στον Πίνακα S3. Υπήρχε ένας ίσος αριθμός των ασθενών με πρωτοπαθή και επαναλαμβανόμενες όγκους σε αυτή την ομάδα. Morning δείγματα ούρων συλλέχθηκαν και επεξεργασία σύμφωνα με το σχεδιασμό διαχωρισμένων δειγμάτων που απεικονίζεται στο Σχήμα 1Α, χρησιμοποιώντας ένα φίλτρο 8 μm. DNA απομονώθηκε από όλα τα ιζήματα ούρων και δειγμάτων φίλτρου και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όξινο θειώδες νάτριο. Η συγκέντρωση του κατεργασμένου με όξινο θειώδες DNA σε κάθε δείγμα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία MethyLight για

ALUC4

. Τριάντα ένα ζεύγη δειγμάτων απορρίφθηκαν λόγω της χαμηλής απόδοσης του DNA (Πίνακας S3).

Προβολή όλων των 189 ζεύγη δειγμάτων για

BCL2

μεθυλίωση με ανάλυση MethyLight εντοπιστεί 121 περιπτώσεις θετικών για αυτό το δείκτη (παραδείγματα φαίνονται στο Σχήμα 3Α). Σε 60 από αυτές τις περιπτώσεις, τα δύο δείγματα του φίλτρου και ιζήματος περιέχονται επαρκείς ποσότητες του DNA για αξιόπιστη ποσοτική ανάλυση με Pyrosequencing (Σχήμα 3Β). Σε 18 από τις 60 περιπτώσεις, η μέση

BCL2

επίπεδο μεθυλίωσης ήταν κάτω από το σήμα υποβάθρου για Pyrosequencing και στα δύο δείγματα ιζημάτων και το φίλτρο. Από τους υπόλοιπους 42 περιπτώσεις, 29 (69%) έδειξαν υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης στο δείγμα φίλτρο σε σύγκριση με το δείγμα ιζήματος, πέντε περιπτώσεις (12%) έδειξαν επίπεδα ίσα μεθυλίωσης (& lt? 2 τοις εκατό μονάδες διαφορά), και οκτώ περιπτώσεις (19% ) έδειξε υψηλότερα επίπεδα μεθυλίωσης στα ιζήματα από ό, τι τα αντίστοιχα φίλτρα (Εικόνα 3C). Το μέσο επίπεδο μεθυλίωσης ήταν 28% σε δείγματα του φίλτρου σε σύγκριση με το 21% στα ιζήματα (

σ

& lt? 0,001, paired t-test). Η αύξηση στα επίπεδα μεθυλίωσης από ιζήματα για φιλτράρισμα κυμαίνονταν από 3 έως 35 μονάδες τοις εκατό, με διάμεση τιμή 10 ποσοστιαίες μονάδες. Ποσοτική ανάλυση όλων των 121 περιπτώσεις θετικών για

BCL2

μεθυλίωση χρησιμοποιώντας κανονικοποιημένες τιμές (PMR) από την ανάλυση MethyLight έδειξε ένα μέσο επίπεδο μεθυλίωσης του 10,0% στα δείγματα ιζημάτων και 14,4% στα δείγματα του φίλτρου, με το μέσο επίπεδο αυξάνεται από 1,6% σε 4,0% (Σχήμα 4?

σ

& lt? 0,001, paired t-test)

(Α) Παραδείγματα MethyLight ανάλυση των

BCL2

υποκινητή. CpG νησί μεθυλίωσης. Στον ασθενή Α, ενίσχυση παρατηρείται στο δείγμα φίλτρο, αλλά όχι στο δείγμα του ιζήματος. Στο Β ασθενή, ενίσχυση παρατηρείται σε δύο δείγματα? Ωστόσο, με μια υψηλότερη τιμή Ct για το δείγμα του ιζήματος. (Β) Παραδείγματα

