Αφηρημένο

καρκίνοι της ουροδόχου κύστης δείχνουν συνήθως γενετικών ανωμαλιών στο φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάσης σηματοδότησης. Εδώ έχουμε διαλογή για μεταλλάξεις σε

PIK3R1

, το οποίο κωδικοποιεί p85α, μια από τις ρυθμιστικές υπομονάδες της ΡΙ3Κ. Διακόσιοι εξήντα τέσσερις όγκους της ουροδόχου κύστης και 41 κυτταρικές γραμμές όγκου κύστης σαρώθηκαν και ανιχνεύθηκαν 18 μεταλλάξεις. Δεκατρία μεταλλάξεις ήταν σε C-τελικές περιοχές και προβλέπεται να παρεμβαίνουν στην αλληλεπίδραση μεταξύ p85α και ρ110α. Πέντε μεταλλάξεις ήταν στην επικράτεια ΒΗ του PIK3R1. Αυτή η περιοχή έχει εμπλακεί σε ρ110α-ανεξάρτητους ρόλους του p85α, όπως δέσμευση και τροποποίηση των δραστηριοτήτων του ΡΤΕΝ, Rab4 και Rab5. Η έκφραση αυτών των μεταλλαγμένων μορφών BH-p85α στο ποντίκι εμβρυϊκών ινοβλαστών με p85α knockout έδειξαν ότι όλες οι μορφές, εκτός από τα περικομμένα μεταλλάγματα, θα μπορούσε να δεσμεύσει και να σταθεροποιήσει ρ110α αλλά δεν αύξησε τη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι μεταλλάξεις BH λειτουργούν ανεξάρτητα από ρ110α. Σε ένα πάνελ 44 ουροδόχου κύστης καρκινικές κυτταρικές σειρές, το 80% είχε μειωμένη έκφραση mRNA PIK3R1 σε σχέση με την κανονική ουροθηλιακό κύτταρα. Αυτό, μαζί με την μετάλλαξη του

PIK3R1

, μπορεί να τροποποιήσει BH λειτουργία τομέα. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι μεταλλαγμένες μορφές της p85α μπορεί να παίζει ένα ογκογόνο ρόλο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, όχι μόνο μέσω απώλεια της ικανότητα να ρυθμίζει ρ110α αλλά και μέσω αλλαγμένη λειτουργία του επικράτεια ΒΗ.

Παράθεση: Ross RL, Μπερνς JE, Taylor CF, Mellor P, Άντερσον DH, Knowles ΜΑ (2013) Προσδιορισμός μεταλλάξεων σε διαφορετικές περιοχές της ρ85 άλφα στον Καρκίνο ουροθηλιακά. PLoS ONE 8 (12): e84411. doi: 10.1371 /journal.pone.0084411

Επιμέλεια: Karl X Chai, University of Central Florida, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 30η, Σεπτεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 18 Νοέμβρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 18 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Ross et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οικονομική ενίσχυση που παρέχονται από το Yorkshire Cancer Research (https://yorkshirecancerresearch.org.uk/) (L362) και το Πανεπιστήμιο του Leeds MRC διδακτορικής (ΜΚ, RR), καναδική Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (http: //www.cihr-irsc.gc. ca /e /193.html) (MOP84277) (DA), και Saskatchewan Health Research Foundation Fellowship (https://shrf.ca/)(PM). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) μονοπατιού σηματοδότησης παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της κυτταρικής ανάπτυξης, πολλαπλασιασμού και της επιβίωσης [1] και οι μεταλλάξεις που οδηγούν σε ανώμαλη ενεργοποίηση του μονοπατιού που βρέθηκαν σχεδόν σε όλους τους τύπους Καρκίνος. Στο καρκίνωμα ουροθηλίου (UC) της κύστης, αρκετές γενωμικές αλλαγές που οδηγούν στην απορρύθμιση του μονοπατιού έχουν ταυτοποιηθεί. Αυτές περιλαμβάνουν την αδρανοποίηση μεταλλάξεις στο

PTEN

και

TSC1

και ενεργοποίηση μεταλλάξεων στο

PIK3CA

και

ΑΚΤ1

[2,3,4,5,6, 7,8]. Προηγουμένως δείξαμε ότι πολλά από αυτά τα γεγονότα δεν είναι περιττή, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μετάλλαξη περισσοτέρων του ενός μέλους του μονοπατιού μπορεί να έχουν προσθετική ή συνεργιστική αποτελέσματα [4]. Αυτές οι μεταβολές που βρέθηκαν τόσο στη χαμηλού βαθμού, μη επεμβατική και διηθητικό UC, υποδεικνύοντας ότι αυτή η οδός διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη UC και προτείνοντας ότι αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο σε αυτούς τους καρκίνους.

ΡΙ3 κινάσες φωσφορυλιώνουν τη θέση 3` επί του δακτυλίου ινοσιτόλης της φωσφινοσιτόλη-4,5-διφωσφορικής (ΡΙΡ2) για να δημιουργήσει το λιπίδιο δεύτερος αγγελιαφόρος φωσφινοσιτόλη-3,4,5-τριφωσφορική (ΡΙΡ3) που ενεργοποιεί ΑΚΤ κατάντη σηματοδότησης. Οι κατηγορίας ΙΑ PI3Kαis ένα υποχρεωτικό ετεροδιμερές που αποτελείται από το p110αcatalytic υπομονάδας (ρ110α), που κωδικοποιείται από το

PIK3CA

γονίδιο και μια ρυθμιστική υπομονάδα, που κωδικοποιείται από ένα από τα 3 γονίδια,

PIK3R1, PIK3R2

και

PIK3R3

. Οι ρυθμιστικές υπομονάδες είναι απαραίτητη για τη σταθερότητα της ρ110α και στην κατάσταση ηρεμίας καταστέλλουν καταλυτική δραστικότητα του [9]. Καθένα από αυτά έχει δύο περιοχές SH2 που μπορούν να δεσμεύονται ενεργοποιημένους υποδοχείς αυξητικού παράγοντα είναι δεσμευμένη σε μεμβράνη ή μόρια προσαρμογέα, μεταβάλλοντας διαμόρφωση της, ανακουφίζοντας την αναστολή της ρ110α και επιτρέποντας ρ110α να φωσφορυλιώνει ΡΙΡ2 [10].

