Αφηρημένο

Σε απάντηση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία και ορισμένων χημειοθεραπευτικών παραγόντων, πεθαίνουν τα καρκινικά κύτταρα προκαλούν μια ισχυρή αντικαρκινική ανοσολογική απόκριση. Ωστόσο, το δυναμικό αποτέλεσμα του wogonin (5,7-διυδροξυ-8-methoxyflavone) για την ανοσογονικότητα του καρκίνου δεν έχει μελετηθεί. Εδώ δείξαμε για πρώτη φορά ότι wogonin προκαλεί μία ισχυρή επίδραση κατά του όγκου ανοσία δια της επαγωγής της μετατόπισης της Καλρετικουλίνης (CRT) και Annexin Α1 σε κυτταρικές μεμβράνη πλάσματος καθώς και την απελευθέρωση της πρωτεΐνης ομάδας υψηλού κινητικότητα 1 (HMGB1) και ΑΤΡ. πορείες σήματος που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία μελετήθηκαν. Βρήκαμε ότι αντιδραστικά είδη οξυγόνου wogonin που προκαλείται (ROS) παραγωγή προκαλεί ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) αντίδραση στο στρες, περιλαμβανομένης της φωσφορυλίωσης της PERK (PKR-όπως ενδοπλασματικό δίκτυο κινάσης) /PKR (πρωτεϊνική κινάση R) και eIF2α (παράγοντας ευκαρυωτικό έναρξη 2α ), η οποία χρησίμευσε ως ανάντη σήμα για την ενεργοποίηση του φωσφοϊνοσιτιδίου 3-κινάσης (ΡΙ3Κ) /ΑΚΤ, επάγοντας καλρετικουλίνη (CRT) /Annexin A1 μετατόπιση της κυτταρικής μεμβράνης. P22 /ΣΗΘ, ένα Ca

2 + που δεσμεύουν πρωτεΐνη, συνδέθηκε με CRT και απαιτούνται για CRT μετατόπιση σε κυτταρική μεμβράνη. Οι κυκλοφορίες των HMGB1 και ΑΤΡ από wogonin επεξεργασμένα κύτταρα MFC, μόνος ή μαζί με άλλους πιθανούς παράγοντες, ενεργοποιημένα δενδριτικά κύτταρα και προκαλείται από τα δελτία κυτοκινών. In vivo μελέτη επιβεβαίωσε ότι η ανοσοποίηση με καρκινικά κύτταρα wogonin-προεπεξεργασία εμβολιασμός ανέστειλε σημαντικά homoplastic μπολιασμένα ανάπτυξη γαστρικών όγκων σε ποντίκια και μια πιθανή φλεγμονώδης αντίδραση είχε εμπλακεί. Συμπερασματικά, η ενεργοποίηση της PI3K οδού που προκαλούνται από ER στρες που προκαλείται CRT /Αννεξίνη Α1 μετατόπιση ( «τρώνε μου» σήμα) και την απελευθέρωση HMGB1, μεσολαβώντας wogonin που προκαλείται από την ασυλία του εμβολίου καρκινικών κυττάρων. Αυτό έδειξε ότι wogonin είναι μια νέα αποτελεσματική υποψήφιο της ανοσοθεραπείας κατά όγκου του στομάχου

Παράθεση:. Yang Υ, Li X-J, Chen Ζ, Zhu Χ-Χ, Wang J, Zhang L-b, et al. (2012) Wogonin Induced Calreticulin /Αννεξίνη Α1 έκθεσης υπαγορεύει η ανοσογονικότητα των καρκινικών κυττάρων σε ένα PERK /AKT εξαρτώμενο τρόπο. PLoS ONE 7 (12): e50811. doi: 10.1371 /journal.pone.0050811

Επιμέλεια: Marc Tjwa, Πανεπιστήμιο της Φρανκφούρτης – Πανεπιστημιακό Νοσοκομείο της Φρανκφούρτης, Γερμανία

Ελήφθη: 20η του Ιανουαρίου 2011? Αποδεκτές: 29 Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 12, Δεκεμβρίου του 2012

Copyright: © 2012 Yang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αρ. 91129731 και 81072661), το Πρόγραμμα Έργων του κράτους Βασικά Εργαστήριο Φυσικών Φαρμάκων, την Κίνα Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου (Αρ JKGZ201102) οι New Century εξαιρετικά ταλέντα Πρόγραμμα Δρ Yong Yang υποστηρίζεται από Υπουργείο Παιδείας της Κίνας (NCET-09-0771), τα Θεμελιώδη Κονδυλίων Έρευνας για την κεντρική πανεπιστήμια (Αρ JKZ2009006), το Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της επαρχίας Jiangsu (Αρ BK2012025 και BK2011632), και «Major Drug Discovery» της επιστήμης και της τεχνολογία μεγάλα έργα της Κίνας (Αρ 2011ZX09102-001-20). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι παραδοσιακές μέθοδοι θεραπείας του καρκίνου περιλαμβάνουν χειρουργική επέμβαση, ακτινοθεραπεία, χημειοθεραπεία, και για ορισμένους τύπους καρκίνου, ορμονοθεραπεία. Αν και τα οφέλη που προκύπτουν από πολλούς ασθενείς, είναι σπάνια θεραπευτικά για τις πολύ λίγες υπολειμματική διαδίδονται καρκινικά κύτταρα, η κύρια αιτία θανάτου μεταξύ των ασθενών με καρκίνο. Ένας σημαντικός λόγος για τον οποίο οι όγκοι δεν ελέγχονται από το ανοσοποιητικό σύστημα είναι ότι η χαμηλή ανοσογονικότητα. Η χρήση των εμβολίων κατά του καρκίνου για να αποσπάσει μια θεραπευτική αντικαρκινική ανοσοαπόκριση έναντι αντιγόνων με σύνεση επιλέγονται όγκου εκφράζεται στα κύτταρα του όγκου μπορεί να αναζητήσει και να σκοτώνουν τα καρκινικά κύτταρα διαδίδονται. Μια πιθανή στρατηγική για την επίτευξη αυτού περιλαμβάνει την ανοσοποίηση με κύτταρα όγκου που έχουν υποστεί επεξεργασία με μία συγκεκριμένη κατηγορία χημειοθεραπευτικών φαρμάκων.