υποστηρικτής νησί CpG BCL2

ανάλυση μεθυλίωσης από Pyrosequencing σε ζεύγη δειγμάτων. Μέσο επίπεδο μεθυλίωσης υπολογίζεται για τις επτά επιμέρους περιοχές CpG προσδιορίστηκαν (υποδεικνύεται με σκούρο γκρι σκίαση). Το μέσο επίπεδο μεθυλίωσης στο δείγμα ιζήματος από το Β ασθενής ήταν κάτω από το σήμα υποβάθρου για Pyrosequencing, σε αντίθεση με τη δοκιμασία MethyLight (Α), που δείχνει τη διαφορά στην αναλυτική ευαισθησία μεταξύ των δύο δοκιμασιών. (C) Μέση επίπεδα μεθυλίωσης για ζεύγη δειγμάτων, όπως καθορίζεται από Pyrosequencing. Δεικνύονται τα αποτελέσματα για τις περιπτώσεις όπου τουλάχιστον ένα από τα ζεύγη δειγμάτων έδειξε σήματα πάνω από το υπόβαθρο για Pyrosequencing (Ν = 42).

Η

Ορατή είναι η διάμεσος του κανονικοποιημένες τιμές (τοις εκατό μεθυλιωμένο αναφοράς, PMR) από MethyLight ανάλυση των επτά δεικτών μεθυλίωσης. Για κάθε δείκτη, τα επίπεδα μεθυλίωσης κυμαίνονταν από & lt? 1% έως 100% (δεν φαίνεται). *, P & lt? 0,05? **, P & lt?. 0.01

Η

Για να αναλύουν δείγματα αρνητικά για

BCL2

μεθυλίωση, επεκτείναμε την ανάλυση MethyLight που βασίζεται σε έξι επιπλέον υποστηρικτής νησίδες CpG έχουν αναφερθεί στο παρελθόν να υπερμεθυλίωση συχνά σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης, συμπεριλαμβανομένων των

CCNA1

,

EOMES

,

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

και

VIM2

[16], [18], [23]. Έχουμε επικυρωθεί αυτούς τους δείκτες μαζί με

BCL2

σε ένα πάνελ 51 όγκων της ουροδόχου κύστης που αντιπροσωπεύουν διάφορα στάδια του όγκου (22 χαμηλής ποιότητας Ta όγκων, 2 υψηλής ποιότητας Ta όγκους, 8 όγκους Τ1, 17≥T2 όγκους, και 2 Tis ). Κάθε ένα από αυτά δεικτών ήταν θετική σε & gt? Το 45% των όγκων σε αυτόν τον πίνακα, και 48 των όγκων (94%) ήταν θετικά για τουλάχιστον έναν δείκτη. Tumor ειδικότητα των δεικτών επιβεβαιώθηκε με ανάλυση του φυσιολογικού ιστού της ουροδόχου κύστης

ποσοτική ανάλυση όλων επτά δεικτών μεθυλίωσης του DNA έδειξε αύξηση των επιπέδων μεθυλίωσης σε δείγματα φίλτρο σε σύγκριση με τα ιζήματα (Σχήμα 4?.

ρ

& lt? 0.000001, paired t-test). Η διαφορά αυτή ήταν επίσης στατιστικά σημαντική για κάποιες επιμέρους δείκτες, συμπεριλαμβανομένων των

BCL2

,

HOXA9

και

VIM2

(Σχήμα 4).

Ούρα διήθησης Αυξάνει το ευαισθησία για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης

τελικά απευθύνεται κατά πόσον οι αυξημένες κλάσματα που προέρχονται από όγκους DNA επιτυγχάνεται με διήθηση των ούρων θα μπορούσαν να επηρεάσουν την ευαισθησία για την ανίχνευση του καρκίνου της ουροδόχου κύστης. Για τον προσδιορισμό των επιπέδων υποβάθρου μεθυλίωσης για καθένα από τα επτά δείκτες, εξετάσαμε DNA από δείγματα ούρων φίλτρο και ιζημάτων από 11 υγιείς ελέγχους, καθώς και DNA από λεμφοκύτταρα περιφερικού αίματος. ενίσχυση τέλη του κύκλου παρατηρήθηκε περιστασιακά για τέσσερις από τους δείκτες (