Μεταλλάξεις του

PIK3R1

, κωδικοποίηση p85α, έχουν αναφερθεί σε ορισμένες μορφές καρκίνου. Σε μια λεμφώματος ποντικού που προκαλείται από Χ-ακτινοβόληση, μια κολοβωμένη (ρ65) μορφή που περιέχει μόνο τα αμινοξέα 1 έως 571 ταυτοποιήθηκε και φαίνεται να προσδώσει αυξημένη

in vitro

δραστικότητα κινάσης επί ρ110α [11]. Αυτή η κολοβωμένη μορφή p85α αργότερα αποδείχθηκε ότι δεν διαθέτουν την κρίσιμη μεταξύ SH2 (iSH2) περιοχής που απαιτείται για την αναστολή της δραστηριότητας ρ110α [12]. Μια παρόμοια ακρωτηριασμένη μορφή αναφέρθηκε στην κυτταρική γραμμή λεμφώματος ενός ανθρώπου του Hodgkin [13] και 4 μικρότερες διαγραφές, εντός εξώνια 14 ή 15, που κωδικοποιούν την περιοχή iSH2, σε καρκίνους των ωοθηκών και του παχέος εντέρου [14]. Ταυτοποιήθηκαν επίσης δύο μεταλλάξεις ματίσματος, οι οποίες οδήγησαν στην παράκαμψη του εξωνίου 15. Έκφραση μία από αυτές τις μεταλλαγμένες μορφές με μια διαγραφή του εξωνίου 13 είχε ως αποτέλεσμα συστατική ενεργοποίηση της οδού ΡΙ3Κ σε κύτταρα, παρέχοντας απόδειξη ότι μεταλλαγμένο ρ85 μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο στον καρκίνο του ανθρώπου. Μια διαγραφή 9 bp που περιλαμβάνει την σύνδεση εξονίου-ιντρονίου του εξονίου 12 [15] και 9 άλλες μεταλλάξεις, εκ των οποίων 8 ήταν στην περιοχή iSH2 εντοπίστηκαν σε γλοιοβλαστώματα [16] και 15 βρέθηκαν μεταλλάξεις σε καρκίνο του παχέος εντέρου, η πλειοψηφία των οποίων ήταν αποδειχθεί ότι μειώνουν ρ110α-ανασταλτική δράση της διατηρώντας παράλληλα την ικανότητα να σταθεροποιούν το σύμπλεγμα [17]. Μια ενιαία

PIK3R1

μετάλλαξη αναφέρθηκε πρόσφατα σε μια μελέτη του UC που προβλήθηκε εξόνια 12, 14 και 15, (& lt? 1% συχνότητα) [18]. Σε αντίθεση με αυτές τις χαμηλές συχνότητες μετάλλαξης, έχει πρόσφατα αναφερθεί ότι το 20 – 40% των ενδομητριοειδές ενδομητρίου καρκίνων περιέχει

PIK3R1

μεταλλάξεις, η πλειοψηφία στους τομείς nSH2 και iSH2 [19,20].

προηγούμενο εύρημα μας μεταλλάξεων σε διάφορα συστατικά του μονοπατιού PI3K στο UC, και η διαπίστωση της

PIK3R1

μεταλλάξεις σε άλλους τύπους καρκίνου, μας ώθησε να ψάξετε για μεταλλάξεις στο

PIK3R1

. Ως απόδειξη έχει προκύψει ότι η εν λόγω Ν-τελικές περιοχές του p85α έχουν ογκογόνο λειτουργίες, επιλέξαμε για τη διαλογή ολόκληρη την κωδικοποιητική αλληλουχία του

PIK3R1

, αντί να επικεντρώνεται στα εξώνια 12, 14 και 15. Εδώ αναφέρουμε μια σειρά από μεταλλάξεις στο UC-κυτταρικές γραμμές που παράγονται και πρωτογενείς όγκους UC, συμπεριλαμβανομένων διαγραφές στην περιοχή iSH2 και μια σειρά από μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος, αρκετές στην ομολογία σημείο διακοπής περιοχών συστάδων (BH) περιοχή, η οποία έχει δραστικότητα ΟΤΡάσης προς Rab5 [21] και μπορεί να δεσμεύσει ΡΤΕΝ [22,23]. Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι μεταλλαγμένες μορφές της p85α μπορεί να παίζει ένα ογκογόνο ρόλο στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης, όχι μόνο μέσω απώλεια της ικανότητα να ρυθμίζει ρ110α αλλά και μέσω αλλαγμένη λειτουργία του επικράτεια ΒΗ.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την Ανατολή επιτροπή δεοντολογίας Λιντς Ερευνών (99/156) και γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς.

δείγματα ασθενούς και Απομόνωση DNA

Cold βιοψίες φλιτζάνι 264 ουροθηλιακά καρκινώματα (UC) συλλέχθηκαν, καταψύχθηκαν ταχέως και αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο. Το υπόλοιπο του ιστού ενσωματωμένο σε παραφίνη για διαγνωστική αξιολόγηση. Ο πίνακας όγκου αποτελούνταν από 10 pTaG1, 42 pTaG2, 24 pTaG3, 7 pT1G1, 27 pT1G2, 57 pT1G3, 2 pT2G1, 13 pT2G2, 54 & gt? PT2G3, 5 G1, 8 G2 και 4 όγκους G3 χωρίς υποκείμενο στρώμα (ΡΤΧ) και 11 όγκους χωρίς πληροφορίες [24,25]. Όλα ήταν μεταβατικό καρκίνωμα. DNA εκχυλίζεται από κατεψυγμένα τμήματα και δείγματα φλεβικού αίματος όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4].

ουροθηλιακά κυτταρικές σειρές

Σαράντα τέσσερις κυτταρικές σειρές UC (253J, 5637, 639V, 647V, 92-1 , 94-10, 96-1, 97-1, 97-18, 97 – 24, 97-7, BC-3C, BFTC905, BFTC909, CAL29, DSH1, HT1197, ΗΤ1376, J82, JMSU1, JO’N, KU -19 έως 19, LUCC1, LUCC2, LUCC3, LUCC4, LUCC5, LUCC6, LUCC7, LUCC8, MGH-U3, RT112, RT4, scaber, SD, SW780, SW1710, Τ24, TCCSup, U-BLC1, UM-UC3, VM -CUB-1, VM-CUB-2 και VM-CUB-3) διερευνήθηκαν (Πίνακας S1). LUCC1-LUCC8 γραμμές δημιουργήθηκαν στο εργαστήριο των συγγραφέων από ιστούς όγκων της ουροδόχου κύστης που λαμβάνονται με τη γραπτή συγκατάθεση. ταυτότητα γραμμή κυττάρων πιστοποιήθηκε από σύντομες διαδοχικές πληκτρολογώντας επανάληψη DNA χρησιμοποιώντας Powerplex 16 κιτ (Promega). Προφίλ συγκρίθηκαν με δημόσια διαθέσιμα στοιχεία (ATCC, DSMZ) ή όπου δεν υπάρχει προφίλ αναφοράς ήταν διαθέσιμο, επιβεβαιώθηκαν ως μοναδική. DNA εκχυλίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4].