Συσσωρευμένα στοιχεία δείχνουν ότι πολλές χημειοθεραπευτικούς παράγοντες (συμπεριλαμβανομένων των ανθρακυκλινών και οξαλιπλατίνη), και η ιονίζουσα ακτινοβολία (όπως γ -rays και υπεριώδη C (UVC) φως) επάγουν ανοσογονική θάνατο των καρκινικών κυττάρων [1], [2]. Προτάθηκε ότι έχουν ικανότητα να οδηγούν Καλρετικουλίνης (CRT) μετατόπιση προς την επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, η οποία δρα σαν ένα σήμα «τρώνε me», αναγνωρίζεται από δενδριτικά κύτταρα (DCs), με αποτέλεσμα απόκριση Τ-κυττάρων κατά των όγκων [3]. Τα στοιχεία της οδού μεσολαβούν προ-αποπτωτικών έκθεση CRT περιλαμβάνουν μια πισίνα των CRT που διήλθε της συσκευής Golgi και εκκρίνεται από SNARE που εξαρτώνται εξωκυπάρωσης [4].

HMGB1 (ομάδα πρωτεϊνών υψηλής κινητικότητας 1), μια πυρηνική πρωτεΐνη που απελευθερώνεται από το θάνατο των κυττάρων, είναι ο συνδέτης του υποδοχέα ΤοΙΙ 4 (TLR4) [1]. Η εξάντληση της HMGB1 από θνήσκοντα κύτταρα όγκου καταργεί το TLR4-εξαρτώμενη, DC-διαμεσολαβούμενη παρουσίαση αντιγόνων από θνήσκοντα κύτταρα όγκου in vitro και in vivo [1]. Έτσι, η απελευθέρωση HMGB1 απαιτείται για την ανοσογονικότητα του κυτταρικού θανάτου μέσω της επίδρασής της επί TLR4. Ωστόσο, ούτε HMGB1 ούτε CRT (ούτε ένας συνδυασμός και των δύο) μπορούν να προωθήσουν την πλήρη ωρίμανση DCs, υποδεικνύοντας ότι η αναζήτηση για ανοσο-διεγερτικά μόρια που παράγονται από κύτταρα που πεθαίνουν πρέπει να συνεχιστεί [5].

Wogonin (5,7 -διϋδροξυ-8-methoxyflavone), ένα ενεργό συστατικό που απομονώνεται από

Scutellaria baicalensis

radix, αναφέρθηκε έχουν σημαντική αντικαρκινική δραστηριότητα επάγοντας κυτταρική διαφοροποίηση, την απόπτωση και κυτταρικό κύκλο σύλληψης [6] – [8]. Σε αυτή τη μελέτη, ελέγξαμε εάν wogonin, όπως και ορισμένα φάρμακα χημειοθεραπείας που αναφέρθηκαν παραπάνω, είναι σε θέση να προκαλέσει ανοσογόνες θάνατο των καρκινικών κυττάρων, και αν ναι, οι πιθανές πορείες σήματος που εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία αξιολογήθηκαν. Βρήκαμε για πρώτη φορά ότι wogonin προκαλεί μία ισχυρή επίδραση κατά του όγκου ανοσία δια της επαγωγής της μετατόπισης των CRT και αννεξίνης Α1 σε κυτταρικές πλασματικής μεμβράνης, καθώς και την απελευθέρωση της HMGB1 και ΑΤΡ. Βρήκαμε ότι Ενδοπλασμικό δίκτυο (ER) αντίδραση στο στρες, συμπεριλαμβανομένων PERK (PKR-όπως ενδοπλασματικό κινάσης δίκτυο) /PKR (πρωτεϊνική κινάση R) και eIF2α (2α υπομονάδα ευκαρυωτικό παράγοντα έναρξης) φωσφορυλίωση και την επακόλουθη ενεργοποίηση του μονοπατιού /σηματοδότησης AKT PI3K είναι συνεπάγονται σε αυτή τη διαδικασία.

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν σε ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνου, και όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με την Ευρωπαϊκή Ομοσπονδία κατευθυντήριες γραμμές εργαστήριο Επιστήμης ζώων. Η Επιτροπή Δεοντολογίας της Κίνας Φαρμακευτικής του Πανεπιστημίου ενέκρινε το σύνολο των πειραμάτων σε ζώα (αριθμοί Άδεια: SYXK2007-0025).

Χημικά και αντιδραστήρια

Wogonin εφαρμόστηκε σε DMSO σε 10 mM και αποθηκεύεται στους -20 ° ΝΤΟ. Η δοξορουβικίνη, ραπαμυκίνη, LY294002, αναστολέα ΑΚΤ X (Ακτή) αγοράστηκαν από την Calbiochem (San Diego, CA). EGFR, ERK1 /2, ΑΚΤ1 /2, Ku 80, κατσίκας αντι-κουνελιού IgG-HRP και αντι-ποντικού IgG-HRP αντίσωμα κατσίκας αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ν-ακετυλο-κυστεΐνη (NAC) και μονοκλωνικό ποντικού αντι-β-ακτίνης ελήφθησαν από τη Sigma (St. Louis, ΜΟ). ρ-PERK (Thr980), PERK, ρ-eIF2-α (ser51), eIF2-α, π-PKR (Thr446 /451), PKR, ρ-ΑΚΤ (Ser 473), ρ-ΑΚΤ (Thr 308), Annexin Α1, ρ-S6K (Thr389), ρ-4E-BP1 (Ser 65), S6K, 4Ε-BP1, ρ-ΟδΚ3β (Ser 9), ρ-S6 (S235 /236), ρ-ΕΚΚ (Thr202 /Tyr204) , π-JNK (Thr183 /Tyr185) και p-p38 (Thr 180 /Tyr182) αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology (Bevery, ΜΑ).

Cells πολιτισμό

Πρωτοβάθμια καλλιεργημένα μονοκύτταρα του ποντικιού προερχόμενο δενδριτικά κύτταρα (MoDCs) ήταν από Β6 ποντικούς μυελό των οστών, που διατηρείται σε ένα μέσο ΜΕΜ (Sigma, St. Louis, ΜΟ) συμπληρωμένο με FBS 10% συν GM-CSF (50 ng /ml). Για ανάλυση στυπώματος Western, τα κύτταρα επανασπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /ml με φρέσκο ​​πλήρες μέσο καλλιέργειας. Η ανθρώπινη γαστρικού καρκινώματος ΜΚΝ-45, κύτταρα ποντικού γαστρικού καρκινώματος κύτταρα MFC που προέρχονται από 615 ποντίκια (Στρατιωτική Ιατρικών Επιστημών, Πεκίνο), WT και ΑΚΤ1 /2 Διπλά Knockout ΠΜΑ (αγοράστηκε από την τράπεζα κυττάρων Σαγκάη, Κινεζική Ακαδημία Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα) διατηρήθηκαν σε ένα μέσο DMEM (Sigma, St. Louis, ΜΟ), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen, Carlsbad, CA), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (1:100, Sigma, St. Louis, ΜΟ) και 4 mM L-γλουταμίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ), σε ένα CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C.

δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση γέλης και ταυτοποίηση πρωτεϊνών με φασματομετρία μάζας

Οι μέθοδοι αναφέρονται στην προηγούμενη μελέτη [9]. Εν συντομία, ισοηλεκτρική εστίαση (IEF) διεξήχθη σε ένα Ettan IPGphor II (Amersham Bioscience) με 24-cm ακινητοποιημένη λωρίδες βαθμίδα ρΗ (ρΗ 3-10? Amersham Bioscience). Τζελ (τρεις επαναλήψεις το καθένα) ήταν άργυρο σύμφωνα με δημοσιευμένες διαδικασίες και σαρώνονται χρησιμοποιώντας ένα σάρωση Atrix 1010 συν (Microtek, Ταϊβάν, Κίνα), και προκύπτουσες εικόνες αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageMaster 2D λευκόχρυσου (Amersham Bioscience) για την ανίχνευση σημείο, ποσοτικοποίηση και συγκριτική και στατιστικές αναλύσεις. Εντοπίστηκε κηλίδες και τέσσερα σημεία ελέγχου σε nonstained περιοχές γέλης αποκόπηκαν (περίπου 1-mm

3 κύβοι) από τις γέλες χρωματίζονται με Coomassie Brilliant Blue. Η προετοιμασία των δειγμάτων για τη μήτρα με τη βοήθεια λέιζερ εκρόφησης /ιονισμού ώρα της πτήσης (MALDI-TOF).

διπλό ή Triple-Label ανοσοφθορισμού Ομοεστιακή Μικροσκοπία

κύτταρα MFC μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και επεξεργασία για ανοσοφθορισμό, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10], εκτός από το ότι Cy5-, χρησιμοποιήθηκαν φλουορεσκεΐνη isothiocyanate- ή /και τετραμεθυλροδαμίνη Β ισοθειοκυανική-επισημασμένο δευτερογενή αντισώματα (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, ΡΑ). Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν σύντομα σε PBS και τοποθετήθηκαν σε γυάλινες πλάκες με τη χρήση παρατείνουν αντιξεθωριάσματος κιτ αντιδραστηρίου στερέωσης (Molecular Probes). Τα κύτταρα έγιναν ορατά με ένα Axiovert S100 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Carl Zeiss) συζευγμένο με μία μονάδα CARV συνεστιακή (Atto Bioscience, Rockville, MD) και Hg φως ατμών πηγή. Εικόνες συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση του λογισμικού Openlab 3.0.9 (Improvision, Lexington, ΜΑ) με ένα ORCA-ER ψηφιακή κάμερα (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu City, Japan) και σετ φίλτρων για φλουορεσκεΐνη ισοθειοκυανικό (484 nm), τετραμεθυλοροδαμίνης ισοθειοκυανική Β (555 nm ) και Cy5 (650). Η ανάλυση εικόνας του συνεστιακού εικόνων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του Adobe Photoshop 5.5. Ώστε να γίνουν συγκρίσεις της έντασης, θα χρησιμοποιηθούν παρόμοιες συνθήκες για τη συλλογή και επεξεργασία φωτογραφιών μέσα σε κάθε πείραμα.

Δυτική κηλίδες

Όπως προαναφέρθηκε [11], 30 μg πρωτεΐνης από κάθε υποδεικνύεται θεραπείες διαχωρίζεται από 10% ηλεκτροφόρηση γέλης SDS-πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) (Millipore, Bedford, ΜΑ). Μετά από αποκλεισμό με 10% γάλα για 30 λεπτά, οι μεμβράνες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα όλη τη νύχτα στους 4 ° C που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενή αντισώματα για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η σύνδεση αντισώματος ανιχνεύθηκε με το σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL). Western blots αποτελέσματα ποσοτικοποιήθηκαν με το λογισμικό Image J.

Βιοτινυλίωση των πρωτεϊνών επιφανείας κυττάρου MFC

Βιοτινυλίωση και ανάκτηση των πρωτεϊνών επιφανείας κυττάρου διεξήχθησαν με μία μέθοδο προσαρμοσμένη από την αναφορά [1]. Εν συντομία, 15 × 10

6 MFC κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πάγο και πλύθηκαν τρεις φορές με παγωμένο PBS-Ca

2 +-Mg

2+ (PBS με 0,1 mM ΟαΟ

2 και 1 mM MgCl

2). πρωτεΐνες μεμβράνης στη συνέχεια βιοτινυλιώθηκε με μια 30 λεπτών επώαση στους 4 ° C με NHS-SS-βιοτίνη 1,5 mg /ml (Pierce) πρόσφατα αραιωμένου σε ρυθμιστικό βιοτινυλίωσης (10 mM τριαιθανολαμίνη, 2 mM ΟαΟ

2, 150 mM NaCl, ρΗ 7.5) με ήπια ανάδευση. κύτταρα MFC ξεπλύθηκαν με PBS-Ca

2 +-Mg

2+ + γλυκίνη (100 mM) και πλύθηκαν σε αυτό το ρυθμιστικό για 20 λεπτά στους 4 ° C για τη σβέση δεν αντέδρασε βιοτίνη. Τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν δύο φορές με PBS-Ca

2 +-Mg

2+, ξύνεται σε ψυχρό PBS, και σβωλοποιήθηκαν στις 3000 rpm στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια διαλύθηκαν για 45 λεπτά σε 600 μΐ ρυθμιστικού λύσης (1% Triton Χ-100, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM Tris, ρΗ 7.5) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση στα 14.000 χ g για 10 λεπτά στους 4 ° C, και τα υπερκείμενα επωάστηκαν όλη τη νύκτα με συσκευασμένα στρεπταβιδίνης-αγαρόζης για να ανακτήσει βιοτινυλιωμένες πρωτεΐνες. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση, και ελήφθησαν δείγματα από τα υπερκείμενα να εκπροσωπεί την μη δεσμευμένο, ενδοκυτταρική ομάδα των πρωτεϊνών. Βιοτινυλιωμένα πρωτεΐνες εκλούστηκαν από τα σφαιρίδια με θέρμανση στους 100 ° C για 5 λεπτά σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS-PAGE πριν από τη φόρτωση σε ένα 10% πήκτωμα SDS-PAGE. Για να εξασφαλιστεί η απουσία διαρροής της βιοτίνης εντός των κυττάρων, επαληθεύσαμε συστηματικά την απουσία της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης ακτίνης σε βιοτινυλιωμένη εκχυλίσματα.

