Αφηρημένο

Οι πρωτεΐνες της οικογένειας εμφανίζουν IQGAP περίπλοκη και συχνά αντιφατικές δραστηριότητες στην ογκογένεση. IQGAP1 έχει καλά τεκμηριωμένη ογκογόνο δυναμικό και IQGAP2 έχει υποθετική λειτουργία του όγκου-κατασταλτικό. IQGAP3 είναι η τελευταία προσθήκη στην οικογένεια αυτή και το ρόλο του στην ανάπτυξη καρκίνου παραμένει να καθοριστεί. Εδώ δείχνουμε έκφραση IQGAP3 είναι σημαντικά αυξημένη σε ιστούς καρκίνου του πνεύμονα, τόσο σε mRNA και τα επίπεδα πρωτεΐνης. Η υπερέκφραση του IQGAP3 προωθούνται ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, και τη μετανάστευση και την εισβολή, ενώ knockdown του IQGAP3 επέδειξαν αντίθετα αποτελέσματα. Επιπλέον, η καταστολή της IQGAP3 σε μια κυτταρική γραμμή καρκίνου του πνεύμονα που προκαλείται μείωση της ογκογονικότητας αυτών των κυττάρων σε ιστό πνεύμονα μετά από ενδοφλέβια ένεση. Επιπλέον, δείξαμε ότι IQGAP3 είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με ERK1 και να ενισχύσει τη φωσφορυλίωση του μετά από αγωγή με EGF. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι IQGAP3 μπορεί να συνεισφέρει στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα με τη διαμόρφωση σηματοδότησης EGFR-ΕΚΚ

Παράθεση:. Yang Υ, Zhao W, Xu QW, Wang XS, Zhang Υ, Zhang J (2014) IQGAP3 Προωθεί EGFR-ΕΚΚ Σηματοδότησης και η ανάπτυξη και μετάσταση των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. PLoS ONE 9 (5): e97578. doi: 10.1371 /journal.pone.0097578

Συντάκτης: Vladimir V. Kalinichenko, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20 του Φλεβάρη του 2014? Αποδεκτές: 21 Απρ 2014? Δημοσιεύθηκε: May 21, 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο λάβει στήριξη από το Εθνικό Πρόγραμμα βασικής Έρευνας της Κίνας (2011CB946103), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (31330025 και 30830091), Ίδρυμα Επιστημών του Πεκίνου Δημοτική Φυσικό (7.122.104) και το 111 Έργο της Κίνας (B07001). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα βρίσκεται στην πρώτη θέση της θνησιμότητας που σχετίζονται με τον καρκίνο του τόσο στην Κίνα όσο και παγκοσμίως [1], [2]. Στην Κίνα, υπάρχουν περίπου 300.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του πνεύμονα και περισσότεροι από 250.000 θάνατοι από αυτή την ασθένεια κάθε χρόνο [3]. Ιστολογικά, όσο το 85% των καρκίνων του πνεύμονα είναι μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του τύπου του πνεύμονα (NSCLC), και η πλειοψηφία αυτών είναι είτε αδενοκαρκίνωμα ή πλακώδες καρκίνωμα [4] – [7]. Όπως ο καρκίνος του πνεύμονα μπορεί να είναι απόκρυφη, οι περισσότεροι ασθενείς είναι εκτός λειτουργίας και να έχουν μεταστάσεις στην περιφερειακή λεμφαδένες ή σε απομακρυσμένες περιοχές κατά τη στιγμή της διάγνωσης. Οι ασθενείς με NSCLC με απομακρυσμένες μεταστάσεις επιβιώσουν για ένα σύντομο χρονικό διάστημα (από 9 μέχρι 12 μήνες) [5], [8]. Υπάρχει, επομένως, επιτακτική ανάγκη να διαλευκάνουν τους μοριακούς μηχανισμούς που οδηγούν στην εισβολή και τη μετάσταση στον καρκίνο του πνεύμονα [9], [10]. Τέτοιες πληροφορίες θα διευκολύνει την ανάπτυξη νέων θεραπειών που επιτρέπουν τη βελτίωση της έκβασης σε ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα [11], [12].

Θεραπευτικές προσεγγίσεις κατά EGF ή EGFR αντιπροσωπεύουν μια πολλά υποσχόμενη κατεύθυνση για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα [13], [14]. EGFR εκφράζεται σε φυσιολογικά κύτταρα του επιδερμικού, μεσεγχυματικής και νευρογενούς προέλευσης, και η ενεργοποίηση του ελέγχεται αυστηρά σε φυσιολογικούς ιστούς [15], [16]. Ωστόσο, η δέσμευση του EGFR με συνδέτη αποτελέσματά της σε ομο- ή ετεροδιμερισμό υποδοχέων και ενεργοποίηση του ενδογενούς δραστικότητας κινάσης τυροσίνης του [17]. Το σηματοδοτικό μονοπάτι έτσι ξεκίνησε, τελικά, οδηγεί σε αλλαγές σε αυτές τις κυτταρικές συμπεριφορές όπως πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τη διαφοροποίηση [15], [16]. Σημαντικά, συστατική ενεργοποίηση του EGFR ή ενισχυμένη σηματοδότηση EGF απαντάται συχνά σε διάφορους τύπους καρκίνων, ειδικά στον καρκίνο του πνεύμονα, όπου συνδέεται με την έναρξη του καρκίνου, ανάπτυξη όγκου /εξέλιξη, μετάσταση και φτωχή πρόγνωση [17] – [20].