Μετάλλαξη ανάλυση

Η πλήρης κωδικοποιητική αλληλουχία του

PIK3R1

εξετάστηκε σε 18 θραύσματα από την υψηλή ανάλυση τήξη ανάλυση, όπως περιγράφεται [26 , 27]. DNA από αντίστοιχα δείγματα αίματος αναλύθηκε για να επιβεβαιώσει την κατάσταση σωματική μετάλλαξη. Οι αλληλουχίες εκκινητών δίνονται στον Πίνακα S2. Οι μεταλλάξεις καταγράφηκαν με αναφορά στα NM_181523.

PCR ειδικά δια αλλήλια (AS-PCR) διεξήχθη για να αποδείξει την φάση από τα ζεύγη των μεταλλάξεων στην κυτταρική γραμμή LUCC3 και σε δείγμα όγκου 2 (Πίνακας 1). Μία προς τα εμπρός εκκινητής σχεδιάστηκε για να ενισχύουν ειδικά το μεταλλαγμένο αλληλόμορφο στο 5` θέσης μετάλλαξης και αντιστοιχήθηκε με ένα αντίστροφο εκκινητή τοποθετημένη για να συμπεριλάβει τη δεύτερη μετάλλαξη στο προϊόν PCR (Πίνακας S3). Τα προϊόντα έτρεξαν σε ένα πήκτωμα αγαρόζης για τον εντοπισμό επιτυχούς ενίσχυσης από όγκο /κυτταρική σειρά DNA μόνο και χωρίς ενίσχυση από το αίμα και WT DNA. Τα προϊόντα της PCR ήταν αλληλουχία επαληθεύεται

Δείγμα

Βαθμός /στάδιο

εξόνιο

νουκλεοτιδικές αλλάξει

αλλαγή Προβλεπόμενη αμινοξύ

1TaG32

1c..409G & gt?. AE137K2TxG35c.652GT Ε218 * 6c.862ACK288Qintron 12c.1426-49 G & gt? Aunknown3T4G35c.710_727del18W237-Y242del4T1G35c.785GCR262T5TaG310

2c.1072CT R358 * 14c.1735_1740del6Q579-Y580del6T1G3 11c.1131TGN377K7TaG312c.1322ATN441I8T1G113c.1441ATR481W

3LUCC3 T2G313 c.1519GC E507Q 14c.1670GCR557P9T2G313c.1552GCE518Q10T1G314c.1585GAD529N11TaG214c.1696_1734del39I566-D578del12T1G216c.1934CTT645I13TaG2Exon 17 ματίσματος acceptorc.1986-1 G & gt? Cunknown Πίνακας 1. Οι μεταλλάξεις στο PIK3R1 εντοπιστεί σε όγκους της ουροδόχου κύστης και κυτταρικές σειρές

ακολουθία αναφοράς 1cDNA:. NM_181523?

2 μετάλλαξης σε μόνο ένα μικρό πληθυσμό των αλληλουχιών?

3cell γραμμή. CSV Λήψη CSV

Οι φορείς έκφρασης και μεταγωγή των κυτταρικών σειρών

Κλωνοποίηση ένθετα που κωδικοποιεί το πλήρους μήκους αγρίου τύπου (WT) ανθρώπινη p85α και βοοειδών p85α R274A μεταλλαγμένο σε pGEX-6P (GE Healthcare Life Sciences) έχει περιγραφεί [21]. Μεταλλάξεις E137K, R162 *, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q δημιουργήθηκαν με κατευθυνόμενη σε θέση μεταλλαξογονία χρησιμοποιώντας τη μέθοδο QuikChange (Stratagene, CA, USA) και κλωνοποιήθηκε σε pFB Hyg [28] εντός πλαισίου με ένα Ν-τερματικό ετικέτα ΗΑ χρησιμοποιώντας την μέθοδο έγχυσης (Clontech, CA, USA).

Έλεγχος cDNAs, N564D και p85Δ, έγιναν ευγενώς από την Genentech [17] και υποκλωνοποιήθηκε σε pFB Hyg με την ίδια μέθοδο. Όλα τα πλασμίδια αλληλουχία επαληθευτεί. Τα κατασκευάσματα επιμολύνθηκαν σε κύτταρα Φοίνιξ Α χρησιμοποιώντας TransIT 293 (Mirus, Madison, USA). Mouse εμβρυϊκών ινοβλαστών (ΠΜΑ) με νοκ-άουτ από p85α, β, δ (ένα είδος δώρο από τον Lewis Cantley, Harvard Medical School), ΝΙΗ3Τ3 ινοβλάστες ποντικού και RAT 1 ινοβλάστες αρουραίου, επωάστηκαν με ρετροϊικό υπερκείμενο που περιέχει 8 μg /ml polybrene και επιλέγονται με 500 , 200 και 250 μg /ml υγρομυκίνη, αντίστοιχα.

Λειτουργικός χαρακτηρισμός των μεταλλακτών επικράτεια ΒΗ

τα κύτταρα λύθηκαν και η πρωτεΐνη εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας Αντιδραστήριο Λύσης CelLytic κυττάρων θηλαστικών (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών και ποσοτικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29]. Αντι-ΗΑ Ανοσοκαταβύθιση Kit (Sigma-Aldrich) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών για πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης. Ανοσοστυπώθηκαν πρωτεΐνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα? αντι-p85α (Abcam, Cambridge, UK), αντι-ρ110α, αντι-ρΑΚΤ (Ser473), αντι-panAKT (Cell Signaling Technology, Boston, UK) και αντι-τουμπουλίνης άλφα (Abd Serotec, Kidlington, Oxford, UK). Bound πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας συζευγμένα με HRP δεύτερα αντισώματα και Luminata Forte Western HRP Substrate (Millipore, Watford, UK). Anchorage-ανεξάρτητη ανάπτυξη διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [29] και οι αποικίες με διάμετρο ≥50 μm μετρήθηκαν εντός 2,5 mm

2.