Ανοσοκαθίζηση (ΙΡ)

Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [11], τα κύτταρα επεξεργασία με τα κατάλληλα ερεθίσματα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, 200 mM NaCl (ρΗ 7,4), 1% Triton Χ-100, 10% γλυκερόλη, 0,3 mM EDTA, 0,2 mM Na3VO4, και κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Roche Diagnostics, Indianapolis, ΙΝ) . Κλάσματα των 600 μg των πρωτεϊνών από κάθε δείγμα προκαταρκτική διαύγαση με επώαση με 20 μΙ πρωτεΐνης Α /G Sepharose (σφαιρίδια) (Amersham, IL) για 1 ώρα στους 4 ° C. Προδιαυγασθέν δείγματα επωάστηκαν με αντι-Calreticulin (CRT) αντίσωμα (CS-2891, Cell Signaling Tech), ή αντι-DNA-PKcs (sc-9051, Santa Cruz αντισώματα) σε ρυθμιστικό λύσης όλη τη νύκτα στους 4 ° C. 30 μΙ σφαιριδίων πρωτεΐνης Α /Ο προστέθηκαν και τα δείγματα επωάστηκαν για 2 ώρες στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν πέντε φορές με ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο διάλυμα (PBS) και μία φορά με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, βραστά, διαχωρίστηκαν με 10% SDS-PAGE, και μεταφέρθηκαν σε μία μεμβράνη PVDF που ακολουθείται από ανάλυση Western blotting όπως περιγράφεται παραπάνω.

CRT-Ομοεστιακή ανοσο-φθορισμός

τα καρκινικά κύτταρα με ενδεικνυόμενη θεραπεία μονιμοποιήθηκαν και αποκλείστηκαν με 10% BSA σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-Καλρετικουλίνης 1:100 κουνελιού (CRT) αντίσωμα ( CS-2891, Cell Signaling Tech) για 1 ώρα (δοκιμή CRT μετατόπιση) που ακολουθείται από FITC-αντι-κουνελιού δευτερογενές αντίσωμα (Cell Signaling Tech, ΜΑ) σε 1:100 για 30 λεπτά και CRT ανοσο-φθορισμός παρατηρήθηκε σε ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο (Leica TCS SMD FCS, Leica, Γερμανία), η Hoechst 33342 χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση της πυρηνικής ενέργειας.

Μικρές παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) μελέτες νοκ ντάουν

Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11], siRNA για PERK (SC-36214), DNA-PKcs (SC-35200) ή Ρ22 (SC-142330) αγοράστηκε από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ένα πλήρες μέσο που δεν περιέχει αντιβιοτικά για 4 ημέρες. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε ένα 6-φρεατίων 1 ημέρα πριν από την επιμόλυνση και καλλιεργήθηκαν σε 60% συρροή την επόμενη ημέρα. Για πειράματα RNAi, 6,25 μΙ Lipofectamine ™ LTX μαζί 2,5 μl αντιδραστηρίου PLUS ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) αραιώθηκε σε 90 μΐ DMEM για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, 10 μΐ του siRNA (20 μΜ) αναμίχθηκε με ϋΜΕΜ που περιέχει Lipofectamine μαζί με PLUS αντιδραστήριο και επωάστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για το σχηματισμό συμπλόκου. Τέλος, το σύμπλοκο προστέθηκε στα φρεάτια που περιέχουν μέσο 2 ml με 100 ηΜ τελική συγκέντρωση siRNA. Ρ22 (ab56953, Abcam) ή PERK έκφραση της πρωτεΐνης (SC-13073, Σάντα Κρουζ) προσδιορίστηκε με κηλίδα Western 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

δραστικών μορφών οξυγόνου (ROS)

ανίχνευσης

Όπως περιγράφεται πριν [11], τα καρκινικά κύτταρα είχαν προ-φορτωμένο με 1 μΜ φθορίζουσα χρωστική διυδροροδαμίνη (DHR) (Invitrogen, Carlsbad, CA) δύο ώρες πριν υποδεικνύεται θεραπείες, οι οποίες αντιδρούν με ROS στα κύτταρα και οδηγεί σε μια αλλαγή του φθορισμού. Μετά από θεραπεία με υποδεικνύεται θεραπείες, τα καρκινικά κύτταρα τρυψινοποιήθηκαν, εναιωρήθηκαν σε παγωμένο PBS και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθυλική αλκοόλη σε -20 ° C. Οι αλλαγές στον φθορισμό στα κύτταρα αγωγή με φάρμακο ποσοτικοποιήθηκαν με ανάλυση FACS. Η επαγωγή της παραγωγής ROS εκφράστηκε σε αυθαίρετες μονάδες. παραγωγή ROS ανιχνεύθηκε επίσης από την οπτικοποίηση διϋδροροδαμίνη φθορισμού (DHR) σύμφωνα με συνεστιακή μικροσκοπία ανοσο-φθορισμού.