Η οικογένεια IQGAP πρωτεϊνών είναι καλά συντηρημένη σε οργανισμούς από τη ζύμη σε θηλαστικά [21]. Αποτελείται από τρία μέλη, IQGAP1, IQGAP2 και IQGAP3 [22] – [24]. Μεταξύ αυτών, IQGAP1 είναι το καλύτερο που μελετήθηκαν [25]. Η IQGAP όνομα προέρχεται από τις πολλαπλές λειτουργικές περιοχές αυτά τα μόρια φιλοξενούν όπως τέσσερα μοτίβα IQ και RasGAP σχετίζεται τομέα (δρχ) [26], [27]. IQGAP1 περιέχει επίσης υποθετικές περιοχές ομοδιμερισμό σπείρα-σπείρα, μια επανάληψη τρυπτοφάνη μοτίβο (WW) άγνωστης λειτουργίας, ένα πεδίο calponin-ομολογία (CHD) που αλληλεπιδρά με F-ακτίνη, και RasGAP_C άκρο (RGCt) που αλληλεπιδρά με πολλές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων Ε-καδερίνη και β-κατενίνης [27]. IQGAP1 έχει προταθεί να λειτουργεί στη ρύθμιση του κυτταρικού σκελετού και των κυττάρων μετανάστευση [28] – [30]. Υπάρχουν επίσης στοιχεία τα οποία δείχνουν IQGAP1 παίζει ρόλο στον καρκίνο εξέλιξης [31], [32]. Σε αντίθεση, IQGAP2 φαίνεται να δρα ως καταστολέας όγκου [33]. IQGAP3 είναι η τελευταία προσθήκη στην οικογένεια αυτή [24]. Δεδομένα διαθέσιμα σήμερα υποδηλώνουν ότι εμπλέκεται στον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων [34], [35], ωστόσο ο ρόλος του στην ογκογένεση μένει να καθοριστεί. Στην παρούσα μελέτη, παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι IQGAP3 προωθεί την ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα και των μεταστάσεων μέσω της ενίσχυσης του EGFR με τη μεσολάβηση σηματοδότηση ΕΚΚ. IQGAP3 μπορεί να διαδραματίσει ένα ρόλο παρόμοιο με εκείνο του IQGAP1 στην ογκογένεση.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από τις Επιτροπές Δεοντολογίας του Πεκίνου Πανεπιστήμιο Επιστήμης Υγείας Center (Πεκίνο, Κίνα) και η 306th Νοσοκομείο του Λαϊκού Απελευθερωτικού Στρατού της Κίνας (Πεκίνο, Κίνα). Για τις μελέτες σε ζώα, όλες οι προσπάθειες που έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία και όταν παρατηρείται ταλαιπωρία ήταν πολύ μεγάλη, χρησιμοποιήθηκε ανθρώπινη ευθανασία. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από μεμονωμένους ασθενείς για χρήση δειγμάτων ιστών.

Γραμμές κυττάρων και τα δείγματα ασθενών

Α549 και HeLa κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Life Technologies , Carlsbad, CA, USA). κύτταρα ΗΕΚ293Τ καλλιεργήθηκαν σε μέσο ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη 5% CO

2 ατμόσφαιρα.

Για κύτταρο δοκιμασίες σηματοδότησης, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού (0,5% ορός εμβρύου μόσχου) για 16 ώρες πριν από τη διέγερση με 100 ng /ml EGF (Peprotech, Rockville, NJ, USA) για διαφορετικά χρονικά διαστήματα όπως υποδεικνύεται.

25 ζεύγη πνευμονικό ιστό του όγκου και των παρακείμενων φυσιολογικό δείγματα ιστών ελήφθησαν από την 306η Νοσοκομείο του Λαϊκού Απελευθερωτικού Στρατού της Κίνας.

πλασμίδια και διαμόλυνση

Myc-ρΟΑΟΟδ-IQGAP3 και ρΟΑΟΟδ έλεγχο οι φορείς ευγενώς από το Δρ Kozo Kaibuchi. ΗΑ-tagged ERK1 ή ERK2 φορείς έκφρασης κατασκευάστηκαν με κλασσικές τεχνικές μοριακής και επαληθεύεται με προσδιορισμό της αλληλουχίας.

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με jetPRIME αντιδραστήριο διαμόλυνσης (Polyplus Επιμόλυνση, Illkirch, France).

siRNA Επιμόλυνση και λεντοϊού Λοίμωξη

Μικρές παρεμβολής RNA ολιγονουκλεοτιδίων (ολίγος) έναντι IQGAP3 ή τον έλεγχο siRNA ολιγονουκλεοτίδια ελήφθησαν από GenePharma Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Οι αλληλουχίες στόχευσης αυτών των siRNAs ήταν ως εξής: SI IQGAP3-1:5′- GAGCCAACCAGGACACUAA-3 ‘? si IQGAP3-2:5’- GGCAGAAACUAGAAGCAUA-3 ‘? siRNA ελέγχου: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ‘. oligos siRNA (50 ηΜ) διαμολύνθηκαν σε κύτταρα Α549 με το αντιδραστήριο διαμόλυνσης jetPRIME.

Εναλλακτικά, η αλληλουχία στόχος siRNA κλωνοποιήθηκε εντός του φορέα βραδέος ιού pLL3.7. Μετά από επαλήθευση της αλληλουχίας, οι shRNA πλασμιδίου και η συσκευασία φορέων psPAX2 και pLP /VSVG διαμολύνθηκαν στην κυτταρική σειρά συσκευασίας ΗΕΚ293Τ χρησιμοποιώντας jetPRIME. Το μέσο αλλάχθηκε 8 ώρες μετά την επιμόλυνση. 48 ώρες αργότερα, ιικό υπερκείμενο συλλέχθηκε και επωάστηκε με το Α549 κυτταρική γραμμή σε παρουσία 8 μg /ml polybrene (Sigma-Aldrich, Saint Louis, ΜΟ, USA). Για σταθερώς επιμολυσμένα επιλογή κυτταρικής σειράς, GFP φθορισμός χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης διαλογής. Κύτταρα με & gt?. 75% αποδοτικότητα μόλυνση χρησιμοποιήθηκαν για περαιτέρω ανάλυση

Αντίστροφη Μεταγραφάση-PCR και Real-time PCR

ΤΚΙζοΙ (Life Technologies) χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση ολικού RNA και στη συνέχεια μεταγράφεται ανάστροφα σε cDNA από το σύστημα αντίστροφης μεταγραφής (Promega, Madison, WI, USA). Ποσοτική πραγματικό χρόνο PCR διεξήχθη σε ένα σύστημα Bio-Rad PCR Πραγματικού χρόνου. Οι αλληλουχίες των εκκινητών σε πραγματικό χρόνο για IQGAP3 είχαν ως εξής: προς τα εμπρός, 5′-GTTCATCCATAGAGCCTGCCA-3 ‘? αντίστροφη, 5’-GCGATGCTCTCACCAATAAGG-3 ‘. Οι εκκινητές σε πραγματικό χρόνο για την GAPDH έχουν περιγραφεί πριν [36]. Η γονιδιακή έκφραση προσδιορίστηκε ποσοτικά ως απόδοση IQGAP3 σε σχέση με εκείνη του GAPDH.

