Αφηρημένο

Η ανώμαλη ενεργοποίηση της PI3K σηματοδότησης /AKT αντιπροσωπεύει μία από τις πιο κοινές μοριακές αλλαγές στον καρκίνο του πνεύμονα, αν και η σχετική συμβολή των μεμονωμένων συστατικών του καταρράκτη στην ανάπτυξη NSCLC είναι ακόμα επαρκώς καθορισμένα. Σε αυτό το χειρόγραφο ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ έκφρασης και γενετικές μεταβολές των συνιστωσών της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού [KRAS, η καταλυτική υπομονάδα της ΡΙ3Κ (ρ110α), ΡΤΕΝ, ΑΚΤ1 και ΑΚΤ2] και την ενεργοποίηση των ΑΚΤ σε 107 χειρουργικά NSCLCs και έχουν αναλύσει τις υπάρχουσες σχέσεις με κλινικο-παθολογικές χαρακτηριστικά. ανάλυση της έκφρασης εκτελέστηκε με ανοσοϊστοχημεία για ιστών Micro συστοιχίες (TMA)? ανάλυση μετάλλαξης διεξήχθη με ανάλυση αλληλουχίας DNA? παραλλαγή αριθμός αντιγράφων προσδιορίστηκε με τη μέθοδο FISH. Αναφέρουμε ότι η ενεργοποίηση των ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οδού σε ασθενείς ιταλικά NSCLC σχετίζεται με υψηλού βαθμού (G3-G4 σε σύγκριση με G1-G2? Η = 83? Ρ & lt? 0,05) και πιο προχωρημένη νόσο (στάδιο TNM III εναντίον στάδια Ι και II ? η = 26? ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, βρήκαμε ότι η απώλεια του ΡΤΕΝ (41/104, 39%) και την υπερέκφραση του ρ110α (27/92, 29%) αντιπροσωπεύουν την πιο συχνή εκτροπή που παρατηρείται σε NSCLCs. Λιγότερο συχνές μοριακές αλλοιώσεις περιελάμβανε την υπερέκφραση του ΑΚΤ2 (18/83, 22%) ή ΑΚΤ1 (17/96, 18%), και KRAS μετάλλαξη (7/63, 11%). Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, μεταξύ όλων των γονιδίων, μόνο ρ110α υπερέκφραση συσχετίστηκε σημαντικά με την ενεργοποίηση ΑΚΤ σε NSCLCs (p = 0.02). Χειραγώγηση της ρ110α έκφραση στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων που φέρουν ενεργό αλληλόμορφο PI3K (NCI-Η460) αποτελεσματικά μειωμένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων NSCLC

in vitro

και ανάπτυξη του όγκου

in vivo

. Τέλος, RNA χαρακτηριστικών των επιθηλιακών κυττάρων του πνεύμονα (BEAS-2Β) που εκφράζει ένα μεταλλαγμένο αλληλόμορφο του PIK3 (E545K) προσδιόρισε ένα δίκτυο παραγόντων μεταγραφής όπως myc, FOS και HMGA1, δεν είχε αναγνωριστεί προηγουμένως ότι σχετίζονται με παρεκκλίνουσα σηματοδότηση ΡΙ3Κ στον καρκίνο του πνεύμονα.

Παράθεση: Scrima Μ, De Marco C, Fabiani F, Franco R, Pirozzi G, Rocco G, et al. (2012) Σηματοδοσίας δίκτυα που σχετίζονται με AKT ενεργοποίηση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC): νέες ιδέες σχετικά με το ρόλο της φωσφατιδυλο-ινοσιτόλη-3 κινάσης. PLoS ONE 7 (2): e30427. doi: 10.1371 /journal.pone.0030427

Επιμέλεια: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), Ιταλία

Ελήφθη: 25 Ιουλίου, 2011? Αποδεκτές: 16 Δεκέμβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 17, Φεβρουαρίου, 2012