Μέτρηση εξωκυττάρια επίπεδα ΑΤΡ

σύνθεση ΑΤΡ μετρήθηκε στα κύτταρα MFC στο πλαίσιο των διαφόρων θεραπεία wogonin. Σε sextuplicates, 5 × 10

3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κάθε φρεάτιο μιας πλάκας 96 φρεατίων. Μετά από επώαση στους 37 ° C για 24 ώρες, η ποσότητα του ΑΤΡ στο υπερκείμενο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το Κιτ Προσδιορισμός ATP Molecular Probes (Kaiji, Nanjing) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Το κιτ αυτό βασίζεται στην ανίχνευση του ΑΤΡ βιοφωταύγεια, χρησιμοποιώντας λουσιφεράση πυγολαμπίδας ανασυνδυασμένου και του υποστρώματος του, λουσιφερίνη. Η ολική χημειοφωταύγεια συλλέχθηκε με ένα φωτόμετρο. Η ποσότητα της ΑΤΡ από ένα διάλυμα δοκιμής προσδιορίστηκε ποσοτικά με σύγκριση προς μία καμπύλη βαθμονόμησης χρησιμοποιώντας ΑΤΡ ως το πρότυπο

Cytokine Ποσοτικοποίηση

MFC καρκινικά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υποδεικνύεται θεραπείες για 36 ώρες.? υπερκείμενο δείγματα συλλέχθηκαν και αξιολογήθηκαν για HMGB1 χρησιμοποιώντας κιτ ELISA (Shino-Test Corporation, ST51011) σύμφωνα με το πρωτόκολλο της. Για την απελευθέρωση κυτοκίνης, MoDCs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπερκείμενο κυττάρων MFC για 24 ώρες, το υπερκείμενο της MoDCs συλλέχθηκαν και αξιολογήθηκαν για IL-6 (IL-6 ποντικού ELISA Kit, BD OptEIA, 550950) και TNF-α (ΤΝΡ-α ποντικού ELISA Kit, BD OptEIA, 560478) σύμφωνα με τα πρωτόκολλα τους.

In vivo πείραμα κυττάρων εμβολιασμού κατά του όγκου

3 × 10

6 MFC κύτταρα, αιωρούμενα σε 200 ml PBS, είτε αριστερά ακατέργαστα ή κατεργασμένα με wogonin (100 μΜ) για 4 ώρες. Wogonin επεξεργασμένα κύτταρα MFC εμβολιάσθηκαν υποδορίως στο κατώτερο πλευρό του 6-εβδομάδων θηλυκά 615 ποντικούς (Στρατιωτική Ιατρικών Επιστημών, Πεκίνο), ενώ 5 × 10

5 ακατέργαστα κύτταρα εμβολιάστηκαν στην ετερόπλευρη πλευρά 7 ημέρες αργότερα όπως περιγράφεται στο προηγούμενη μελέτη [1].

φαγοκυττάρωση δοκιμασία

Η δοκιμασία φαγοκυττάρωσης διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [12]. MoDCs ρυθμίστηκαν σε 2,5 × 10

4cells /ml σε μέσο ϋΜΕΜ και καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων στους 37 ° C και 5% CO2. Αυτοί αφέθηκαν να προσκολληθούν για 24 ώρες, στο οποίο σημείο τα κύτταρα σημάνθηκαν με 4 μΜ ΡΚΗ26. Παρασκευάσαμε κύτταρα MFC που ήταν είτε χωρίς θεραπεία ή θεραπεία για διαφορετική συγκέντρωση wogonin (50, 100 και 200 ​​μΜ) για 2 ώρες. Μετά MoDCs πλύθηκαν με ψυχρό PBS τρεις φορές, MFC κύτταρα επισημαίνονται με 0,5 μΜ CFSE προστέθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων για δοκιμασίες φαγοκυττάρωσης. Μετά από 15 λεπτά στους 37 ° C, φαγοκυττάρωση παρατηρήθηκε από το λογισμικό Leica DFC 450C, χρησιμοποιώντας το λογισμικό επεξεργασίας και ανάλυσης εικόνας ImageJ1.38 τον υπολογισμό του ποσοστού των MoDCs που τυλίχθηκε τουλάχιστον ένα κύτταρο όγκου σε τουλάχιστον 100 κύτταρα.

η στατιστική ανάλυση

Οι τιμές στα στοιχεία εκφράζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση (SD). Τα ποσά σε αυτή τη μελέτη ήταν οι εκπρόσωποι των περισσότερων από 3 διαφορετικά πειράματα. Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων μεταξύ του ελέγχου και θεραπείας των ομάδων έγινε με έναν σπουδαστή t τεστ. Οι τιμές των p & lt?. 0.05 θεωρήθηκαν ως στατιστικά σημαντικές

Αποτελέσματα

Wogonin που προκαλείται Καλρετικουλίνης (CRT) μετατόπιση σε μεμβράνη κυτταρικής επιφάνειας εξαρτάται από την PERK και PI3K /AKT

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μια εξωτερική παροχή των σημάτων που επάγουν την έκθεση μεμβράνη Καλρετικουλίνης (CRT) του πλάσματος, που ενεργεί ως σηματοδότηση «τρώνε me», η οποία προσδίδει ανοσογονικότητα σε διαφορετικά μη ανοσογόνος κυτταρικό θάνατο, επιτρέποντας για μια βέλτιστη αντικαρκινική χημειοθεραπεία [1]. Επόμενο ελέγξαμε εάν wogonin θα μπορούσε επίσης να συμπεριφέρονται παρόμοια με τα καρκινικά κύτταρα MFC. Όπως μπορείτε να δείτε στην εικόνα. 1Α, wogonin (100 μm) που προκαλείται ισχυρή CRT μετατόπιση κυτταρική επιφάνεια σε καρκινικά κύτταρα MFC σε όπως ανιχνεύεται με Western blots επιφάνεια CRT δοκιμής κυττάρου. Μεταξύ των οδών σήματος που ρυθμίζει CRT μετατόπιση και τα αντίστοιχα ανοσογόνα κυτταρικού θανάτου /απόπτωσης, αυτό έχει πλέον καθιερωθεί ότι η προ-αποπτωτική ER στρες και η φωσφορυλίωση του παράγοντα 2α ευκαρυωτικό έναρξης μετάφρασης (eIF2α) και ανάντη σήμα κινάση πρωτεΐνης κινάση R-σαν ενδοπλασματικό κινάσης δίκτυο (PERK) είναι οι κυριότερες [13]. Η φωσφορυλίωση του eIF2α από την PERK προχωρητική μεταφορά του CRT από το ER στη συσκευή Golgi και εξωκύττωση των κυστιδίων CRT που περιέχουν, τελικά οδηγεί σε CRT μετατόπιση πάνω στην επιφάνεια της μεμβράνης του πλάσματος, το οποίο χρησιμεύει ως κλειδί «τρώνε-me» σήμα [1 ], [4], [14] – [17]. Εδώ, βρήκαμε ότι νοκ ντάουν PERK με στόχο siRNA σε μεγάλο βαθμό ανέστειλε CRT μετατόπιση από wogonin (Εικ. 1Α), υποδεικνύοντας πιθανή εμπλοκή της PERK και ER στρες σε αυτή τη διαδικασία. Παραδόξως, ΡΙ3Κ /ΑΚΤ αναστολή είτε φαρμακολογικές αναστολέα (LY 294002 και ΑΚΤ αναστολέα Χ) ή γενετική knockdown (χρησιμοποιώντας ΑΚΤ1 /2 διπλά knockout ΠΜΑ) επίσης σε μεγάλο βαθμό ανέστειλε CRT μετατόπισης (Σχ. 1 Β-D), η επίδραση της αναστολής ΑΚΤ επί wogonin επαγόμενη μετατόπιση CRT επιβεβαιώθηκε επίσης με δοκιμασία συνεστιακή ανοσο-φθορισμό όπως φαίνεται στο Σχ. 1C. Στο σύνολό τους, διαπιστώσαμε ότι wogonin προκαλεί CRT μετατόπιση στην επιφάνεια των κυττάρων του πλάσματος, PERK και PI3K /AKT μπορεί να εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία.