Ανοσοκαθίζηση και ανάλυση Western Blot

Myc-IQGAP3 και ΗΑ-ERK1 ή ERK2 ΗΑ-κατασκευάσματα επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης με αναστολέα πρωτεϊνάσης κοκτέιλ (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) και φαινυλομεθυλοσουλφονυλοφθορίδιο. Στη συνέχεια, τα κυτταρολύματα επωάστηκαν με αντίσωμα ποντικού αντι-ΗΑ mAb (Sigma-Aldrich), αντι-Μγο mAb (Sigma-Aldrich) ή ένα αντίσωμα ελέγχου (mIgG) (Sigma-Aldrich) και πρωτεΐνη-Α Sepharose (GE Healthcare, USA) και αναλύθηκαν με SDS-PAGE. Για ενδογενή ανοσοκαταβύθιση, προϊόν λύσης κυττάρου που παρασκευάζονται από κύτταρα Α549 και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ERK1 mAb (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).

Για ανάλυση κηλίδος western, ίσες ποσότητες πρωτεΐνης από κάθε δείγμα φορτώθηκε και να επιλυθεί με SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε κηλίδες. Μετά τον αποκλεισμό, οι κηλίδες ανιχνεύτηκαν με υποδεικνυόμενα αντισώματα και αξιολογήθηκαν με το Σύστημα Οδύσσεια Imaging (licor Bioscience, Lincoln, ΝΕ, USA). Αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιελάμβαναν αντι-GAPDH (Bioworld Technology, Inc., St Louis Park, ΜΝ, USA), αντι-IQGAP3 (Sigma-Aldrich), αντι-ΕΚΚ (ΟβΙΙ Signaling, Beverly, ΜΑ, USA), αντι-φωσφο-ΕΚΚ

Thr202 /Tyr204 (Cell Signaling), αντι-φωσφο-ρ38

Thr180 /Tyr182 (Cell Signaling), αντι-φωσφο-Akt

Ser473 (Cell Signaling), αντι-myc, και αντι-ΗΑ.

ιστός μικροσυστοιχιών και ανοσοϊστοχημεία

Μια πνεύμονα μικροσυστοιχιών καρκινικού ιστού (TMA) αγοράστηκε από Chaoying Βιοτεχνολογία Co (Xi’an, Κίνα). Οι τομές επωάστηκαν με αντίσωμα αντι-IQGAP3 (1:50 αραίωση) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Το πρωτογενές αντίσωμα ταυτοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα ένζυμο ραφανιδική υπεροξειδάση σημασμένο πολυμερές συζευγμένο με δευτερογενές αντίσωμα αίγας αντι-ποντικού (Promega). Οι τομές εξετάστηκαν και βαθμολογήθηκαν από έναν παθολόγο. Ο αρνητικός έλεγχος ήταν φυσιολογικός ανθρώπινος πνευμονικός ιστός.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 3 × 10

3 κύτταρα /φρεάτιο. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε κάθε 24 ώρες με τη χρήση του Κυττάρου Μετρώντας Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratories, Japan). Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν.

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή Δοκιμασία

δοκιμασίες Μετανάστευση διεξήχθησαν σε μια 24-καλά το μέγεθος χημειοταξία θάλαμο (8-μm πόρων, η Corning Επιστήμες της Ζωής, Corning, Νέα Υόρκη, USA) επικαλύφθηκαν με 10 μg /ml ινονεκτίνης (Sigma-Aldrich). Τα κύτταρα (3~5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σε 200 μΙ ελεύθερο ορού RPMI 1640 σπάρθηκαν εντός του άνω θαλάμου. Στη συνέχεια, 600 μΐ RPMI 1640 με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό ή 100 ng /ml ανθρώπινου EGF προστέθηκαν στο κατώτερο θάλαμο. Τα κύτταρα στον άνω θάλαμο απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας μια μπατονέτα μετά από 20 ώρες επώασης στους 37 ° C και 5% CO

2. Τα κύτταρα που συνδέονται με το κάτω μέρος των μεμβρανών σταθεροποιήθηκαν με μεθανόλη και βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Ο βαθμός της μετανάστευσης εκφράστηκε ως ο μέσος αριθμός των κυττάρων σε έξι 10 × πεδία.

προσδιορισμοί κυττάρων εισβολής διεξήχθησαν ουσιαστικά με τον ίδιο τρόπο όπως η δοκιμασία μετανάστευσης, εκτός από το ότι ο άνω θάλαμος καλύφθηκε με 30 μΙ Matrigel (0,5 mg /ml? BD Biosciences). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

Luciferase Reporter Assay

Η μεταγραφική δραστικότητα Elk-1 μετρήθηκαν με τον Dual-Luciferase Reporter System Δοκιμασία (Promega). IQGAP3 siRNA ή NC siRNA συν-επιμολύνθηκε σε κύτταρα Α549 με τα πλασμίδια pFR-Luc (πλασμίδιο ανταποκριτής), pFA2-Elk-1 (πλασμίδιο διαενεργοποιητή) ή ρΡΙ_-ΤΚ. Εικοσιτέσσερις ώρες αργότερα, τα κύτταρα στερήθηκαν ορού για 16 ώρες, στη συνέχεια διεγέρθηκαν με ή χωρίς 100 ng /ml EGF για 6 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν. Ολες οι δοκιμασίες ρεπόρτερ επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές εις τριπλούν. Λουσιφεράση πυγολαμπίδας και η δραστικότητα λουσιφεράσης Renilla μετρήθηκαν με ένα φωτόμετρο Centro LB960 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germany). δραστηριότητα λουσιφεράσης πυγολαμπίδας υπολογίστηκε και ομαλοποιήθηκε με βάση τη δραστηριότητα λουσιφεράσης Renilla. δραστηριότητα λουσιφεράσης στα κύτταρα ελέγχου siRNA επιμολυσμένα χωρίς διέγερση EGF ορίστηκε ως 1.