Copyright: © 2012 Scrima et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από τον Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC) για GV και AW και από την Ευρωπαϊκή Ένωση (IP: CRESCENDO, σύμβαση n.er LSHM-CT-2005-018652), Ministero dell’Università e della Ricerca (ΠΡΙΝ, Επιχορήγηση n.er 2008CJ4SYW_004) να AW Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1], [2]. επιθηλιακό καρκίνο του πνεύμονα ταξινομούνται σε δύο κύριες ομάδες: καρκίνος του πνεύμονα μικρών κυττάρων (SCLC) (περίπου 15% όλων των καρκίνων του πνεύμονα) και καρκίνος μη-μικρών κυττάρων του πνεύμονα (NSCLC) (περίπου 85% όλων των καρκίνων του πνεύμονα) [3] . NSCLC περιλαμβάνει ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα (SCC), αδενοκαρκίνωμα (ADC), και καρκίνο του πνεύμονα μεγάλου-κυττάρου (LCC) [3]. Παρά τις προόδους στην έγκαιρη ανίχνευση και την τυπική θεραπεία, NSCLC είναι συχνά διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο και οι ασθενείς συχνά έχουν κακή πρόγνωση, με ποσοστό πενταετούς επιβίωσης λιγότερο από 15% [4], [5]. Για το λόγο αυτό η καλύτερη κατανόηση των μοριακών προέλευση της νόσου θα συμβάλει στη βελτίωση θεραπευτική αγωγή των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) καταρράκτη σηματοδότησης συχνά υπερενεργοποιημένος στο ανθρώπινο καρκίνος [6] – [8] παίζει έναν κρίσιμο ρόλο τόσο στην έναρξη και την πρόοδο του NSCLC [9], [10]. Η οδός ΡΙ3Κ ρυθμίζει κυτταρικές λειτουργίες όπως πολλαπλασιασμό, επιβίωση, την κινητικότητα και την αγγειογένεση που είναι κρίσιμα για την ανάπτυξη ή /και τη συντήρηση των όγκων [11], [12]. Το τελικό σημείο της οδού ΡΙ3Κ είναι ΑΚΤ, μια πρωτεϊνική κινάση σερίνης /θρεονίνης που μεσολαβεί τα περισσότερα σήματα διοχετεύονται μέσω της οδού ΡΙ3Κ. ΑΚΤ ενεργοποιείται από την πρόσληψη σε κυτταρική μεμβράνη μέσω δέσμευσης του χώρου ΡΗ του να 3′-φωσφορυλιωμένο φωσφατιδυλινοσιτόλες δημιουργούνται από ΡΙ3Κ και επακόλουθη φωσφορυλίωση στο T308 και S473 [12], [13]. Αντιστρόφως, το λιπίδιο φωσφατάση ΡΤΕΝ εξασθενεί ενεργοποίησης ΑΚΤ από αποφωσφορυλίωση θέση 3 ‘του φωσφατιδυλινοσιτόλες [14].

ανώμαλη ενεργοποίηση ΑΚΤ συμβάλλει στην καρκινογένεση του πνεύμονα [9], [10]. Υπερενεργοποίηση ΑΚΤ ανιχνεύεται σε περισσότερες κυτταρικές σειρές NSCLC [15] – [17], και 30-75% NSCLCs [18] – [22] και προωθεί την αντίσταση στη χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία [16]. ενεργοποίηση ΑΚΤ στον καρκίνο αυτή τη στιγμή αξιολογείται χρησιμοποιώντας φωσφο-ειδικά αντισώματα έναντι S473 σε ανοσοϊστοχημικές αναλύσεις των δειγμάτων όγκου. Παρά το γεγονός ότι η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ σε S473 έχει συσχετιστεί με φτωχή κλινικές εκβάσεις σε πολλούς τύπους όγκων, έχει ως αποτέλεσμα στον καρκίνο του πνεύμονα είναι προφανώς ασυνεπής [7] – [10] έχουν συνδέεται είτε με κακή ή καλή πρόγνωση [20] – [22]. ΑΚΤ μπορούν να ενεργοποιηθούν μέσω διαφόρων μηχανισμών, οι οποίες προκύπτουν από διακριτά και συχνά αλληλοαποκλειόμενες εκδηλώσεις που περιλαμβάνουν μεταλλάξεις ενεργοποίησης (KRAS, PIK3CA ή ΑΚΤ1), αυξημένη έκφραση (PIK3CA, ΑΚΤ1, ΑΚΤ2) ή απώλεια της ΡΤΕΝ [10]. Ωστόσο, η σχετική συμβολή των μεμονωμένων συστατικών μέσα στο μονοπάτι PI3K την ενεργοποίηση ΑΚΤ στην NSCLCs είναι ακόμα ασαφής. Σε αυτό το χειρόγραφο έχουμε ερευνήσει τη σχέση μεταξύ των γενετικών ανωμαλιών που υπάρχουν σε αυτά τα γονίδια και την ενεργοποίηση της ΑΚΤ στον NSCLC.

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

αυτοτέλειας των ασθενών ήταν διεξάγονται σύμφωνα με τις εσωτερικές επιτροπής αναθεώρησης του INT Fondazione Pascale (Νάπολη, Ιταλία) (CEI 556/10 της 03.12.2010). Η μελέτη εγκρίθηκε από την εσωτερική επιτροπής αναθεώρησης του AOU Mater Domini /Πανεπιστήμιο Magna Graecia (Καταντζάρο, Ιταλία) στη συνεδρίαση της 16/3/2011. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους συμμετέχοντες στη μελέτη. Όλες οι εργασίες των ζώων έγινε σύμφωνα με τις σχετικές ιταλική κατευθυντήριες γραμμές και εγκρίθηκε από την εσωτερική επιτροπή για τη μελέτη των ζώων (CESA) του Ινστιτούτου Γενετικής Έρευνας «Gaetano Salvatore στις 7 Απριλίου

ου 2008 (CESA 10-08).