Η γαστρική κυτταρική γραμμή καρκινώματος κύτταρα MFC επιμολύνονται με αγωνίζομαι siRNA (Ctrl, 200 nM) ή PERK siRNA (200 ηΜ), μετά από 48 ώρες, το επίπεδο έκφρασης PERK ανιχνεύθηκε με κηλίδες Western για την επαλήθευση PERK επίπεδο μετά τη θεραπεία siRNA. Επιτυχώς PERK knockdown κύτταρα και τα κύτταρα ελέγχου τους (Ctrl siRNA επεξεργασμένα κύτταρα) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με wogonin (100 μΜ) για 2 και 4 ώρες. Οι πρωτεΐνες επιφανείας κυττάρου στο κλάσμα μεμβράνης του πλάσματος ήταν από βιοτινυλιωμένα και δοκιμάστηκαν για CRT, EGFR και ακτίνη. Συνολικά κυτταρικό λύμα ελήφθησαν επίσης να δοκιμαστεί CRT, PERK και ακτίνη (Α). κύτταρα MFC προκατεργάστηκαν με ΑΚΤ ειδικό αναστολέα X (ΑΚΤΗ 100 ηΜ) ή ΡΙ3Κ /αναστολέα ΑΚΤ LY294002 (100 ηΜ) για 2 ώρες, ακολουθούμενη από wogonin (100 μΜ) σε αγωγή για 2 και 4 ώρες, CRT, EGFR και ακτίνης στο πλάσμα κλάσμα μεμβράνης πρωτεΐνη ανιχνεύθηκαν με Western blots. CRT, ρ-ΑΚΤ (Ser 473), ΑΚΤ1 /2 και ακτίνης στο συνολικό προϊόν λύσης κυττάρου ανιχνεύθηκαν επίσης με στυπώματα Western (Β) .crt μετατόπιση προς κυτταρική επιφάνεια μετά wogonin θεραπεία επιβεβαιώθηκε επίσης με συνεστιακή μικροσκοπία ανοσο-φθορισμού, ο μετατόπιση ήταν αναστέλλεται από αναστολέα Akt X (ΑΚΤΗ 100 ηΜ), δοξορουβικίνη (Dox, 1 μΜ, επεξεργασία 2 ώρες) χρησιμοποιήθηκε εδώ ως θετικοί έλεγχοι. (ΝΤΟ). WT και ΑΚΤ1 /2 διπλά knockout MEFs υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με wogonin (100 μΜ) για 4 ώρες? CRT, EGFR και ακτίνης στο κλάσμα πρωτεΐνης μεμβράνης πλάσματος ανιχνεύθηκαν με Western blots. P-S6 (S235 /236), ρ-ΑΚΤ (S473), ΑΚΤ1 /2, CRT και ακτίνης στο προϊόν λύσης ολικού κυττάρου ανιχνεύθηκαν με Western blots (D). Πειράματα σε αυτό το σχήμα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα. Bar = 10 μm.

Η

Wogonin προκαλεί εξαρτάται ROS απάντηση ER στρες, αποκόπτοντας ως ανάντη σήμα για την ενεργοποίηση της PI3K μονοπατιού /AKT

Όπως συζητήσαμε παραπάνω, τα τρέχοντα δεδομένα μας δείχνουν ότι ότι προκαλείται από wogonin μετατόπιση CRT, και PERK και PI3K οδός /AKT μπορούν να συμμετέχουν σε αυτή τη διαδικασία. Επόμενο προσπαθήσαμε να αναλύσουμε αυτό το σηματοδοτικό μονοπάτι. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Α, wogonin (100 μΜ) προκάλεσε μια προφανή ενεργοποίηση ΡΙ3Κ /ΑΚΤ σε κύτταρα MFC σε σύντομο χρονικό διάστημα (έως και 2 ώρες)? Είναι ενδιαφέρον AKT ενεργοποίηση ρυθμίζεται προς τα κάτω μετά από μακροχρόνια έκθεση των wogonin (Εικ. 2Α και Β). Ταυτόχρονα, η έκθεση των wogonin επάγεται επίσης μια προφανή απάντηση ER όπως αποδεικνύεται από την ισχυρή φωσφορυλίωση πρωτεϊνών ER στρες (PERK, PKR και eIF2α) σε κατεργασμένα wogonin κύτταρα MFC (Σχ. 2C). PERK siRNA knockdown, η οποία έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλει CRT μετατόπιση (Εικ. 1Α), σε μεγάλο βαθμό ανέστειλαν wogonin επαγόμενη φωσφορυλίωση των eIF2α και ενεργοποίηση /ΑΚΤ ΡΙ3Κ σε κύτταρα MFC (Εικ. 2D και Ε), υποδεικνύοντας ότι PERK χρησιμεύει ως το ανάντη σήματος για wogonin που προκαλείται σηματοδότησης PI3K /AKT. Με την προσπάθεια να προσδιορίσει το ανάντη σήματος για επαγόμενη wogonin ER στρες και PERK φωσφορυλίωση, βρήκαμε ότι σημαντική παραγωγή ROS (Εικ. 2F και G), PERK /PKR φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση ΡΙ3Κ /ΑΚΤ /mTORC1 ενεργοποιείται από wogonin ανεστάλησαν σε μεγάλο βαθμό από αντι- οξειδωτικό Ν-ακετυλο-κυστεΐνη (NAC) (Σχ. 2G-Η). Με βάση αυτό, προτείνουμε ότι ROS τροποποιεί τις πρωτεΐνες ER και προκαλούν αντίδραση στο στρες ER, η οποία οδηγεί σε PERK /PKR μεσολάβηση φωσφορυλίωση eIF2α και η επακόλουθη ενεργοποίησή PI3K /AKT, το οποίο διευθύνει CRT μετατόπιση και μια πιθανή «τρώνε-me» σήμα.