μετάσταση όγκου Ανάλυση

in vivo

Η

NOD /SCID ποντίκια αγοράστηκαν από Vital ποταμό Εργαστήριο Ζώων Technology Co. Ltd (Πεκίνο, Κίνα). Τα ποντίκια τέθηκαν σε εγκατάσταση παθογόνων δωρεάν στο Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Επιστημονικό Κέντρο Υγείας (Πεκίνο, Κίνα).

κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με τον έλεγχο shRNA ή shIQGAP3 φακοϊούς. Τα κύτταρα (1.5 × 10

6) σε 0,1 ml PBS εγχύθηκαν στην ουραία φλέβα των 6-εβδομάδων NOD ποντίκια /SCID. Έξι εβδομάδες μετά τη μόλυνση, οι ποντικοί θυσιάστηκαν με αυχενική εξάρθρωση. Στη συνέχεια, οι πνεύμονες απομακρύνθηκαν, ζυγίστηκαν, φωτογραφήθηκαν, και μονιμοποιήθηκαν σε 4% φορμαλίνη. Τομές ιστού επίσης χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη-ηωσίνη (Η &? Ε). για ιστολογική αξιολόγηση

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SPSS, έκδοση 13.0 (SPSS, Inc.). t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την εισβολή ανάμεσα σε δύο ανεξάρτητες ομάδες. Η Chi-square τεστ εκτελέστηκε για να προσδιοριστεί διαφορές στην ηλικία, το φύλο, το στάδιο του όγκου του ασθενούς και ιστολογία μεταξύ των ομάδων με υψηλότερες, ίσες ή χαμηλότερη έκφραση IQGAP3 στον όγκο έναντι παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς.

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

IQGAP3 η έκφραση ρυθμίζεται αυξητικά στον καρκίνο του πνεύμονα ιστών

Μια πιθανή ρόλο στην ογκογένεση ήταν η πρώτη. προτείνεται για IQGAP3 από βιοπληροφορικής αναλύσεις της έκφρασης IQGAP3 στον ιστό του όγκου. ECgene (https://genome.ewha.ac.kr/ECgene/) έδειξαν αυξημένα επίπεδα IQGAP3 σε μια ποικιλία καρκινικών ιστών ή κυττάρων προέλευσης στην ωοθήκη, πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του στομάχου, του μυελού των οστών και του μαστού (Σχήμα 1Α ). RT-PCR διενεργήθηκε εν συνεχεία για την επαλήθευση των εν λόγω δεδομένων. Ενώ η έκφραση IQGAP3 σε φυσιολογικούς ιστούς περιορίστηκε στο κόλον, το λεπτό έντερο και όρχεις, τα υψηλά επίπεδα IQGAP3 mRNA παρατηρήθηκαν σε αριθμό όγκων συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα, νεφρικό καρκίνο, γαστρικό καρκίνο, καρκίνο ουροδόχου κύστης, καρκίνο του παχέος εντέρου και λευχαιμία ( τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, είδαμε παραγωγή αυτοαντισωμάτων εναντίον IQGAP3 σε ένα σημαντικό ποσοστό ασθενών με καρκίνο IQGAP3 θετικά πνεύμονα [37]. Αυτό μας ώθησε να ερευνήσει περαιτέρω την δραστικότητα αυτού του μορίου στην ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα. IQGAP3 ρυθμίζεται αυξητικά στο επίπεδο του mRNA σε 20 πνεύμονα καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με παρακείμενες μη καρκινικούς ιστούς σε 25 ζευγαρωμένα δείγματα με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση (Σχήμα 1Β). Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης IQGAP3 σε μία συστοιχία ιστών που περιέχει 89 ζεύγη ιστούς καρκίνου του πνεύμονα. Αυξημένα επίπεδα IQGAP3 πρωτεΐνης παρατηρήθηκαν σε 80 καρκινικούς ιστούς (Σχήμα 1C και Πίνακας S1). Αξίζει να σημειωθεί ότι, η στατιστική ανάλυση έδειξε ότι δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ IQGAP3 ανοδική ρύθμιση πρωτεΐνης και παραμέτρους όπως η ηλικία, το φύλο ή ιστολογικές βαθμού (Πίνακας S1).

ανάλυση έκφρασης (Α) EST του γονιδίου IQGAP3 σε φυσιολογικά και καρκινικούς ιστούς με βάση τη βάση δεδομένων ECgene. (Β) Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου για την έκφραση IQGAP3 σε 25 ζεύγη καρκίνου του πνεύμονα σε σχέση με γειτονικά μη-καρκινικούς ιστούς. έκφραση IQGAP3 ομαλοποιήθηκε έναντι GAPDH. Σχετικά επίπεδα υπολογίστηκαν για κάθε δείγμα, και μια τιμή 1 ανατέθηκε για παρακείμενες μη-καρκινικό ιστό του ασθενούς 13. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν. Τα δεδομένα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. (Γ) Ανοσοϊστοχημική ανάλυση έκφρασης πρωτεΐνης IQGAP3 στον καρκίνο του πνεύμονα έναντι γειτονικών μη-καρκινικούς ιστούς. Αντιπροσωπευτικά εικόνες εμφανίζονται για ένα πλακώδες καρκίνωμα και ένα αδενοκαρκίνωμα. Ca, τον καρκίνο του ιστού? Adj, παρακείμενες μη-καρκινικούς ιστούς. Μεγέθυνσης, × 200.