ασθενείς

Αρχειακό υλικό από 107 ασθενείς με διάγνωση του NSCLC [3] λήφθηκε από INT Fondazione Pascale (Νάπολη, Ιταλία). Η μέση ηλικία ήταν 64 ετών (εύρος 28-82). Μεταξύ των ασθενών με διαθέσιμα κλινικά δεδομένα, οι γυναίκες ήταν 18 και τα αρσενικά 83. Στάδιο ήταν γνωστή για 81 ασθενείς: 67 ασθενείς είχαν νόσο σταδίου Ι-ΙΙ και 14 είχαν σταδίου III-IV της νόσου. Βαθμολογία ήταν γνωστή για 83 ασθενείς: 35 περιπτώσεις ήταν G1-G2 και 48 ήταν G3-G4. Βλέπε Πίνακα S1, S2 και Πίνακας Πίνακας S3 για πιο λεπτομερή κλινικά χαρακτηριστικά των ασθενών.

TMA πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν, θερμάνθηκαν σε μια χύτρα ταχύτητας με 1 mM EDTA, ρΗ 8,0 για 10 λεπτά, και επωάστηκαν με πεψίνη σε 37 ° C για 30 λεπτά. Τα πλακίδια στη συνέχεια αφυδατώθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης, και στη συνέχεια ξηραίνεται στον αέρα. Οι ανιχνευτές μετουσιώθηκαν στους 96 ° C για 5 λεπτά, και διάλυμα υβριδοποίησης εφαρμόστηκε σε κάθε διαφάνεια και επωάστηκαν στους 75 ° C για 1 λεπτό. Μετά από ολονύκτια επώαση στους 37 ° C σε υγρό θάλαμο, τα πλακίδια πλύθηκαν με 0,4 χ SSC και 0,3% ΝΡ40 για 2 λεπτά στους 75 ° C, ξηραίνεται στον αέρα και στο σκοτάδι, αντίθετα με ϋΑΡΙ, και εφαρμόστηκε μια καλυπτρίδα.

ιστός μικροσυστοιχιών (TMA) και ανοσοϊστοχημεία

TMAs κατασκευάστηκαν σε συνεργασία με τη Μονάδα ανοσοβαφή στο Centro Nacional de Investigaciones Oncologicas (Μαδρίτη, Ισπανία) σύμφωνα με τις καθιερωμένες μεθόδους [23] χρησιμοποιώντας ένα χαρτομάντιλο arrayer ( Beecher Instruments, Gene Τεχνολογίες Micro-Array, Silver Spring, MD). Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης μέθοδο (kit LSAB? ΫΑΚΟ, Glostrup, Denmark) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοχρώση επιλέχθηκαν σύμφωνα με προηγουμένως δημοσιευθείσα εργασία [25] – [29]. Anti-pS473 (# 9277), αντι-ΑΚΤ1 (# 2938), αντι-ΑΚΤ2 (# 4057), αντι-PIK3CA (# 4249), αντι-PTEN (# 9559) ήταν όλα από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA).

Το αντι-Akt1 και Akt2 αντι-έχουν δειχθεί ότι είναι ισομορφή-ειδικών αντισωμάτων σε προηγούμενες εργασίες [25]. Επιπλέον, με τη χρήση κυττάρων NCI-H460 παρενέβαινε για Akt1 ή Akt2, αντίστοιχα, επιβεβαιώσαμε ότι το αντι-Akt1 αντίσωμα αναγνωρίζει μόνο την ισομορφή Akt1 και Akt2 αντι-αντίσωμα αναγνωρίζει μόνο την ισομορφή Akt2 (Σχήμα S1A).

επιλέχθηκε Η ανοσοϊστοχημική βαθμολογία ρΑΚΤ και ΡΤΕΝ χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή την εργασία, με βάση τα ευρέως καθιερωμένων κριτηρίων που υπάρχουν στην βιβλιογραφία [28], [30], [31]: ρΑΚΤ βαθμολογήθηκε ως θετική όταν & gt? 10% καρκινικά κύτταρα ήταν θετικά με ισχυρά ή διάχυτη ανοσοθετικότητα. έκφραση ΡΤΕΝ ταξινομήθηκε ως (+) όταν ανιχνεύθηκε χρώση σε & gt? 50% των κυττάρων, (+/-) όταν ανιχνεύθηκε χρώση σε 25-50% των κυττάρων και (-) όταν ανιχνεύθηκε χρώση σε 0-25% των κυττάρων. Για τη στατιστική ανάλυση της έκφρασης ΡΤΕΝ θεωρήθηκε χάνονται όταν ταξινομήθηκαν δείγματα ως (-).