κυτταρική γραμμή γαστρικού καρκινώματος κύτταρα MFC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με wogonin (100 μΜ) για δεικνυόμενα χρονικά σημεία, ΑΚΤ και κατάντη ενεργοποίηση mTORC1 ανιχνεύθηκαν με western blots με χρήση υποδεικνυόμενα αντισώματα, ΑΚΤ1 /2, S6K, S6 και β-ακτίνης δοκιμάστηκαν επίσης ως ισότιμοι φορτίσεις (Α). φωσφορυλίωση AKT ήταν ποσοτικά με τη χρήση του λογισμικού J Image μετά από κανονικοποίηση ως προς την ΑΚΤ1 /2 (Β). Σημειώστε ότι Wogonin προκάλεσε μια πρώιμη ενεργοποίηση αλλά αργότερα αναστολή της ΑΚΤ. κύτταρα MFC υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με wogonin (100 μΜ) για δεικνυόμενα χρονικά σημεία, ρ-PERK (Thr980), ρ-eIF2-α (ser51), ρ-PKR (Thr446 /451), που αντιστοιχεί πρωτεΐνες μη-φωσφο τους και ΑΚΤ1 /2 ανιχνεύθηκαν με Western blots (C). κύτταρα MFC επιμολύνθηκαν με PERK siRNA για 48 ώρες, επιμολυσμένα με επιτυχία κύτταρα (που επιβεβαιώνεται με κηλίδα western) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με wogonin (100 μΜ) για 1 ώρα, ρ-PERK (Thr980), ρ-eIF2-α (ser51), ρ- ΑΚΤ (Ser 473), ρ-4E-BP1 (Ser 65), PERK, αντίστοιχες πρωτεΐνες μη-φωσφο και β-ακτίνη ανιχνεύθηκαν με Western blots (D) τους, η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό J Image μετά κανονικοποιήθηκαν σε ΑΚΤ1 /2 (Ε). MFC Τα κύτταρα προ-θεραπεία με αντι-οξειδωτικό Ν-ακετυλο-κυστεΐνη (NAC, 400 μΜ) για 2 ώρες, ακολουθούμενη από wogonin (100 μΜ) αγωγή για 30 λεπτά, η παραγωγή ROS ανιχνεύθηκαν τόσο φθορισμού (F) και FACS ( G) δοκιμασία αντίστοιχα, όπως περιγράφεται παραπάνω. MFC Τα κύτταρα προ-θεραπεία με αντι-οξειδωτικό Ν-ακετυλο-κυστεΐνη (NAC, 400 μΜ) για 2 ώρες, ακολουθούμενη από wogonin (100 μΜ) για 30 και 60 λεπτά, ρ-PERK (Thr980), ρ-PKR (Thr446 /451), ρ-4E-BP1 (Ser 65), ρ-ΑΚΤ (Ser 473) και αντίστοιχες πρωτεΐνες μη-φωσφο τους ανιχνεύθηκαν με Western blots (H). Πειράματα σε αυτό το σχήμα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα.

#

P

& lt? 0,05 vs. ομάδα ελέγχου siRNA. *

P

& lt? 0,05 vs. ομάδα χωρίς NAC προεπεξεργασίας. Bar = 10 μm.

Η

DNA-PKcs, σχηματίζει ένα σύμπλοκο με PERK, διαμεσολαβεί ενεργοποίηση ΑΚΤ από Wogonin

Είμαστε δίπλα προσπάθησε να εντοπίζεται το ενδιάμεσο παίκτης της ενεργοποίησης ΑΚΤ από PERK με εστίαση επί DNA-PKcs, ένα πρόσφατα ανακαλυφθέν μέλος της ΡΙ3Κ που μπορούν να ενεργοποιήσουν ΑΚΤ [18] – [20]. DNA-PK αποτελείται από μια καταλυτική υπομονάδα 470-kDa (DNA-PKcs) και το σύμπλοκο αντιγόνου Ku (Κυ80 /Κυ70) και εμπλέκονται σε V (D) J ανασυνδυασμό, επιδιόρθωση του DNA διαλείμματα διπλού κλώνου με μη ομόλογη τέλος ενώνει, απόπτωση, και ρύθμιση της μεταγραφής [21] .Significantly, τώρα είναι καλά τεκμηριωμένο ότι το DNA-PKcs, ως μέλος της οικογένειας PI3K, ρυθμίζει επίσης την φωσφορυλίωση της ΑΚΤ [22]. Επιπλέον, ένας ρόλος για ΟΝΑ-ΡΚ στην ενεργοποίηση του ΑΚΤ με CpG-DNA έχει καθιερωθεί χρησιμοποιώντας μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών [23]. Επιπλέον, Bozulic et al. έδειξε ότι το DNA-ΡΚ φωσφορυλιώνει ΑΚΤ κατά την επαγωγή των θραύσεων διπλής έλικος DNA [19]. Επίσης, η απαίτηση του DNA-PK να φωσφορυλιώνει ΑΚΤ σε απάντηση σε ιοντίζουσα ακτινοβολία ιδρύθηκε επίσης in vivo [19]. Έτσι, την επόμενη, δοκιμάσαμε την πιθανή εμπλοκή του DNA-PKcs στην επαγόμενη wogonin ΑΚΤ φωσφορυλίωση. Ένα μικρό μοριακό αναστολέας της DNA-PKcs, Nu7062, χρησιμοποιήθηκε ειδικά εδώ για να αναστέλλουν δραστικότητα DNA-PKcs. Σε κύτταρα προκατεργάστηκαν με Nu7026, wogonin επαγόμενη ΑΚΤ φωσφορυλίωση καταργήθηκε σχεδόν ολοκληρωτικά (Σχ. 3Α). Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την υπόθεσή μας ότι το DNA-PKcs θα μπορούσε να είναι το κλειδί μεταξύ μεσολαβεί για την επαγόμενη wogonin ενεργοποίηση ΑΚΤ. Για να δοκιμαστεί αυτή η περαιτέρω, συγκεκριμένες siRNA έναντι DNA-PKcs χρησιμοποιήθηκαν εδώ για να knockdown DNA-PKcs. Σε πλήρη υποστήριξη των δεδομένων μας από τις μελέτες NU7026, φωσφορυλίωση ΑΚΤ τόσο Ser473 και Thr308 ήταν σε μεγάλο βαθμό μειωμένη σε κύτταρα επεξεργασμένα wogonin εξαντλούνται του DNA-PKcs (Σχ. 3Β). Είναι σημαντικό ότι, βρήκαμε ότι η DNA-PKcs, ΑΚΤ και PERK σχηματίζουν ένα συγκρότημα στο Wogonin επεξεργασμένα κύτταρα, η οποία αντιστρέφεται με προ-κατεργασία με DNA-PKcs αναστολέα Nu 7062 (Σχ. 3C), με βάση αυτές τις πληροφορίες, προτείνουμε ότι DNA- PKcs, σχηματίζει ένα σύμπλοκο με PERK, διαμεσολαβεί ενεργοποίηση ΑΚΤ με wogonin. Ωστόσο, η λεπτομερής μηχανισμός με τον οποίο DNA-PKcs φωσφορυλιώνει ΑΚΤ σε κύτταρα κατεργασμένα wogonin χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση.