Η

Τροποποίηση της IQGAP3 έκφρασης ρυθμίζει την ανάπτυξη, τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων όγκου

Για να διερευνηθεί η λειτουργική συνέπεια υπερέκφραση IQGAP3 στον καρκίνο, θα παρακολουθούνται οι αλλαγές στην κύτταρο συμπεριφορά ακόλουθη μεταβολή του επιπέδου έκφρασης του σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. IQGAP3 πρώτη υπερεκφράζεται σε κύτταρα HeLa, η οποία είχε ένα σχετικά χαμηλό επίπεδο ενδογενούς έκφρασης IQGAP3. Η υπερέκφραση του IQGAP3 προωθούνται πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε αυτά τα κύτταρα (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, εκτελείται έκφραση IQGAP3 οδήγησε σε αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή (Σχήμα 2Β, C).

Myc-IQGAP3 ή ελέγχου φορείς επιμολύνθηκαν σε κύτταρα HeLa και στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση για μετανάστευση και δοκιμασία εισβολής. Τα κύτταρα για ανίχνευση πολλαπλασιασμού συλλέχθηκε σε υποδεικνυόμενα χρονικό σημείο. πρωτεΐνη έκφρασης (Α) IQGAP3 του επιμολύνσεων πιστοποιήθηκε με κηλίδωση Western. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την μέτρηση κυττάρων Kit-8. δοκιμασίες (B, C) μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας θαλάμους χημειοταξίας με ή χωρίς επικάλυψη με Matrigel. Κάθε δοκιμασία επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές. Τα δεδομένα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. *,

P

& lt? 0,05? ***

P

& lt?. 0.001

Η

Για την περαιτέρω αξιολόγηση των επιπτώσεων της IQGAP3 στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και η μετανάστευση, η έκφραση IQGAP3 χτυπήθηκε κάτω στον καρκίνο του πνεύμονα Α549 κυτταρική σειρά , η οποία είχε ένα σχετικά υψηλό επίπεδο έκφρασης της ενδογενούς IQGAP3. Δύο shRNA κατασκευές στόχευσης χρησιμοποιήθηκαν διαφορετικές αλληλουχίες IQGAP3, αμφότερα από τα οποία οδήγησαν στην αποτελεσματική ρύθμιση προς τα κάτω του IQGAP3 σε σύγκριση με μη-ειδικούς ελέγχους (Σχήμα 3Α). Όπως αναμενόταν, knockdown του IQGAP3 κατέστειλε τον πολλαπλασιασμό κυττάρων Α549 (Εικόνα 3Β). Επιπλέον, η μειωμένη έκφραση IQGAP3 συνοδεύτηκε επίσης από μειωμένη μετανάστευση και εισβολή σε Α549 κύτταρα (Σχήμα 3C, D). Είναι γνωστό ότι η σηματοδότηση EGFR είναι κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα. Ως εκ τούτου, εξετάστηκαν περαιτέρω κατά πόσον η έκφραση IQGAP3 μπορούν να διαμορφώσουν την ευαισθησία των κυττάρων σε EGF ερέθισμα. Όπως φαίνεται στα σχήματα 3Ε και F, knockdown του IQGAP3 προκάλεσε αναστολή της κυτταρικής μετανάστευσης και εισβολής παρόμοια με αυτή που επάγεται από EGF. Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν IQGAP3 έχει ογκογόνο δυναμικό.

Α549 κύτταρα μορφομετατράπηκαν με κατασκευάσματα shRNA να knockdown έκφρασης ενδογενούς IQGAP3. τα επίπεδα πρωτεΐνης (Α) IQGAP3 μετά από μόλυνση με τον έλεγχο (NC) ή δύο διαφορετικά φακοϊών shIQGAP3 (Kd1 και Kd2). (Β) πολλαπλασιασμός αναλύθηκε με χρήση του Κυττάρου Μετρώντας Kit-8 για κύτταρα Α549 φακοϊό μολυσμένα. (C, E) Μετανάστευση φακοϊό μολυσμένα κύτταρα Α549 στη δοκιμασία θαλάμου χημειοταξίας απουσία (C) ή παρουσία (Ε) του ανθρώπινου EGF (100 ng /ml). (D, F) Εισβολή της φακοϊό-μολυσμένα κύτταρα Α549 σε όλη Matrigel εν τη απουσία (D) ή παρουσία (F) του ανθρώπινου EGF. Κάθε δοκιμασία επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές. Τα δεδομένα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. *,

P

& lt? 0,05? **,

P

& lt? 0,01? ***,

P

& lt?. 0.001

Η

Νοκ ντάουν της IQGAP3 Καταστολής καρκίνο του πνεύμονα Μετάσταση

Λόγω του ισχυρού αντίκτυπου της έκφρασης IQGAP3 στον πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων που καλλιεργήθηκαν

in vitro

, είμαστε δίπλα προσπάθησε να διαπιστώσει εάν επηρεάζονται επίσης ογκογένεση

in vivo

χρησιμοποιώντας καθιερωμένη μοντέλο του μεταστατικού καρκίνου του πνεύμονα [38], [39]. Κύτταρα Α549 που φιλοξενούν ένα βραδέος ιού φορέα που εκφράζει IQGAP3 ειδικά shRNA ενέθηκαν στην φλέβα ουράς του NOD /SCID ποντίκια. Τα ζώα θανατώθηκαν την ημέρα 42 και οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν και αναλύθηκαν. Σε σύγκριση με τους ελέγχους mock, κύτταρα knockdown IQGAP3 φάνηκε να είναι λιγότερο ογκογόνα

in vivo

, όπως προτείνεται από το πολύ μειωμένο όγκο και το βάρος των επηρεαζόμενων πνεύμονες (Εικόνα 4Α, Β). Ανοσοϊστοχημική χρώση αποκάλυψε ότι σχετικά φυσιολογική δομή του πνεύμονα διατηρήθηκε στις ομάδες knockdown IQGAP3, ενώ σχεδόν ολοσχερώς από τις πολλαπλές οζίδια όγκου στον ψευδο ελέγχου (Σχήμα 4C). Λαμβάνοντας τις σχετικές

in vitro

στοιχεία υπόψη, η μειωμένη ογκογόνο δυναμικό των κυττάρων νοκ ντάουν IQGAP3

in vivo

μπορεί να προκύψει είτε από εξασθενημένη αποικισμό ή τον πολλαπλασιασμό ή και τα δύο.