Ανάλυση PIK3R1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης σε UC

δεδομένα έκφρασης PIK3R1 mRNA για 105 δείγματα όγκων της ουροδόχου κύστης και 52 φυσιολογικά δείγματα ουροδόχου κύστης που αναφέρθηκαν από Sanchez Carbayo-et al έχουν πρόσβαση [30]. έκφραση της πρωτεΐνης PIK3R1 εκτιμήθηκε σε 44 κυτταρικές σειρές UC και συγκεντρωμένα φυσιολογικά ανθρώπινα κύτταρα ουροφόρων (NHU-pool) από Western και ομαλοποιημένη να τουμπουλίνης.

Αποτελέσματα

Αναγνώριση των σωματικών

PIK3R1

μεταλλάξεις

Θα προβληθεί ολόκληρη την αλληλουχία κωδικοποίησης του

PIK3R1

για μεταλλάξεις σε 264 καρκινικούς ιστούς UC και 41 κυτταρικές σειρές UC. Οι τρεις γνωστές ισομορφές της PIK3R1, p85α p55α και p50α περιέχουν διαφορετικά εξώνια. Τα εξόνια 1-6 είναι μοναδικές για p85α, το εξόνιο 7 είναι παρούσα μόνο σε p50α και εξόνιο 8 μόνο σε p55α. Τα εξόνια 9-17 είναι παρόντες σε όλες τις ισομορφές αλλά η χρήση μιας απόκρυφης θέσης ματίσματος στο εξώνιο 16 οδηγεί στην δημιουργία cDNAs που διαφέρουν σε μήκος από 8 κωδικόνια [31], και τα δύο εκ των οποίων καλύπτονται από αυτήν την οθόνη. Δεκαοκτώ μεταλλάξεις ταυτοποιήθηκαν σε 13 όγκους. Ένας όγκος (όγκος 2) περιείχε τρία και ένα (όγκος 5) περιείχε δύο μεταλλάξεις (Πίνακας 1). Όλα επιβεβαιώθηκαν ως σωματικές μεταλλάξεις από την παρουσία τους στον όγκο που προέρχεται από DNA αλλά όχι στο αίμα του ασθενούς. Ένας όγκος που προέρχεται από κυτταρική σειρά (LUCC3) περιείχε δύο μεταλλάξεις και αυτά επιβεβαιώθηκαν επίσης ως σωματικά προέλευσης. Όλες οι μεταλλάξεις επιβεβαιώθηκαν με επαναλαμβανόμενες ενισχύσεις PCR για να αποκλείσει αντικείμενα PCR. Η φύση και η κατανομή των μεταλλάξεων φαίνονται σε σχέση με p85α δομή της πρωτεΐνης στο Σχήμα 1. Πέντε βρίσκονταν στην επικράτεια ΒΗ (Σχήμα S1). Καμία δεν ήταν σε εξώνια που είναι μοναδικές για p50α ή p55α, αν και αρκετές βρίσκονταν στα εξόνια 2, 5 και 6, που είναι μοναδικές για p85α. Δεν μεταλλάξεις που εντοπίζονται στην περιοχή του εξονίου 16 που εναλλακτικά ματισμένες.

Η

αλληλόμορφο-ειδική PCR (AS-PCR) χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί εάν οι δύο μεταλλάξεις στην κυτταρική σειρά LUCC3 (c.1519GC και c.1670GC? E507Q και R557P) και οι 2 εξονική μεταλλάξεις στο όγκου 2 (c.652GT και c.862AC? E218 * και K288Q) ήταν παρόντες στο

cis

ή

trans

. Σε LUCC3, μετάλλαξη ειδικό εκκινητή για c.1519C ενισχυμένο με επιτυχία ένα προϊόν PCR από το εξώνιο 13 μέχρι 14 (Σχήμα S2A). Αλληλούχιση του προϊόντος αυτού επιβεβαίωσε την παρουσία c.1670C μετάλλαξης, υποδεικνύοντας ότι και οι δύο μεταλλάξεις της περιοχής iSH2 βρίσκονται στο ίδιο αλληλόμορφο. AS-PCR ανάλυση του όγκου 2 επιβεβαίωσε επίσης ότι οι 2 εξονικό μεταλλάξεις (BH Ε218 τομέα * και μεταλλάξεις K288Q) ήταν παρόντες στο ίδιο αλληλόμορφο (Σχήμα S2B).

Σε όγκου 5, προφίλ αλληλουχίας έδειξε ότι μία από τις μεταλλάξεις (R358 *) ήταν παρούσα, καθώς μόνο ένα μικρό πληθυσμό των μορίων, ενώ ο άλλος (Q579_Y580del) εμφανίστηκε ετερόζυγο. Η γονιδιωματική απόσταση μεταξύ εξονίων 10 και 14 απέκλειαν ανάπτυξη ενός προσδιορισμού PCR συγκεκριμένου αλληλόμορφου για να καθοριστεί εάν αυτές οι μεταλλάξεις ήταν στο ίδιο αλληλόμορφο. Το μικρό σήμα από το R358 * μετάλλαξη μπορεί να υποδεικνύει ότι ήταν παρούσα ως μόνο μια μικρή υπο-κλωνική εκδήλωση. Αυτό φάνηκε να είναι η περίπτωση, όπως η ανάλυση του ιστού από ένα επόμενο υποτροπή της νόσου στον ασθενή αυτό έδειξε μόνο Q579_Y580del.

Προβλεπόμενη Επίδραση μεταλλάξεων επί της λειτουργίας των πρωτεϊνών

Οι θέσεις των εσφαλμένης διευθύνσεως μεταλλαγμένα κατάλοιπα τα οποία εκπροσωπούνται στο διαθέσιμο κρυσταλλική δομή φαίνονται στο Σχήμα 2. Δύο μεταλλάξεις, R358 * και N377K, εντοπίστηκαν στον τομέα nSH2. Πρόσφατα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η περιοχή αυτή του p85α δρα ως ένα ικρίωμα για την ρ110α – p85α συγκρότημα, με αλληλεπιδράσεις με C2, ελικοειδείς και πεδία κινάσης των ρ110α και με p85α iSH2 [32]. R358 * περικόπτει την πρωτεΐνη στη θέση nSH2 φωσφοπεπτιδίου δέσμευσης (FLVRDAS). Αυτή η ίδια μετάλλαξη αναφέρθηκε πρόσφατα σε 5 ενδομητρίου δείγματα καρκίνου όπου αντιπροσώπευε το 5% του συνόλου των μεταλλάξεων που προσδιορίζονται [20]. Η αργινίνη 358 έχει ταυτοποιηθεί ως σχηματίζοντας μια γέφυρα άλατος με E542 σε ρ110α [32] και της μηχανικής μετάλλαξη R358A δείχθηκε να καταργήσει δεσμευτικός φωσφοπεπτιδίου [9]. Έτσι, η απώλεια του R358 και περικοπή σε αυτό το σημείο είναι πιθανό να οδηγήσει σε διαταραχή της δέσμευσης φωσφοπεπτιδίου και την αλληλεπίδραση του p85α με την ελικοειδή περιοχή του ρ110α και μπορεί να μιμούνται την επίδραση της ρ110α ελικοειδούς μεταλλάξεις της περιοχής. Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι τα ελικοειδή μεταλλάξεις τομέα E542K και E545K είναι μακράν οι πιο κοινές μεταλλάξεις που βρέθηκαν στο