HOXA9

,

POU4F2

,

SALL3

και

VIM2

), μερικά από τα οποία ήταν διατηρείται σε επαναλαμβανόμενες αναλύσεις. Με βάση τα δεδομένα αυτά, μια τιμή αποκοπής ορίζεται για καθένα από αυτούς τους δείκτες πάνω από την οποία ένα δείγμα θεωρήθηκε θετικό.

BCL2, CCNA1

και

EOMES

δεν έδειξε καμία μεθυλίωση φόντο.

Με θετικότητας ορίζεται ως υπερμεθυλίωση τουλάχιστον ένας από τους επτά δείκτες, την ευαισθησία σε όλα τα στάδια του όγκου ήταν 80% (152/189) στα ιζήματα ούρα, ενώ ήταν 87% (164/189) των δειγμάτων του φίλτρου. Αυτό το μοτίβο ήταν σαφές επίσης για μεμονωμένες δείκτες, τα οποία όλα εμφάνισαν μεγαλύτερη ευαισθησία στα δείγματα του φίλτρου (Σχήμα 5). Ο δείκτης δείχνει την υψηλότερη ευαισθησία ήταν

VIM2

, η οποία ήταν θετική στο 56% των δειγμάτων ιζημάτων και το 67% των δειγμάτων του φίλτρου. Οι άλλες έξι δείκτες είχαν ευαισθησίες του 35-53% στα ιζήματα και 43-62% σε φίλτρα. Η ευαισθησία για όγκους υψηλότερης στάδιο (≥T1) ήταν γενικά υψηλή (& gt? 90%) σε ιζήματα και ήταν μόνο ελαφρώς, αν και με συνέπεια, αυξημένη μετά από διήθηση. Αξιοσημείωτα, όμως, μια δραματική επίδραση παρατηρήθηκε για χαμηλού βαθμού Ta όγκους, όπου η ευαισθησία αυξήθηκε από 75% (74/98) στα ιζήματα σε 84% (82/98) σε φίλτρα (Πίνακας 1). Μεταξύ των 95 πρωτογενείς όγκους, 80 (84%) ανιχνεύθηκαν στο ίζημα και 84 (88%) ανιχνεύθηκαν στο φίλτρο. Μεταξύ των 94 επαναλαμβανόμενες όγκους, 73 (78%) ανιχνεύθηκαν στα ιζήματα και 80 (85%) ανιχνεύθηκαν στο φίλτρο.

Παρουσιάζονται οι δείγματα ποσοστά θετικό για τους επτά ιχνηθετών DNA-μεθυλίωση. Η τελευταία στήλη ( «All») δείχνει το ποσοστό των θετικών δειγμάτων για έναν ή περισσότερους δείκτες.