NOD /SCID ποντίκια έλαβαν μια ενδοφλέβια ένεση 1,5 × 10

6 Α549 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με shIQGAP3 (IQGAP3-Kd2) ή φορείς ελέγχου (NC), και θυσιάστηκαν την ημέρα 42 μετά τον εμβολιασμό του όγκου (η = 7 για κάθε ομάδα). (Α) Μικτό εμφάνιση των ιστών του πνεύμονα. βάρος (Β) του πνεύμονα. Οι οριζόντιες και οι ράβδοι σφάλματος δείχνουν το μέσο βάρος και την τυπική απόκλιση. (Γ) Η &? Ε χρώση των ιστών του πνεύμονα. Τέσσερις αντιπροσωπευτικά πεδία (2 για κάθε ομάδα) δείχνονται. Μεγέθυνση, × 40. **

P

& lt?. 0.01

Η

IQGAP3 αλληλεπιδρά με ERK1

Όπως προβλέπεται από Scansite (https://scansite.mit.edu/), IQGAP3 περιέχει πολλούς τομείς ERK D, η οποία είναι γνωστό ότι μεσολαβεί αλληλεπίδραση με μέλη της οικογένειας ERK. Για να διερευνήσουν αυτή τη δυνατότητα, θα επιμολυσμένα ΗΕΚ293Τ κύτταρα με Myc-IQGAP3 και ΗΑ-ERK1 ή κατασκευάσματα HA-ERK2. Κυτταρόλυμα προετοιμάστηκε και ανοσοκαταβυθίζονται με αντι-ΗΑ ή αντι-Μγο. Το προκύπτον ίζημα αμοιβαίως ανιχνεύθηκε με αντι-Μγο ή αντι-ΗΑ. Ήταν ιδιαίτερο ενδιαφέρον που ανοσοκαταβύθιση IQGAP3 παρατηρήθηκε με ERK1, αλλά όχι με ERK2 (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, επιδιώξαμε να προσδιοριστεί αν μια παρόμοια αλληλεπίδραση συμβαίνει μεταξύ ενδογενώς εκφραζόμενων πρωτεϊνών. Κυτταρόλυμα από κύτταρα Α549 ανοσοκαταβυθίστηκε με κουνελιού αντι-ERK1 mAb και IQGAP3 ήταν πράγματι ανιχνεύθηκε στο ίζημα με αντι-IQGAP3 αντίσωμα (Σχήμα 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι IQGAP3 μπορεί να αλληλεπιδράσει με ERK1, είτε άμεσα είτε έμμεσα μέσω ενός μεγαλύτερου συγκροτήματος.

(Α) Myc-IQGAP3 και ΗΑ-ERK1 ή ERK2 ΗΑ-κατασκευάσματα επιμολύνθηκαν σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ. Κυτταρόλυμα προετοιμάστηκε και ανοσοκαταβυθίζονται με αντι-ΗΑ mAb ποντικού, αντι-Μγο ή mAb αντισώματα ελέγχου (mIgG). Το προκύπτον ίζημα, μαζί με το μη επεξεργασμένο λύμα (Input) επιλύθηκε σε SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν επί κηλίδες και ανιχνεύτηκαν με αντι-Μγο και αντι-ΗΑ. (Β) Αλληλεπίδραση IQGAP3 με ERK1 εξετάστηκε επίσης σε κύτταρα Α549 με ενδογενώς εκφραζόμενων πρωτεϊνών. Κυτταρόλυμα παρασκευάστηκε από κύτταρα Α549 και ανοσοκαταβυθίστηκαν με αντι-ERK1 mAb. Η παρουσία του IQGAP3 στο ίζημα αξιολογήθηκε αντι-IQGAP3 αντισώματα. Όλα τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές και τα αποτελέσματα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζονται.

Η

IQGAP3 Προωθεί EGF προκάλεσε ΕΚΚ φωσφορυλίωση

Η αλληλεπίδραση μεταξύ IQGAP3 και ERK1 ζητηθεί περαιτέρω έρευνα σχετικά με την επίδραση της IQGAP3 στην ενεργοποίηση της ERK και σηματοδότηση. Η υπερέκφραση του IQGAP3 σε κύτταρα HeLa είχε ελάχιστη επίδραση επί της φωσφορυλίωσης της ERK, σε αντίθεση με ό, τι έχει αναφερθεί για IQGAP1 [40]. Όταν διεγείρονται με EGF, όμως, οι επιμολύνσεις IQGAP3 αποδειχθεί πολύ ενισχυμένη φωσφορυλίωση ERK σε σύγκριση με τον ψευδο ελέγχου (Σχήμα 6Α). ΑΚΤ και την ενεργοποίηση της ρ38 από την άλλη πλευρά δεν μεταβλήθηκε (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Σε συμφωνία με αυτά τα ευρήματα, knockdown έκφρασης IQGAP3 σε κύτταρα Α549 ως αποτέλεσμα την εξασθένηση της ERK φωσφορυλίωσης EGF-επαγόμενη, ενώ ΑΚΤ και φωσφορυλίωση ρ38 δεν επηρεάστηκε (Εικόνα 6Β). Επιπλέον, η διπλή δοκιμασίες λουσιφεράσης έδειξαν ότι knockdown του IQGAP3 αναστέλλει την μεταγραφική δραστικότητα του Elk1 το οποίο είναι ένα σήμα κατατεθέν της ενεργοποίησης ERK σε EGF διεγερμένα κύτταρα Α549 (Εικόνα 6C). Για την αξιολόγηση του δυναμικού συσχέτιση μεταξύ ενισχυμένη σηματοδότησης ERK και επιτάχυνε τον πολλαπλασιασμό των IQGAP3-επιμολυσμένα κύτταρα, U0126 οποία είναι ένας αναστολέας ΜΕΚ1 /2 προστέθηκε στην καλλιέργεια. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6D, η αναστολή της ενεργοποίησης ERK κατήργησε τον πολλαπλασιασμό αποτέλεσμα προαγωγής της IQGAP3. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν την ιδέα ότι ογκογόνο δραστικότητα της IQGAP3 είναι πιθανή μεσολάβηση από αυξημένη σηματοδότηση ERK.