Επίσης, για τις βαθμολογίες ανοσοχρώση της ΑΚΤ1, ΑΚΤ2 και PIK3CA, επιλέξαμε τα κριτήρια που περιγράφονται στις προηγούμενες εκθέσεις [27], [28], [32]. δείγματα όγκου χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες ανάλογα με το ποσοστό των θετικών κυττάρων: (-) αποτελείται τελείως αρνητικά δείγματα? (+) Περιελάμβανε δείγματα με έως και 10% των θετικών κυττάρων? (++) Περιελάμβανε δείγματα με 11-50% των θετικών κυττάρων? και (+++) περιελάμβανε δείγματα με & gt? 50% των θετικών κυττάρων, αντίστοιχα. Για στατιστικούς λόγους, οι όγκοι κατατάχθηκαν σε μια χαμηλή ομάδα έκφρασης που περιλαμβάνει (-) και (+) και υψηλή ομάδα έκφρασης που περιλαμβάνει (++) και (+++)

Για κάθε ένα ανοσοϊστοχημική γύρο a. αρνητικός έλεγχος έχει συμπεριληφθεί, αντικαθιστώντας το πρωτεύον αντίσωμα με διαλύτη στον ίδιο όγκο του ότι με το πρωτογενές αντίσωμα επαναιωρείται σε αυτό. Όλοι οι έλεγχοι έδωσαν ικανοποιητικά αποτελέσματα. τμήματα Βιτρώ TMA αξιολογήθηκαν από δύο παθολόγους εμπειρογνωμόνων (RF, GB) με τη χρήση ενιαίων κριτηρίων. Οι διαφωνίες επιλύθηκαν μέσω της ταυτόχρονης επιθεώρησης και συζήτηση των αποτελεσμάτων. Αποκλίσεις μεταξύ των δύο πυρήνων από την ίδια περίπτωση επιλύθηκαν μέσω ενός κοινού ανάλυση των δύο πυρήνων.

φθορίζουσας in situ υβριδοποίησης (FISH)

ανάλυση FISH έγινε σε TMAs. BAC κλώνοι έχουν σχεδιαστεί σύμφωνα με τη βάση δεδομένων Ensembl (www.ensembl.org). BAC κλώνων που καλύπτουν το γονίδιο ΑΚΤ1 ήταν RP11-982M15, RP11-477I4 και RP11-556J09. Ελέγχου BAC ανιχνευτών που καλύπτει την περιοχή του χρωμοσώματος 14q11 ήταν RP11-324B11. BAC κλώνων που καλύπτουν το γονίδιο ΑΚΤ2 ήταν RP11-36B02, RP11-688J23, RP11-725P04. Ελέγχου BAC ανιχνευτών που καλύπτει την περιοχή του χρωμοσώματος 19p13.1 ήταν RP11-737I1, RP11-520G3. BAC κλώνων που καλύπτουν το γονίδιο PIK3CA ήταν RP11-360P21 και RP11-245C23. Ελέγχου BAC ανιχνευτών που καλύπτει την περιοχή του χρωμοσώματος 3p14.1 ήταν RP11-175F9 και RP11-15B21. Όλοι οι κλώνοι BAC σημάνθηκαν με dUTP-Sprectrum Πορτοκαλί (Vysis Inc., DownersGrove, IL? USA). Όλες οι ανιχνευτές ελέγχου επισημάνθηκαν με dUTP-Sprectrum Πράσινο (Vysis Inc., DownersGrove, IL? USA).

Δύο διαφορετικοί ερευνητές που δεν είχαν καμία προηγούμενη γνώση των γενετικών, κλινικές και IHC αποτελέσματα αξιολογούνται ανάλυση FISH. Όλα τα ψάρια βαθμολογήθηκαν κατά μέσο όρο σε 130 (60 – 210) πυρήνες.

Για την αξιολόγηση των αριθμό αντιγράφων των γονιδίων που κωδικοποιούν ΑΚΤ1, ΑΚΤ2 και PIK3CA, μια αναλογία γονίδιο-προς-τον έλεγχο των 1.0 ταξινομήθηκε ως δισωμία ? αναλογίες μεταξύ 1,0 και 2,0 θεωρήθηκαν γονίδιο κέρδη χαμηλού επιπέδου? αναλογίες & gt? 2.0 κρίθηκαν ως υψηλού πολυσωμία ή /και ενίσχυση γονιδίου [33], [34]

Κατά συνέπεια, οι όγκοι χωρίζονται σε διαφορετικές κατηγορίες: δισωμία, τρισωμία (3 αντίγραφα των χρωμοσωμάτων σε & gt? 40%. των κυττάρων), χαμηλής πολυσωμία (≥3 αντίγραφα των χρωμοσωμάτων στα & gt? 40% των κυττάρων), η υψηλή πολυσωμία (≥4 αντίγραφα των χρωμοσωμάτων σε ≥40% των κυττάρων), και γονιδιακή ενίσχυση (παρουσία συστάδων γονιδίων με αναλογία γονιδίου -να-χρωμόσωμα ≥2 ανά κύτταρο σε ≥40% των κυττάρων ή παρουσία μικρών ή nonenumerable συστάδες του σήματος γονιδίου). Αυτό επέτρεψε την ταξινόμηση των ασθενών σε δύο ομάδες: FISH-αρνητικό (δισωμία και κέρδη) και FISH-θετική (υψηλή πολυσωμία και /ή ενίσχυση του γονιδίου)