PIK3CA

στον καρκίνο της ουροδόχου κύστης [4] και είναι πιο ισχυρό από H1047R στην επαγωγή σηματοδότησης κατάντη της ΑΚΤ και τον πολλαπλασιασμό σε συρροή και κάτω από συνθήκες θρεπτικού εξάντληση όταν εκφράζεται σε φυσιολογικά κύτταρα urothelial [29]. Δεδομένου ότι η κολόβωση μεταλλαγμένο R358X αφαιρεί τις δύο περιοχές iSH2 και cSH2 της πρωτεΐνης, την αλληλεπίδραση με τον τομέα C2 του ρ110α χάνεται και επιδράσεις μπορεί να μιμούνται αυτές που περιγράφονται για μεταλλάξεις και αποκοπές που επηρεάζουν αυτές τις περιοχές [33]. Από δεδομένα προσδιορισμού αλληλουχίας, και η γνώση ότι υπήρχε ελάχιστη μολυσματική φυσιολογικό ιστό στο δείγμα, αυτή η μετάλλαξη φαίνεται να είναι ετερόζυγο. Έτσι προβλέπεται ότι εκτός από την κολοβωμένη πρωτεΐνη, μη μεταλλαγμένης πρωτεΐνης ήταν διαθέσιμη για ρ110α δεσμευτικός και σταθεροποίηση σε αυτόν τον όγκο.

Α. διάγραμμα κορδέλας της δομής του συμπλέγματος της ρ110α με την περιοχή niSH2 της p85α (κωδικός ΠΣΠ 2RD0) δείχνει υπολείμματα μεταλλαχθεί σε UC. B. Σχέση p85α nSH2 να ρ110α C2 παρουσίαση τομέα εγγύτητα N377 στο nSH2 σε υπόλειμμα τομέα C2 E365. Γ Σχέση του τομέα iSH2 της p85α με τον τομέα C2 της ρ110α δείχνει την εγγύτητα της R557 για N345 στο C2. Δ Space-γέμισμα μοντέλο δείχνει τα υπολείμματα R481 και R557 σε iSH2 της p85α σε επαφή με το C2 του ρ110α. E. Δομή του ρ85 διμερές (κωδικός ΠΣΠ 1PBW) που δείχνει τη θέση της PIK3R1 σημείο μεταλλαγμένα υπολείμματα E137, R262 και Κ288 και η περιοχή διαγραφεί (W237-Y242) στο UC σε σχέση με τα υπολείμματα που εμπλέκονται στην ρ85 διμερισμό (M176, σκούρο πράσινο /φως κυανό? L161, I177 και V181, ανοιχτό πράσινο /κυανό). Η θέση του καταλοίπου R274 (ματζέντα), η οποία εμπλέκεται σε δραστικότητα Rab-GAP δείχνεται επίσης. Επιπλέον, οι τρεις υπολείμματα γλουταμικού οξέος (E266, E284 και E291) που αλληλεπιδρούν με R262 υποδεικνύεται, με E291 επίσης αλληλεπιδρούν με Κ288.

Η

N377, η οποία μεταλλάχθηκε σε λυσίνη, βρίσκεται δίπλα στο G376, το οποίο βρέθηκε προηγουμένως για να μεταλλαχθεί προς αργινίνη σε 3 περιπτώσεις γλοιοβλαστώματος [16,34]. Και τα δύο υπολείμματα είναι μέσα σε μια περιοχή (374-377) που προβλέπεται να αλληλεπιδρούν με τα κατάλοιπα 364-371 στην περιοχή C2 του ρ110α [32]. Στην κρυσταλλική δομή του ρ110α σε σύμπλοκο με p85niSH2, τόσο G376 και N377 είναι εντός απόστασης σύνδεσης υδρογόνου της E365 σε ρ110α C Σχήμα 2Β.

Έξι νοηματικές μεταλλάξεις και δύο διαγραφές εντός πλαισίου εντοπίστηκαν στον τομέα iSH2. Αυτή είναι η περιοχή όπου η πλειοψηφία των μεταλλάξεων έχουν βρεθεί σε άλλους καρκίνους, αν και κανένας από τους αλλοιώσεις που βρέθηκαν εδώ είναι πανομοιότυπες με εκείνες που αναφέρθηκαν προηγουμένως [14,16,17,19,20]. Αυτή η περιοχή της πρωτεΐνης εμπλέκεται στην αλληλεπίδραση με την περιοχή προσαρμογέα-σύνδεση του ρ110α και τη σταθεροποίηση και την αναστολή της καταλυτικής δραστικότητας του στην βασική κατάσταση μέσω αλληλεπίδρασης με τον τομέα C2. Η προβλεπόμενη επίδραση κάποιων μεταλλάξεων σε iSH2 είναι να διαταράξει τη διασύνδεση με ρ110α C2 [16,33]. Για παράδειγμα, p85α υπόλειμμα, N564, βρίσκεται σε κοντινή απόσταση δεσμών υδρογόνου του N345 σε ρ110α C2 (Σχήμα 2C), ένα υπόλειμμα που έχει βρεθεί μεταλλαχθεί σε ρ110α [35]. D560Y αναφερθεί σε γλοιοβλάστωμα [16] Είναι επίσης σε κοντινή απόσταση με δεσμούς υδρογόνου του N345 και οι δύο από αυτές προβλέπεται ως εκ τούτου να μιμηθούν το ογκογόνο μετάλλαξη N345. Εδώ βρήκαμε μια νέα μετάλλαξη, R557P που είναι επίσης κοντά στο N345 της ρ110α (Σχήμα 2C). R481, το οποίο βρέθηκε μεταλλάχθηκε σε τρυπτοφάνη, είναι επίσης πολύ κοντά στην περιοχή C2 του ρ110α Εικόνα 2D).