κύτταρα (Α) Hela παροδικά επιμολυσμένα με Myc-IQGAP3 ή φορέα ελέγχου (mock) στερήθηκαν ορού (0,5% ορό εμβρύου μόσχου ) για 24 ώρες πριν να διεγείρονται με 100 ng /ml EGF. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε διαφορετικά χρονικά σημεία και εξετάστηκαν για φωσφορυλίωση ERK. (Β) κύτταρα Α549 μολύνθηκαν με φακοϊό shIQGAP3 (IQGAP3-Kd1 ή Kd2) ή ιό ελέγχου (NC) και (0,5% ορό εμβρύου μόσχου) στερούνται ορού πριν τη διέγερση με 100 ng /ml EGF. Επίπεδα φωσφορυλιωμένου ERK, ολική ΕΚΚ, φωσφορυλιωμένη ρ38 και φωσφορυλιωμένη ΑΚΤ αξιολογήθηκαν με στύπωμα Western σε διαφορετικά χρονικά σημεία μετά από διέγερση EGF. (Γ) δοκιμασίες λουσιφεράσης έγιναν για να μετρηθεί δραστικότητα ΕΙκ1 κατάντη του καταρράκτη σηματοδότησης EGFR-ERK σε κύτταρα Α549 επιμολύνονται με ολίγο siRNA. (Δ) πολλαπλασιασμό των κυττάρων Hela που φιλοξενούν IQGAP3 εκφράζουν ή τον έλεγχο φορέων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας την καταμέτρηση κυττάρων Kit-8 με προσθήκη 20 μΜ U0126 ή DMSO. Κάθε δοκιμασία επαναλήφθηκε τουλάχιστον 3 φορές. Τα δεδομένα από ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. *,

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01

Η

Συζήτηση

Μέχρι σήμερα, τρία μέλη της οικογένειας IQGAP έχουν περιγραφεί [22] – [24].. Υπάρχουν ενδείξεις ότι IQGAP1 κυρίως λειτουργεί ως ογκογονίδιο [27]. IQGAP2 εμφανίζει δραστικότητα κατά του όγκου, παρά δομική ομοιότητά του με IQGAP1 [33]. Εδώ αποδείξαμε ότι IQGAP3 εκφράζεται έντονα σε ένα μεγάλο ποσοστό των δειγμάτων καρκίνου του πνεύμονα. Ενώ εκτελείται έκφραση IQGAP3 προκαλεί επιταχυνόμενη πολλαπλασιασμό και τη μετανάστευση /την εισβολή των καρκινικών κυττάρων, η καταστολή της έκφρασης του οδηγεί σε μείωση της πιθανής καρκινογένεσης. Σε μοριακό επίπεδο, IQGAP3 αλληλεπιδρά με ERK1 και προωθεί EGF που προκαλείται από την ενεργοποίηση της ERK, η οποία με τη σειρά της φαίνεται να συνδέεται στενά με τη δραστηριότητα του όγκου προώθηση της.

IQGAP3 βρίσκεται σε 1q21.3, το οποίο είναι ένα hotspot για ενίσχυση γονιδίου στον καρκίνο [24]. ενίσχυση του DNA στο 1q21.3 έχει για παράδειγμα έχουν αναφερθεί ότι συνδέεται με καρκίνωμα γαστροοισοφαγική και διηθητικά πορογενή καρκίνωμα του μαστού [41], [42]. Επιπλέον, τα κέρδη σε 1q21.3 έχουν σημαντική συσχέτιση με μειωμένο συνολικό χρόνο επιβίωσης σε λειομυοσάρκωμα της μήτρας [43]. ανάλυση βιοπληροφορικής δείχνει ότι IQGAP3 ρυθμίζεται αυξητικά σε πολλαπλούς τύπους καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, του στομάχου, του μυελού των οστών και κακοήθειες του μαστού (Σχήμα 1Α). Η τρέχουσα μελέτη απευθύνεται ειδικά το ρόλο της στον καρκίνο του πνεύμονα. Μεταξύ 25 ζεύγη από καρκίνο του πνεύμονα και των παρακείμενων μη-καρκινικούς ιστούς, 20 καρκινικούς ιστούς έδειξαν αύξηση στην IQGAP3 mRNA. Προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης IQGAP3 επιβεβαιώθηκε στο επίπεδο πρωτεΐνης με επίδειξη της ισχυρότερης ανοσοϊστοχημική χρώση για τον καρκίνο από ό, τι σε μη καρκινικούς ιστούς σε 80 από 89 δείγματα καρκίνου του πνεύμονα. Είμαστε εικάζουν ότι IQGAP3 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό γονίδιο που είναι κρίσιμα εμπλέκονται σε κακοήθειες που χαρακτηρίζεται από 1q21.3 ενίσχυση. Θα ήταν ενδιαφέρον να καθοριστεί εάν η ενίσχυση 1q21.3 συμβάλλει στην ρύθμιση προς τα άνω του IQGAP3 το οποίο βρίσκεται στον καρκίνο του πνεύμονα, και το κατά πόσον η ενίσχυση παρατηρείται σε 1q21.3 γαστροοισοφαγικής καρκινώματα ή καρκίνο του μαστού συνδέεται με αυξημένη έκφραση IQGAP3. Παρά το γεγονός ότι στη μελέτη μας, έχουμε αποδείξει ότι upreguation της IQGAP3 είναι μια κοινή εκδήλωση για τον καρκίνο του πνεύμονα, θα πρέπει να αναφέρουμε ότι υπάρχουν μερικά δείγματα καρκίνου του πνεύμονα που παρουσιάζουν αμετάβλητο ή ακόμα και μειωμένη έκφραση της IQGAP3. Αυτό δεν αποτελεί έκπληξη. Για παράδειγμα, Her2, το εκπροσωπούν ογκογονίδιο στον καρκίνο του μαστού, υπερεκφράζεται μόνο σε περίπου 20% του καρκίνου του μαστού [44], [45]. Ορισμένα γονίδια, όπως το ρ16, το οποίο μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρυθμισμένη σε όγκους και δρουν είτε ως καταστολέα όγκων ή ένα ογκογονίδιο ανάλογα με το πλαίσιο του σώματος [46]. Ως εκ τούτου, αν η διαφορετική πρότυπο έκφρασης του IQGAP3 υποδηλώνει μια πιο συγχυτικός παράγοντας ρύθμιση και τη λειτουργία των IQGAP3 στην ανάπτυξη του όγκου απαιτεί περαιτέρω μελέτες.