PCR, RT-PCR και

ανάλυση μετάλλαξης

Ολικό RNA και γονιδιωματικό ϋΝΑ παρασκευάσθηκαν όπως περιγράφεται [35], [36]. Q-RT-PCR και Q-PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της δύναμης SYBR Green PCR Master Mix σε ΑΒΙ Prism 7300 θερμοκυκλοποιητή (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). cDNA που συντέθηκαν από 1 μg ολικού RNA χρησιμοποιώντας QuantiTect Αντίστροφη Trascription (Qiagen, Ολλανδία, Venlo). Κανονικοποίηση διεξήχθη στο περιεχόμενο GAPDH mRNA. Οι σχετικές ποσότητες του mRNA ή DNA υπολογίσθηκαν με τη μέθοδο συγκριτικής κατώφλι κύκλου (CT) με Livak και Schmittgen [37]. ανάλυση μετάλλαξης για PIK3CA χρησιμοποιώντας LightCycler εκτελέστηκε με DNA κύριας /ανιχνευτές υβριδοποίησης κιτ (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany). Απευθείας αλληλούχιση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ BigDye κύκλος v3.03 αλληλουχίας (Applied Biosystems) σε ένα τριχοειδές αυτόματο sequencer (ΑΒΙ PRISM 3100 Genetic Analyzer? Applied Biosystems). Τα πρωτόκολλα και εκκινητές για την Q-PCR, Q-RT-PCR και αλληλούχιση KRAS (εξόνια 2 και 3) και PIK3CA (εξόνια 9 και 20) που αναφέρθηκαν στο προσάρτημα S1.

Αντισώματα και Western Blot

ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε με πρότυπες μεθόδους [38]. εκχυλίσματα ολικού κυττάρου παρασκευάσθηκαν με ομογενοποίηση κυττάρων σε ΝΡ-40 ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (10 mM Tris-HCl (ρΗ 7.5), 150 mM NaCl, ΝΡ-40 1%) που περιέχει αναστολείς πρωτεάσης. Τα προϊόντα λύσης διαυγάστηκαν με φυγοκέντρηση και οι πρωτεΐνες διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν από την Cell Signaling Technology: αντι-ΑΚΤ1 (# 2938)? αντι-S473 (# 9277), αντι-PIK3CA (# 4249).

Οι κυτταρικές σειρές

NCI-Η460 αγοράστηκε από την ATCC-LGC Promochem (South West London, Ηνωμένο Βασίλειο) και διατηρήθηκε σε RPMI1640 (Gibco-Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό και 100 U /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). κύτταρα BEAS-2Β αγοράστηκαν από Cambrex (Μιλάνο, Ιταλία) και αναπτύχθηκαν όπως προτείνεται από τον κατασκευαστή [39].

παραγωγή ιού και μόλυνση

Για να δημιουργήσετε ρ110α κωδικοποιεί φακοϊό, το cDNA που κωδικοποιεί την ανθρώπινη ρ110α (Addgene, Cambridge, MA, USA) κλωνοποιήθηκε στον φορέα pENTR1A (Invitrogen) και ανασυνδυάζονται σε pLenti6.2 /C-Lumio ™ /V5-DEST Vector κάνοντας χρήση της τεχνολογίας πύλη (Invitrogen). διάνυσμα Plenti χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία λεντοϊού σωματίδια σε κύτταρα συσκευασίας ΗΕΚ293Τ όπως περιγράφεται [40]. κύτταρα που μετατρέπονται BEAS-2Β υποβλήθηκαν σε τρεις γύρους μόλυνσης και επιλέχθηκαν σε μέσο που περιείχε 5 μg /ml βλαστισιδίνη (Invitrogen). Η Ανθρώπινη PIK3CA (NM_006218), ΑΚΤ1 (NM_005163) και ΑΚΤ2 (NM_001626) ΑΠΟΣΤΟΛΗ shRNA σετ (Sigma-Aldrich, St.Luis, ΜΟ) και οι ιοί μεταγωγής ελέγχου Αποστολής-μη στόχους (SHC002V) χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία λεντοϊού σωματιδίων σε ΗΕΚ293Τ κύτταρα συσκευασίας [40]. Μετά την επιμόλυνση, τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν σε διαστήματα 8 ωρών, διηθήθηκε και χρησιμοποιήθηκε για τρεις γύρους μεταγωγή των κυττάρων ΝΟΙ-Η460 υπό την παρουσία 8 μg /ml πολυβρενίου (Sigma).

Δοκιμασία Ιη Vitro Πολλαπλασιασμού

Cells πολλαπλασιασμός αναλύθηκε με ΜΤΤ [3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου? Sigma] μείωσης. Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων με επίπεδο πυθμένα (εναιωρήματα κυττάρων 200 μΐ, 2 χ 10

3 /φρεάτιο για NCI-H460) και επωάστηκαν με υπόστρωμα ΜΤΤ (5 mg /ml) για 4 ώρες. Κάθε 24 ώρες, το μέσο καλλιέργειας απομακρύνθηκε και προστέθηκε άνυδρο 2-προπανόλη. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 570 nm.