Οι δύο διαγραφές εντός πλαισίου που προσδιορίζονται στο iSH2 (I566_D578del και Q579_Y580del) απομάκρυνση των καταλοίπων αμινοξέων τα οποία έχουν βρέθηκε να διαγραφεί ωοθηκών και του παχέος εντέρου [14,17] και γλοιοβλαστώματος [16] και προβλέπεται να διαταράξει την ελικοειδή δευτερεύουσα δομή σε αυτή την περιοχή και να διαταράσσουν την αλληλεπίδραση με ρ110α C2. Η Q579_Y580del μετάλλαξη έχει αναφερθεί να δεσμεύει και να σταθεροποιήσει ρ110α αλλά έχουν μειωμένη ικανότητα να ρυθμίζει τη δράση κινάσης των λιπιδίων του p85α ρ110α ολοένζυμο [17]. Πρόσφατα, εννέα από τις μεταλλάξεις nSH2 και iSH2 βρέθηκαν σε άλλους καρκίνους εκφράστηκαν σε ινοβλάστες εμβρύου κοτόπουλου και όλων των επαγόμενη μεταμόρφωση, που μετράται με δραστικότητα εστίαση σχηματισμού, αυξημένο πολλαπλασιασμό και την ενισχυμένη σηματοδότηση μέσω ΡΙ3Κ [36]. Ειδικά οι αναστολείς της ρ110α, αλλά όχι αναστολείς της ρ110β ρ110γ, ή ρ110δ καταργηθούν τα φαινοτυπικά αποτελέσματα δύο από αυτές τις μεταλλαγμένες μορφές που προέρχονται από όγκους (KS459delN, DKRMNS560del), υποδεικνύοντας ότι η ογκογόνο δράση αυτών των μεταλλάξεων είναι μοναδικά διαμεσολαβείται από ρ110α.

Ο πλέον Ν-τερματική μετάλλαξη iSH2 προσδιοριστεί, N441I, είναι σε μια περιοχή συνδετήρα μεταξύ nSH2 και iSH2, και βρίσκεται κοντά στο τέλος της δεύτερης άλφα έλικα iSH2. Αυτή η περιοχή δεν έχει επιλυθεί στις δημοσιευμένες κρυσταλλικές δομές και το δυναμικό αποτέλεσμα της δεν είναι σαφής. T654I στον τομέα cSH2 είναι κοντά σε πολλά υπολείμματα που είναι μεταλλαγμένα σε καρκίνους του παχέος [17] και είναι αμέσως δίπλα στο μοτίβο FLVRES (υπολείμματα 646-651) που απαιτείται για την εμπλοκή της φωσφοτυροσίνης. Ένα κατάλοιπο σερίνη ή θρεονίνη σε αυτή τη θέση βρίσκεται στις περιοχές SH2 από ένα ευρύ φάσμα των πρωτεϊνών. Ορισμένες μεταλλάξεις εντός αυτής της περιοχής έχουν αναφερθεί σε καρκίνους του παχέος [17], αλλά όχι σε γλοιοβλάστωμα [16,34], αυξάνοντας την πιθανότητα ότι μπορεί να υπάρχουν ειδικές διαφορές ιστών.

Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε πέντε μεταλλάξεις εντός της BH τομέας του PIK3R1 (28% των μεταλλάξεων βρέθηκε) (Σχήμα 1? Σχήμα S1). Προηγούμενες οθόνες μετάλλαξη έχουν εντοπιστεί μόνο επτά μεταλλάξεις στην περιοχή αυτή (K142fs, E160 *, R162 *, I177N, E217K, N285H, E297K) σε περισσότερα από 1550 δείγματα άλλων όγκων έχουν αναφερθεί μέχρι σήμερα [14,16,17,18,19, 20,34] (& lt? 0,5%). Όλα νοηματικές μεταλλάξεις σε αυτήν την περιοχή (E137K, R262T και K288Q) είναι σε υψηλά διατηρημένα υπολείμματα (σχήμα S3). Η δομή αυτής της περιοχής της πρωτεΐνης (αμινοξέα 105-319) σαν ένα ομοδιμερές έχει αναφερθεί [37]. Η διεπαφή μεταξύ περιοχών ΒΗ δείχθηκε να περιλαμβάνει αλληλεπίδραση του M176 από ένα μονομερές με L161, I177 και V181, αφετέρου. Οι τρεις μεταλλάξεις σημείου και διαγραφής εντοπιστεί εδώ είναι απομακρυσμένη από την περιοχή αυτή της αλληλεπίδρασης (Σχήμα 2Ε).

μεταλλάξεις τομέα P85α BH αλληλεπιδράσουν με και να σταθεροποιήσει ρ110α

Για να προσδιορίσετε αν μεταλλαγμένες πρωτεΐνες επικράτεια ΒΗ έχουν ρ110α αποτελέσματα που εξαρτώνται, ελέγξαμε την ικανότητά τους να αλληλεπιδρούν με και σταθεροποιούν ρ110α. p85α, β δ νοκ-άουτ (παν-ρ85 null) MEFs μετήχθησαν με ρετροϊικούς φορείς έκφρασης που κωδικοποιούν Ν-άκρο ΗΑ-tagged p85α cDNA που κωδικοποιεί τις μεταλλαγμένες μορφές επικράτεια ΒΗ προσδιορίζονται στο UC (E137K, E218 *, Δ237_242, R262T, K288Q), άλλα μεταλλαγμένες μορφές ως έλεγχοι (R162 *, p85Δ, R274A βοοειδών, N564D), άγριου τύπου (WT) ή κενό φορέα. R162 * μεταλλαγμένο p85α είναι μια BH μετάλλαξη τομέα προηγουμένως ταυτοποιηθεί στον καρκίνο [17] και σαν p85Δ στερείται της περιοχής πρόσδεσης ρ110α (n-iSH2) [38]. Και τα δύο έχουν προηγουμένως δείξει ότι δεν αλληλεπιδρούν με ρ110α [17]. N564D iSH2 μεταλλαγμένο p85α χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος όπως έχει προηγουμένως δειχθεί ότι δεσμεύουν ρ110α, αυξάνουν ΡΙ3Κ και δραστικότητα ΑΚΤ, και να επάγουν κυτταρική επιβίωση, ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη και φαινοτύπους μετασχηματισμού που σχετίζονται με τα οποία ήταν P110-εξαρτώμενη [17]. Είναι επίσης χρησιμοποιείται εδώ για να αξιολογεί τις πιθανές διαφορές μεταξύ BH και iSH2 μορφές μεταλλαγμένων τομέα της ρ85. R274A είναι ένα κατασκευασμένο επικράτεια ΒΗ μεταλλαγμένη μορφή της p85α βοοειδών που έχει προηγουμένως δειχθεί ότι αναστέλλει δραστικότητα ρ85-GAP και ήταν ογκογόνο [21,39].