Η απορύθμιση της έκφρασης του IQGAP3 σε καρκινικό ιστό υποδεικνύει έναν πιθανό ρόλο για αυτό το μόριο στην ογκογένεση. Σύμφωνα με αυτή την έννοια, η υπερέκφραση του IQGAP3 ενίσχυση της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή, ενώ νοκ ντάουν της έκφρασης IQGAP3 εμφανίζεται αντίθετα αποτελέσματα. Ως εκ τούτου, IQGAP3 είναι λειτουργικά παρόμοια με IQGAP1, το οποίο είναι γνωστό ότι έχει ογκογόνο δυναμικό [31], [32]. Όπως και άλλα μέλη της οικογένειας IQGAP, IQGAP3 διαθέτει δομικά μοτίβα που μπορεί να δεσμεύσει ERK. Με αμοιβαία Συνανοσοκατακρήμνιση, επιβεβαιώσαμε την αλληλεπίδραση μεταξύ IQGAP3 και ERK1. Η λειτουργική σημασία αυτής της αλληλεπίδρασης υποστηρίζεται από την επαυξημένη φωσφορυλίωση της ERK και αυξημένη δραστικότητα μεταγραφικής ΕΙκ1 κατά τη διέγερση EGF σε IQGAP3-επιμολυσμένα κύτταρα. Το πιο σημαντικό, το αποτέλεσμα του πολλαπλασιασμού-προώθηση σχεδόν καταργήθηκε πλήρως από τον αναστολέα U0126 σηματοδότησης ΕΚΚ, υποδεικνύοντας ότι IQGAP3 ασκεί τη λειτουργία του, κυρίως από τον κανονισμό της σηματοδότησης ERK. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι παρά λειτουργική ομοιότητα τους, IQGAP3 και IQGAP1 εμφανίζουν σαφώς διαφορετικές εξειδικεύσεις για σύνδεση εταίρους. Ενώ IQGAP1 Συνδέεται κυρίως με την ERK2, IQGAP3 αλληλεπιδρά αποκλειστικά με ERK1 [40]. Η σημασία αυτών των επιλεκτικότητα μένει να καθοριστεί, ωστόσο εμείς εικάζουν ότι IQGAP1 και IQGAP3 μπορούν να συνεργάζονται στη ρύθμιση της σηματοδότησης ERK, ασκώντας έτσι μια συνεργική επίδραση στην εξέλιξη του όγκου.

Η ενδοφλέβια εμβολιασμό άτριχων ποντικών έχει χρησιμοποιηθεί ευρέως για την αξιολογούν μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων [38], [39]. Χρησιμοποιώντας αυτό το μοντέλο, knockdown του IQGAP3 στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα βρέθηκε να βλάπτει σημαντικά την ικανότητα της να δημιουργεί μεταστατικές αλλοιώσεις στον πνεύμονα. Αυτό το αποτέλεσμα είναι σύμφωνο με μας

in vitro

δεδομένων που δείχνει αλλαγμένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή εξής χειραγώγηση της έκφρασης IQGAP3. Ωστόσο, οι ειδικές λεπτομέρειες αυτών των μηχανισμών παραμένουν ασαφείς. Ομοεστιακό μικροσκόπιο αποκάλυψε ότι IQGAP3 εμπλουτίζεται που βρίσκονται στην αιχμή των μεταναστευτικών κυττάρων (Σχήμα S1), γεγονός που υποδηλώνει πιθανή εμπλοκή της στο σχηματισμό των κορυφαίων άκρων. Επιπλέον, προφίλ έκφρασης γονιδίου έδειξαν ένα αυξημένο επίπεδο Ε-καδερίνης σε κύτταρα knockdown IQGAP3 (Εικόνα S2). Είναι γνωστό ότι το E-cadherin είναι πολύ σημαντικό για την προσκόλληση των κυττάρων. Προς τα κάτω ρύθμιση από αυτό μαζί με την αντίστοιχη συγκρότημα κατενίνη του είναι ταυτόχρονη με μειωμένη ενδοκυτταρικής προσκόλλησης και ενισχυμένη ικανότητα επεμβατική [47], [48]. Ως εκ τούτου, μπορεί να διευκολύνει IQGAP3 κυτταρική μετανάστευση και εισβολή εν μέρει μέσω της καταστολής της έκφρασης Ε-καδερίνης.

Εν περιλήψει, οι μελέτες μας αποκαλύπτουν για πρώτη φορά η συμμετοχή των IQGAP3 στην ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα και των πιθανών μοριακών μηχανισμών στους οποίους του προαγωγής όγκων δραστηριότητα. Τα ευρήματα αυτά διευρύνουν τις γνώσεις μας για το πολύπλοκο ρόλο της οικογένειας IQGAP στην ογκογένεση. Περαιτέρω έρευνα σχετικά με τις δυνατότητες αυτών των μορίων ως στόχοι για θεραπευτική εφεύρεση είναι δικαιολογημένη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

IQGAP3 εμπλουτίστηκε που βρίσκονται στην αιχμή της που μεταναστεύουν κύτταρα. Α549 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε γυάλινο κάλυμμα επικαλυμμένα με 10 μg /ml ινονεκτίνης (Sigma-Aldrich).