ογκογόνο δοκιμασίες

Κύτταρα (1 χ 10

6) αιωρήθηκαν σε 100 ml 10% FBS και 100 ml Matrigel (BD Biosciences, NJ , USA) και υποδορίως εγχέεται στο δεξί πλευρό 6-εβδομάδων αθυμικά γυμνά ποντίκια (Charles River, West Germany) εις τριπλούν. Κάθε 7 ημέρες το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με ένα παχύμετρο.

RNA προφίλ ανάλυση

Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε με Nanodrop (NanoDrop, Wilmington, Delaware, ΗΠΑ) φασματοφωτόμετρο και την ποιότητα της αξιολογήθηκε με ένα Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Μιλάνο, Ιταλία). Για κάθε δείγμα, 500 ng ολικού RNA συντέθηκαν σε βιοτινυλιωμένη cRNA με τη χρήση της Illumina RNA Amplification Kit (Ambion, Inc., Austin, ΤΧ). Η σύνθεση διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. συγκέντρωση cRNA και η ποιότητα αξιολογήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω. Από κάθε δείγμα, τεχνικά αντίγραφα παρήχθησαν και 750 ng cRNA υβριδοποιήθηκαν επί 18 ώρες για τον άνθρωπο ΗΤ-12_V3_0_R1 BeadChips έκφρασης (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο που παρέχεται από τον κατασκευαστή. Υβριδοποιημένοι τσιπ πλύθηκαν και χρωματίστηκαν με συζευγμένα με στρεπταβιδίνη Cy3 (GE Healthcare Milano, Italy). BeadChips στέγνωσαν και σαρώνονται με Illumina BeadArray Reader (Illumina Inc.)

μικροσυστοιχίες ανάλυση δεδομένων:. RNA προφίλ, ο χαρακτηρισμός των γονιδίων », εμπλουτισμένη μονοπάτια και βιβλιογραφικές δίκτυα ανακάλυψη

Τα αρχεία Έκφραση ομαλοποιούνται και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας GeneSpring 10.1 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Διαφορικά εκφραζόμενο (βαθμούς με) γονιδίων μεταξύ BEAS-2Β και τα κύτταρα BEAS-ΡΙ3Κ-CA επιλέχθηκαν βάσει της πτυχής αλλαγή (ο λόγος μεταξύ των επιπέδων έκφρασης στα δύο συνθήκες) και τη στατιστική σημαντικότητα. Εμείς φιλτράρεται τους καταλόγους χρησιμοποιώντας φορές αλλάζουν 1,5 και T-test (

σ

-τιμή (0.01) ως κατώτατο όριο. Ο κατάλογος βαθμούς με (που αποτελείται από 2126 probesets) χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της λειτουργικής συμπεριφοράς από πλευράς των βιολογικών διεργασιών και . μοριακής Λειτουργία, Λειτουργία Ανάπτυξης και Ασθένεια και Διαταραχή όρους ο βαθμός εμπλουτισμού ήταν στατιστικά αξιολογούνται ώστε να προσδιοριστεί κατά πόσον μια παρατηρούμενη επίπεδο των σχολιασμών για μια ομάδα γονιδίων είναι σημαντική ειδικότερα, για κάθε όρο, ένας

q

. – αξία υπολογίστηκε με τη δοκιμή Υπεργεωμετρική (

σ

≤0.05) και διορθώθηκε με τη χρήση False Discovery Rate (FDR) [41]. Οι όροι με ένα

q

-τιμή που υπερβαίνει το όριο σημαντικότητας ήταν τότε επιλεγεί ως αντιπροσωπευτικό. Pathway και το δίκτυο ανάλυσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Ingenuity ανάλυση Pathway (IPA, Ingenuity Systems).

το σύνολο των δεδομένων ήταν εξορύσσεται για σημαντικές οδούς με τη βιβλιοθήκη IPA κανονικών οδών και δίκτυα που δημιουργούνται από τη χρήση του ΜΠΒ ως γραφική αναπαράσταση των μοριακών σχέσεων μεταξύ των γονιδίων και γονιδιακών προϊόντων. Η σημασία της σύνδεσης μεταξύ της λίστας του βαθμούς με και την Canonical Pathway μετρήθηκε χρησιμοποιώντας την ακριβή δοκιμασία κατά Fisher για να υπολογίσει μια

σ

-τιμή (

σ

≤0.05). ακριβή αποτελέσματα της δοκιμής του Fisher διορθώθηκαν επίσης για πολλαπλές δοκιμές χρησιμοποιώντας FDR.