Η έκφραση της p85α επιβεβαιώθηκε με στύπωση western (Σχήμα 3Α). Μια κολοβωμένη πρωτεΐνη p85α ήταν ορατή στο R162 * -MEF (18 kDa), αλλά στο Ε218 * -MEF, η κολοβωμένη πρωτεΐνη (24 kDa) εκφράστηκε σε πολύ χαμηλό επίπεδο. Τρεις ανεξάρτητες μεταγωγές με * ιός Ε218 επαγόμενη σταθερά χαμηλή έκφραση της πρωτεΐνης προτείνοντας ότι αυτή η πρωτεΐνη μπορεί να είναι ασταθής. Είναι ενδιαφέρον, R162 * -MEF εξέφρασε επίσης μια μικρή ποσότητα πρωτεΐνης p85α πλήρους μήκους.

Α. Ανοσοστύπωμα δείχνει p85α επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης σε μεταγόμενα κύτταρα. Β Συν-ανοσοκαταβύθιση του ΗΑ-tagged πρωτεΐνες που ακολουθείται από ανοσοστύπωμα με p85α και ρ110α για τον προσδιορισμό δέσμευσης ρ85-ρ110. Γ ανοσοκηλιδώσεως ανάλυση σηματοδότησης ΡΙ3Κ (επίπεδα του ρΑΚΤ (Ser473)) σε μέσο που περιέχει ορό και ραβδόγραμμα εμφανίζει την ποσοτικοποίηση των κανονικοποιημένων ρΑΚΤ στο σύνολο των ΑΚΤ σχέση με το μάρτυρα. Δ ανοσοκηλίδας ανάλυση των ρΑΚΤ (Ser473) σε μέσο που περιέχει ορό και ιστόγραμμα εμφανίζει την ποσοτικοποίηση των κανονικοποιημένων ρΑΚΤ στο σύνολο των ΑΚΤ σχέση με το μάρτυρα.

Η

Pan-p85 null ΠΜΑ έχουν χαμηλά επίπεδα ρ110α, η οποία μπορεί να αποκατασταθεί με την έκφραση του άγριου-τύπου p85α [40]. Επιβεβαιώσαμε αυτό και έδειξε ότι όλες οι μεταλλαγμένες μορφές εκτός Ε218 *, R162 * και p85Δ είχε το ίδιο αποτέλεσμα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συν-immunopreciptation του ΗΑ-tagged πρωτεΐνες ρ85 χρησιμοποιήθηκε για την εκτίμηση ρ110α δέσμευσης (Σχήμα 3Β). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλες οι πρωτεΐνες p85, εκτός E218 *, R162 * και p85Δ, θα μπορούσε να δεσμεύσει ρ110α.

BH και iSH2 μεταλλάξεις τομέα της p85α δείχνουν διαφορετικά αποτελέσματα στην ενεργοποίηση ΑΚΤ και αγκύρωση-ανεξάρτητη ανάπτυξη

p85α C-τερματικό μορφές μεταλλαγμένο τομέα που επηρεάζουν ρ110α δραστηριότητα συνήθως έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της ΑΚΤ. Αυτό έχει αποδειχθεί για αρκετές μεταλλάξεις p85α που μπορούν να δεσμεύονται ρ110α [17,19,20]. Σε τηγάνι-ρ85 null ΠΜΑ ανασυσταθεί με άγριου τύπου και μεταλλαγμένες μορφές του p85α, διαπιστώσαμε ότι μόνο το μεταλλαγμένο N564D προκαλούμενη αύξηση των επιπέδων της φωσφο-ΑΚΤ (Ser473) και οι δύο σε μέσο που περιέχει ορό (Σχήμα 3C), και σε συνθήκες ορού -deprivation (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτό παρατηρήθηκε επίσης σε ΝΙΗ3Τ3 που εκφράζουν άγριου τύπου και μεταλλαγμένες μορφές του p85α όταν διατηρούνται σε συνθήκες άνευ ορού συμπληρωμένο (Σχήμα 3D). Αυτό είναι σύμφωνο με το προηγούμενο εύρημα σε ΝΙΗ3Τ3 ότι βοοειδή R274A δεν επηρεάζει την φωσφορυλίωση των ΑΚΤ μετά από διέγερση με PDGF [21]. Η τάση αυτή αντικατοπτρίζεται στα ποσοστά πολλαπλασιασμό των κυττάρων MEF και ΝΙΗ3Τ3 όταν διατηρούνται σε μέσο που περιέχει ορό και κατά την αξιολόγηση ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων ΝΙΗ3Τ3 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ανάλυση ανεξάρτητη από προσκόλληση ανάπτυξη των κυττάρων RAT 1 που εκφράζουν άγριου τύπου και μεταλλαγμένες μορφές του p85α έδειξε ότι, ενώ μεταλλάκτες επικράτεια ΒΗ επάγεται κάποιο σχηματισμό αποικίας σε σχέση προς άγριου τύπου p85α, N564D είχε το μεγαλύτερο αποτέλεσμα (Σχήμα S4).

Σχέση με άλλες μεταλλάξεις στα γονίδια μονοπάτι PI3K

Προηγουμένως εξετάσαμε τα δείγματα που αναλύθηκαν εδώ για

PIK3CA

μετάλλαξη [[4] και αδημοσίευτα στοιχεία]. Μόνο δύο δείγματα περιείχαν και τα δύο

PIK3R1

και

PIK3CA

(E545K) μεταλλάξεις και μία από αυτές ήταν ο όγκος που είχε μια μετάλλαξη επικράτεια ΒΗ (E137K) στο

PIK3R1

. Συνολικά, 61 από τους όγκους προβληθεί περιέχει

PIK3CA

μεταλλάξεις (23%). Έτσι,

PIK3CA

μετάλλαξη υποεκπροσωπούνται στο υποσύνολο που είχε

PIK3R1

μετάλλαξη (1 παρατηρηθεί? 5 αναμενόμενο). Έτσι,

PIK3R1

δεν μεταλλάξεις στον τομέα BH φαίνεται να είναι αμοιβαία αποκλειόμενα με το

PIK3CA

μετάλλαξη στο UC. Δεν υπήρχε σημαντική σχέση του

PIK3CA

ή

PIK3R1

μετάλλαξη με το βαθμό του όγκου ή του σταδίου. Τέσσερα από τα δείγματα που περιέχουν

ΑΚΤ1

μεταλλάξεις (E17K), κανένα από τα οποία συνυπήρχαν με

PIK3R1

μετάλλαξη.