Η

Συζήτηση

Οι μη επεμβατικές δοκιμασίες που μπορεί με ακρίβεια και αξιοπιστία τον εντοπισμό της ουροδόχου κύστης του καρκίνου θα έχει σημαντικές επιπτώσεις στους ασθενείς και το σύστημα υγειονομικής περίθαλψης, μειώνοντας την ανάγκη για συχνή, δαπανηρή και άβολα κυστεοσκόπηση. Σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί στον εντοπισμό βιοδείκτες των ούρων με βάση που μπορεί να ξεπεράσουν κυτταρολογική εξέταση ούρων, και κάποια από αυτά δείκτες έχουν αναπτυχθεί σε εμπορικές δοκιμές. Παρ ‘όλα αυτά, οι προκλήσεις παραμένουν στην επίτευξη της ευαισθησίας των κυστεοσκόπηση [37] – [39]. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αυξηθεί η ευαισθησία για το DNA που βασίζονται σε ανίχνευση καρκίνου της ουροδόχου κύστης σε δείγματα ούρων μέσω μιας απλής διαδικασίας φιλτραρίσματος, για τον εμπλουτισμό για κύτταρα όγκου. Σε ένα μεγάλο διαδοχικούς σειρά ασθενών όγκου κύστης, ελέγξαμε μια εμπορική τροχιάς χαραγμένο πολυανθρακικό φίλτρο με μέγεθος πόρων 8 μm και συγκρίθηκαν με την τυπική ανάλυση ιζήματος ούρων. Ποσοτική ανάλυση σε ένα πάνελ επτά δεικτών μεθυλίωσης του DNA έδειξαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα DNA όγκου σε φιλτραρισμένα δείγματα ούρων σε σύγκριση με τα αντίστοιχα ιζήματα, γεγονός που υποδηλώνει ότι το φίλτρο αιχμαλωτίζει κύτταρα όγκου κύστης, κατά προτίμηση έναντι άλλων κυττάρων που υπάρχουν στα ούρα. Το πιο σημαντικό, η διαδικασία διήθησης προσδιορίζονται μεγαλύτερο αριθμό δειγμάτων από ασθενείς όγκου κύστης ως θετικά, με αποτέλεσμα μια συνολική διαγνωστική ευαισθησία 87% σε δείγματα φίλτρο σε σύγκριση με ευαισθησία 80% στα αντίστοιχα ιζήματα.

Χαμηλή -grade, όγκοι της ουροδόχου κύστης χαμηλό στάδιο αντιπροσωπεύουν τη μεγαλύτερη πρόκληση στις προσεγγίσεις ανίχνευσης ούρων που βασίζεται, συμπεριλαμβανομένων και των τυποποιημένων κυτταρολογίας και FISH, καθώς οι όγκοι αυτοί έχουν την τάση να ρίξει κάτω τον αριθμό των κυττάρων στα ούρα [40], [41]. Ο περιορισμός αυτός ήταν επίσης εμφανής στην προσέγγιση με βάση το DNA μας, όπου η ευαισθησία στα ιζήματα στα ούρα ήταν κοντά ή πάνω από 90% για το στάδιο ≥T1 όγκους, ενώ ήταν μόλις 75% για τις χαμηλού βαθμού Ta όγκους. Είναι ενδιαφέρον ότι, διήθηση των δειγμάτων ούρων αύξησε την ευαισθησία για χαμηλής ποιότητας Ta όγκους σε 84%, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτή η διαδικασία μπορεί να ανακουφίσει μερικές από τις δυσκολίες στον εντοπισμό αυτών των όγκων. Μεταξύ του συνόλου των 189 ασθενών που ερευνώνται, 16 περιπτώσεις ήταν αρνητικές για όλους τους δείκτες της μεθυλίωσης και στα δύο δείγματα του φίλτρου και των ιζημάτων, και 13 από αυτούς είχαν υψηλού ή χαμηλού βαθμού όγκους Ta. Εμείς [20] και άλλοι [42] έχουν δείξει στο παρελθόν ότι ένα υποσύνολο των επιφανειακών όγκων της ουροδόχου κύστης εμφανίζουν χαμηλά ποσοστά των γεγονότων υπερμεθυλίωσης. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι όγκοι αυτοί παρουσιάζουν αντί σχετικά υψηλά ποσοστά ενεργοποίησης