Σε δίκτυα, τα γονίδια ή προϊόντα γονιδίων εκπροσωπούνται ως κόμβοι, και η βιολογική σχέση μεταξύ δύο κόμβων παρουσιάζεται ως μια άκρη (γραμμή). Όλες οι ακμές που υποστηρίζεται από τουλάχιστον ένα αναφοράς από τη βιβλιογραφία, από ένα βιβλίο ή από κανονική πληροφορίες που είναι αποθηκευμένες στο IPA Γνωσιακής Βάσης. Τα ανθρώπου, ποντικού, και αρουραίου ορθόλογα ενός γονιδίου που αποθηκεύονται ως ξεχωριστά αντικείμενα, αλλά εκπροσωπούνται ως ένα ενιαίο κόμβο του δικτύου. αλγόριθμο του κτιρίου του δικτύου καθορίζει μια στατιστική βαθμολογία για κάθε δίκτυο. Αυτό γίνεται με την σύγκριση του αριθμού των γονιδίων εστίασης που συμβάλλουν σε ένα δεδομένο δίκτυο σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των περιστατικών αυτών των γονιδίων σε όλα τα δίκτυα ή πορείες που αποθηκεύονται στο ΙΡΑ Knowledge Base. Η ένταση των γονιδίων (κόμβος) χρώμα στα δίκτυα υποδεικνύει το βαθμό της προς τα κάτω ρύθμιση (πράσινο) ή ανοδική ρύθμιση (κόκκινο) της γονιδιακής έκφρασης. Οι κόμβοι εμφανίζονται με διάφορα σχήματα που αντιπροσωπεύουν την λειτουργική κατηγορία των γονιδιακών προϊόντων.

Αποτελέσματα

ενεργοποίηση ΑΚΤ στην NSCLCs

Ως ανάγνωση από PI3K σηματοδότησης /AKT σε NSCLC καθορίσαμε την κατάσταση φωσφορυλίωσης του υπολείμματος S473 της ΑΚΤ1 (ρΑΚΤ). ρΑΚΤ αξιολογήθηκε σε TMAs περιέχουν διπλές πυρήνα βιοψίες 107 NSCLCs. Ως μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν 45 συμφωνημένα φυσιολογικά δείγματα. Οι κλινικο-παθολογική χαρακτηριστικά των ασθενών που περιγράφονται στο Υλικά και Μέθοδοι και συνοψίζονται στους Πίνακες S1, S2 και S3. Τα αποτελέσματα που ελήφθησαν από ρΑΚΤ χρώση σε NSCLC συνοψίζονται στον Πίνακα 1. χρώση ρΑΚΤ ήταν μόλις ανιχνεύσιμη στα επιθηλιακά κύτταρα από τα φυσιολογικά κυψελιδικό επιθήλιο και από ανώτερους αεραγωγούς (39 από τα 45 δείγματα) (Βλέπε Σχήμα S1). Σε αντίθεση, η ενεργοποίηση ΑΚΤ παρατηρήθηκε σε 60 από 97 από NSCLC αναλύθηκαν (Πίνακας 1). Θετική χρώση ρΑΚΤ ήταν σημαντικά υψηλότερη στα δείγματα καρκινώματος ό, τι είτε φυσιολογικό κυψελιδικό ή βρογχικό επιθήλιο (Ρ & lt? 0,001? Chi square test). χρώση ρΑΚΤ παρατηρήθηκε σε 23/37 κλώνοι ενός κυττάρου και 30/44 ADCs (Σχήμα 1Α και Β, αντίστοιχα). Βρήκαμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ της χρώσης ρΑΚΤ και το βαθμό ή το στάδιο της νόσου (Πίνακας 2): χρώση ρΑΚΤ ήταν σημαντικά πιο εκπροσωπείται σε ασθενείς με βαθμούς G3-G4 σε σύγκριση με τους ασθενείς με βαθμούς G1-G2 (ρ & lt? 0,05) και σε ασθενείς με σταδίου III TNM σε σύγκριση με τους ασθενείς με νόσο του σταδίου II (ρ & lt? 0,05). Βλέπε Πίνακες S4 και S5 για την κατανομή των ασθενών σε ΤΣΡ και ΕΕΠ. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, σε συμφωνία με την εργασία σε άλλους πληθυσμούς, στα ιταλικά NSCLC ενεργοποίηση ασθενείς ΑΚΤ εμφανίζεται στον ιστό του όγκου και συσχετίζεται με ένα πιο προχωρημένο στάδιο της νόσου [20] – [22]. Βλέπε επίσης Πίνακα S9 και S10 για μια λεπτομερή, ασθενή-by-ασθενή, τον κατάλογο των ρΑΚΤ θετικότητας

Α, αριστερά:. SCC αρνητικό για φωσφορυλίωση ρΑΚΤ? δεξιά: SCC θετικό για φωσφορυλίωση pS473. Β, αριστερά: ADC αρνητικό για φωσφορυλίωση ρΑΚΤ? δεξιά: ADC θετικό για φωσφορυλίωση pS473. Μεγέθυνση 10 × 40 ×, αντίστοιχα

Η

Η

Μηχανισμοί ενεργοποίησης ΑΚΤ στην NSCLCs:. Ανοσοϊστοχημεία

Για την διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών που οδηγούν στην ενεργοποίηση ΑΚΤ στα ιταλικά ασθενείς επηρεάζεται από NSCLC πραγματοποιήσαμε μια ολοκληρωμένη ανάλυση της έκφρασης ή /και τη γενετική κατάσταση των ΑΚΤ1 και ΑΚΤ2 και πιο κοντά οι ρυθμιστικές αρχές τους (KRAS, PIK3CA και PTEN). Από τις 107 περιπτώσεις που υπάρχουν στο TMAs 96 θα μπορούσαν να αναλυθούν κατάλληλα για ΑΚΤ1, 83 για ΑΚΤ2, 104 για PTEN και 92 για PIK3CA.