TSC1

κατάσταση μετάλλαξης είναι γνωστή για 148 όγκους στη σειρά, εκ των οποίων 14 περιέχουν μια μετάλλαξη [4]. Ένας από αυτούς τους όγκους είχαν μια μετάλλαξη στο πεδίο BH του

PIK3R1

(W237_Y242del). Ωστόσο, το μέγεθος του δείγματος και η μετάλλαξη συχνότητες είναι πάρα πολύ μικρό για οποιαδήποτε σημαντική σύμπτωση ή αμοιβαία αποκλειστικότητα να εντοπιστούν.

έκφραση PIK3R1 μειώνεται στο UC και κυτταρικές σειρές

Όπως μεταλλάξεις p85α μπορεί να τροποποιήσει πρωτεΐνης: πρωτεΐνη αλληλεπιδράσεις των p85α, μερικά από τα οποία, ιδιαίτερα εκείνων στον τομέα BH, μπορεί να υποδεικνύουν ένα ρόλο καταστολέα όγκων , θεωρήσαμε το ενδεχόμενο προς τα κάτω ρύθμιση της πρωτεΐνης θα μπορούσε να συμβάλει στην ανάπτυξη των όγκων.

PIK3R1

βρίσκεται στο χρωμόσωμα 5 (5q13.1). Απώλεια ετεροζυγωτίας (ΑΕ) και τον αριθμό αντιγράφων απώλεια αλληλουχιών επί 5q έχουν παρατηρηθεί σε καρκίνο της ουροδόχου κύστης [41,42]. Με array CGH έχουμε διαπιστώσει ότι το 29% των μυών επεμβατική UC έχουν απώλεια αριθμό αντιγράφων στην περιοχή του

PIK3R1

[43]. Εξέταση των δημοσίως διαθέσιμα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση UC έχει μια σημαντική μείωση στην έκφραση PIK3R1 στο επίπεδο RNA (Σχήμα 4Α).

Α. Ανάλυση της p85α επιπέδων έκφρασης mRNA σε 105 δείγματα όγκων της ουροδόχου κύστης και 52 φυσιολογικά δείγματα της ουροδόχου κύστης. Δεδομένα από Sanchez-Carbayo et al [30]. B. Η ποσοτική ανάλυση των p85α ανοσοκηλιδώ δείγματα πρωτεΐνης από κυτταρικές σειρές καρκίνου της ουροδόχου κύστης κανονικοποιημένη να τουμπουλίνης και εμφανίζονται σε σχέση με το συγκεντρωμένο φυσιολογικό ανθρώπινο ουροφόρων κύτταρα (NHU-pool).

Η

Εμείς αξιολογούνται p85α έκφραση της πρωτεΐνης σε 44 κυττάρων UC γραμμές χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western. Αυτό αποκάλυψε μεγάλη ποικιλία ως προς τα επίπεδα έκφρασης με την πλειοψηφία των κυτταρικών σειρών (80%) παρουσιάζει μειωμένους p85α έκφραση πρωτεΐνης σε σύγκριση με φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα ουροδόχου κύστης (Σχήμα 4Β).

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη βρήκαμε

PIK3R1

μεταλλάξεις στο 4,9% του UC. Η υψηλότερη συχνότητα που βρέθηκαν εδώ από ό, τι στην προηγούμενη μελέτη του UC [18] εκφράζει εκτίμηση μας ολόκληρου του γονιδίου και όχι μόνο εξώνια 12, 14 και 15. Τα δεδομένα μας για τις τρεις αυτές εξώνια αποκάλυψε 5 μεταλλάξεις (1,8% των όγκων), συμβατό με Αυτή η προηγούμενη μελέτη. Η πλειονότητα των μεταλλάξεων βρίσκεται στην Ο-τερματική περιοχή του p85α παρόμοια με τα ευρήματα σε άλλους ανθρώπινους καρκίνους [14,16,17,19,20]. Οι μεταλλάξεις εντοπίστηκαν στις περιοχές nSH2 και iSH2 μπορεί να μιμούνται την επίδραση των μεταλλάξεων ρ110α ανακουφίζοντας την ανασταλτική ρύθμιση της ρ110α με p85α και την ογκογόνο δράση αυτών των μεταλλάξεων φαίνεται να ρ110α εξαρτώμενη [36].

Είναι ενδιαφέρον, βρήκαμε μια υψηλότερη συχνότητα μεταλλάξεων επικράτεια ΒΗ σε σύγκριση με προηγούμενες οθόνες μετάλλαξη. Είτε αυτό είναι ειδικά για UC δεν είναι ακόμη σαφής, λόγω της εστίασης πολλών μελετών μόνο για την ρ110α -interacting περιοχή του γονιδίου. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η περιοχή BH μεταλλαγμένες μορφές της p85α μπορεί να μεταβάλλει τη σταθερότητα του PTEN [20]. p85α συνδέεται με μη φωσφορυλιωμένα ΡΤΕΝ εντός του αντίστοιχου συμπλόκου υψηλού μοριακού βάρους ΡΤΕΝ (PAC) [22]. Αυτή η αλληλεπίδραση περιλαμβάνει την Ν-τερματική περιοχή της ρ85 (SH3-BH) και έχει δειχθεί να ρυθμίζει θετικά την δραστικότητα των λιπιδίων κινάσης του ΡΤΕΝ σε παράγοντα-εξαρτώμενο τρόπο ανάπτυξης [23]. Έκφραση p85α με διαγραφή του τομέως BH μόνος σημαντικά μειωμένη αλληλεπίδραση με ΡΤΕΝ και τη διαγραφή των δύο τομέων αλλά κατάργησε, οδηγώντας σε αυξημένη εύρος και τη διάρκεια της ενεργοποίησης ΑΚΤ εξής αυξητικού παράγοντα διέγερσης [23]. Έτσι, PTEN: p85α αλληλεπίδραση φαίνεται να ενισχύει την ικανότητα του PTEN να μειώσουν τα επίπεδα ΡΙΡ3 και να καταγγείλει τη σηματοδότηση σε ΑΚΤ. Πράγματι, η E160 μετάλλαξη * προσδιορίζονται στο ενδομήτριο καρκίνωμα έχει δειχθεί να αποσταθεροποιήσουν ΡΤΕΝ και να οδηγήσει σε αυξημένη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ [20].

Η περιοχή BH δείχνει επίσης ομολογία αλληλουχίας με πρωτεΐνες RhoGAP και κατέχει δραστηριότητα GAP προς Rab5, Rab4, Cdc42 και Rac1 [21].