κυτταρική γραμμή γαστρικού καρκινώματος MFC κύτταρα προ-επεξεργασία με ένα αναστολέα DNA-PKcs (Αρ 7062, 10 μΜ) για 2 ωρών, ακολουθούμενο από wogonin (100 μΜ) αγωγή για 1 έως 2 ώρες, η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western και DNA-PKcs και ΑΚΤ1 /2 ανιχνεύθηκαν ως ίσες φορτίσεις (Α). MCF-7 κύτταρο μεταμολύνθηκαν με σκαρφάλωμα (Ctrl, 200 ηΜ) ή DNA-PKcs (200 ηΜ) για 48 ώρες με τη χρήση μεθόδων μορφομετατροπής νεύμα παραπάνω, επιτυχής επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο σηματοδότησης ΑΚΤ σε κατεργασμένα wogonin κύτταρα MFC (Β). MFC Τα κύτταρα προ-επεξεργασία με ένα αναστολέα DNA-PKcs (Αρ 7062, 10 μΜ) επί 2 ώρες, ακολουθούμενη από wogonin (100 μΜ) αγωγή για 1 ώρα, οι προκαταρκτική διαύγαση 600-μg κλάσματα κυτταρολυμάτων επωάστηκαν με αντι-DNA -PKcs, ακολουθούμενη από ανάλυση Western blotting με αντι-DNA-PKcs, ΑΚΤ, PERK, Κυ80, IgG και β-ακτίνης αντίστοιχα (C). Πειράματα σε αυτό το σχήμα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον 3 φορές και ελήφθησαν παρόμοια αποτελέσματα.

* P & lt? 0,05 vs. ομάδα χωρίς Nu7062,

* P & lt?. 0,05 vs. ομάδα χωρίς DNA-PKcs νοκ ντάουν

Η

εντοπίζεται Αννεξίνη Α1 και p22 ως πιθανοί στόχοι της wogonin

Για να εντοπίζεται περαιτέρω πιθανοί στόχοι της wogonin, εφαρμόστηκε εδώ ένα δισδιάστατο (2D) ηλεκτροφόρησης γέλης συν ανάλυση πρωτεϊνική μάζα φασματομετρία. Παρασκευάσαμε ολόκληρες πρωτεΐνες κυττάρου από κυτταρική γραμμή γαστρικού καρκινώματος ΜΚΝ-45 κύτταρα τα οποία είτε ήταν μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα για διαφορετική συγκέντρωση wogonin (50, 100 και 200 ​​μΜ) για 24 ώρες. Σύγκριση των δύο διαστάσεων (2D) ηλεκτροφόρησης, που ακολουθείται από μάζα φασματοσκοπικές αναλύσεις, οδήγησε στην ταυτοποίηση της HMGB1 (υψηλής κινητικότητας ομάδα πρωτεΐνη 1), Ρ22 και αννεξίνη Α1 ως πρωτεΐνες που ήταν έντονα επάγεται από wogonin κατεργασία σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο ( Το Σχ. 4Α και Β). Αννεξίνη Α1 είναι το πρώτο χαρακτηρισμένο μέλος της οικογένειας των πρωτεϊνών αννεξίνης ικανό να συνδέεται (δηλαδή να προσαρτήσει) σε κυτταρικές μεμβράνες σε ένα εξαρτώμενο από ασβέστιο τρόπο. Αρχικά περιγράφεται ως ανασταλτικά της πρωτεΐνης φωσφολιπάσης Α2 (PLA2), Annexin Α1 μπορεί να επηρεάσει πολλά συστατικά της φλεγμονώδους αντίδρασης, εκτός από το μεταβολισμό του αραχιδονικού οξέος [24], [25]. Το ενδιαφέρον είναι ότι η αννεξίνη Α1 έχει πρόσφατα εμπλακεί στην αποπτωτικό κυτταρικό «τρώνε me» σήματος και επακόλουθη φαγοκυττάρωση, και συσσωρεύονται αποδείξεις για να υποστηρίξει ένα ρόλο στη φάση ανάλυση της φλεγμονής. Ένα έγγραφο από Arur et al. κομψά απέδειξε ότι αννεξίνη Α1 θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια ενδογενής φωσφατιδυλοσερίνη (PS) συνδέτη [26], μεσολαβώντας εγκόλπωση των αποπτωτικών κυττάρων. Αννεξίνη Α1 έχει προσληφθεί στο PS-πλούσια περιοχή της κυτταρικής επιφάνειας και μεσολαβεί «τρώνε-me» σήμα και να απελευθερώσει την κυτταρική ασβέστιο [26]. Συγκεκριμένα, βρήκαμε ότι αννεξίνης Α1 καθώς και πρωτεΐνη δέσμευσης ασβεστίου p22 ήταν τόσο η έκθεση σε κυτταρική επιφάνεια μετά wogonin αγωγή όπως μετράται από Western blot πρωτεϊνών επιφανείας δοκιμής κυττάρου (Εικ. 4C). Όπως φαίνεται στο Σχ.