FGFR3

μεταλλάξεων [20] και, ως εκ τούτου, ο συνδυασμός των δεικτών μεθυλίωσης και

FGFR3

μεταλλάξεις μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία για την ανίχνευση επιφανειακών όγκων σε ένα διαγνωστικό περιβάλλον [20], [43]. Περιορίσαμε την ανάλυσή μας σε ένα τύπο δείκτη (υπερμεθυλίωσης DNA) για να παρέχει μια συνεπή και συγκρίσιμα ποσοτικό μέτρο για την αξιολόγηση των δύο διαδικασιών για την προετοιμασία των διαγνωστικών κυττάρων (διήθηση και καθίζηση), η οποία ήταν ο κύριος σκοπός της μελέτης μας. Επιπλέον, απορρίπτεται ένα σχετικά μεγάλο αριθμό δειγμάτων (14%), λόγω της χαμηλής απόδοσης DNA, το οποίο θα μπορούσε να θέσει σε κίνδυνο την ποσοτική ανάλυση. Ωστόσο, αυτά τα δείγματα θα μπορούσαν επίσης να έχουν ποιοτικά ελεγχθεί για δείκτες μεθυλίωσης του DNA σε μιά διαγνωστική περιοχή.

Δεδομένου ότι έως 70% των ασθενών με μη διηθητικό καρκίνο της ουροδόχου κύστης θα βιώσουν υποτροπή, μη επεμβατικές εξετάσεις ούρων είναι πολύ επιθυμητές για την επιτήρηση της υποτροπής. Οι μισοί από τους ασθενείς στην ομάδα μας παρουσιάζονται με υποτροπιάζοντα όγκο, και σε αυτή την ομάδα, όπως για ασθενείς με πρωτογενείς όγκους, διήθηση των ούρων παρέχεται μία υψηλότερη ευαισθησία από καθίζηση (85% έναντι 78%). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η διήθηση των ούρων μπορεί επίσης να βελτιώσει τη διάγνωση της υποτροπής του καρκίνου της ουροδόχου κύστης, η οποία μπορεί να είναι ιδιαίτερα χρήσιμα ως επαναλαμβανόμενες όγκοι είναι συχνά μικρότερα και να ρίξει λιγότερα κύτταρα από πρωτοπαθείς όγκους. Παρ ‘όλα αυτά, η διαδικασία αυτή μπορεί να μην ανακουφίσει άλλους περιορισμούς της επιτήρησης επανάληψης μεθυλίωσης του DNA-based, συμπεριλαμβανομένου του υψηλού θετικού συντελεστή μεταξύ κυστεοσκόπηση-αρνητικών περιπτώσεων, η οποία μπορεί να προκληθεί από επιγενετικές μεταβολές της κανονικής-εμφανίζονται ουροθήλιο (επιγενετικών πεδίο ελάττωμα) [44], [ ,,,0],45].

Μια προφανής κρίσιμη παράμετρος για μέγεθος με βάση τον εμπλουτισμό των καρκινικών κυττάρων σε βιολογικά δείγματα είναι το μέγεθος των πόρων του φίλτρου. Στην ιδανική περίπτωση, οι πόροι θα πρέπει να είναι αρκετά μεγάλη για να αποκλείσει τα φυσιολογικά κύτταρα και αρκετά μικρό για να διατηρήσει τα κύτταρα του όγκου, λαμβάνοντας υπόψη την ικανότητα παραμόρφωσης των κυττάρων υπό πίεση. Προηγούμενες μελέτες με στόχο τον εμπλουτισμό σπάνιων CTCs στο αίμα με διήθηση βρεθεί ότι ένα φίλτρο μεγέθους πόρου 8 μm εξαντλημένο δείγματα 99,9% των λευκοκυττάρων ενώ διατηρεί 85-100% των κυττάρων καρκινώματος [25], [46]. Με ένα μεγαλύτερο μέγεθος πόρων (12-14 μm), λιγότερα λευκοκύτταρα αλλά επίσης σημαντικά λιγότερα κύτταρα καρκινώματος (μέχρι 18%) συγκρατήθηκαν στο φίλτρο [46]. Χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κομμάτι χαραγμένο φίλτρο πολυανθρακικού με μέγεθος πόρου 8 μm, η οποία είναι παρόμοια με τα φίλτρα που χρησιμοποιούνται σε αυτές τις προηγούμενες μελέτες, ήμασταν σε θέση να εμπλουτίσουν το κλάσμα των κυττάρων όγκου σε δείγματα ούρων.