Δείτε Υλικά και Μέθοδοι για τα κριτήρια αξιολόγησης που χρησιμοποιούνται για ΑΚΤ1. Εν συντομία, τα δείγματα που ορίζεται (-) ήταν πλήρως αρνητικοί για ΑΚΤ1? δείγματα ορίζονται (+) περιείχε έως και 10% των θετικών κυττάρων? Δείγματα καθορισμένοι (++) αποτελείται 11-50% των θετικών κυττάρων? Δείγματα ορίζεται (+++) περιελάμβανε & gt? 50% των θετικών κυττάρων, αντίστοιχα. Εικόνα S2 δείχνει αντιπροσωπευτικές χρώσεις του (+), (++) ή (+++) έκφραση ΑΚΤ1 σε ΤΣΡ και ΕΕΠ. Οι όγκοι είχαν ταξινομηθεί σε μία ομάδα χαμηλού έκφρασης που περιλαμβάνει (-) και (+) και μια ομάδα υψηλής έκφρασης που περιλαμβάνει (++) και (+++). Ανάλυση TMAs 258.1 και 258.2 έδειξε ότι ΑΚΤ1 υπερεκφράστηκε σε 17/96 περιπτώσεις NSCLC (~ 19%) (Σχήμα 2), με κλώνοι ενός κυττάρου και ADCs δείχνει παρόμοια αποτελέσματα: 7/37 ΑΚΤ1 θετικός όγκοι ήταν κλώνοι ενός κυττάρου (19%) και 7/44 ΑΚΤ1 θετική όγκοι ήταν ΚΔΚ (16%). Βλέπε Σχήμα 2Α και Β, αντίστοιχα. . Εννέα από τους 15 (60%) NSCLCs υπερεκφράζουν ΑΚΤ1 έδειξαν ενεργοποίηση ΑΚΤ (Πίνακας 3)

Α, αριστερά: SCC αρνητικά για έκφραση ΑΚΤ1? δεξιά: SCC θετικά για την έκφραση ΑΚΤ1. Β, αριστερά: ADC αρνητικά για έκφραση ΑΚΤ1? δεξιά: ADC θετικά για την έκφραση ΑΚΤ1. Μεγέθυνση 10 × 40 ×, αντίστοιχα. Γ Dual-χρώμα φθορισμού in situ υβριδισμού ανάλυση του αριθμού αντιγράφων του γονιδίου ΑΚΤ1. FISH ανάλυση των ΑΚΤ1 (κόκκινα σήματα) και κεντρομέρους του χρωμοσώματος 14 (πράσινα σήματα). Αριστερά, NSCLC δείγματος με διπλοειδή κύτταρα? δεξιά, NSCLC δείγμα με πολλαπλές συγκεντρωμένα σημεία του κόκκινου σήματα της ΑΚΤ1 με 2 σήματα κεντρομεριδίου (ενίσχυση του γονιδίου). Αρχική μεγέθυνση 100 ×.

Η

Στη συνέχεια, ανέλυσε την έκφραση της ΑΚΤ2 σε NSCLCs. Βλέπε Υλικά και Μέθοδοι για την αξιολόγηση της χρώσης ΑΚΤ2. Δείγματα ορίζεται (-) ήταν πλήρως αρνητικοί για ΑΚΤ2? δείγματα ορίζονται (+) ήταν με έως και 10% των θετικών κυττάρων? Δείγματα καθορισμένοι (++) αποτελείται 11-50% των θετικών κυττάρων? και τα δείγματα που ορίζεται (+++) περιελάμβανε & gt? 50% των θετικών κυττάρων, αντίστοιχα. Σχήμα S3 παρουσιάζει αντιπροσωπευτικές χρώσεις του (+), (++) ή (+++) έκφραση ΑΚΤ2 σε ΤΣΡ και ΕΕΠ. Οι όγκοι είχαν ταξινομηθεί σε μία ομάδα χαμηλού έκφρασης που περιλαμβάνει (-) και (+) και μια ομάδα υψηλής έκφρασης που περιλαμβάνει (++) και (+++). ΑΚΤ2 υπερεκφράστηκε σε 18/83 NSCLCs (~ 22%) (Σχήμα 3). Σε διαφορά με ΑΚΤ1, ΑΚΤ2 υπερέκφραση παρατηρήθηκε πιο συχνά στην ΤΣΡ (10/31 ΕΕΑΚ 32%? 4/33 ΚΔΚ, 12%). Βλέπε Σχήμα 3Α και Β, αντίστοιχα. Επιπλέον, οι περισσότερες ΑΚΤ2 θετικών όγκων (12/17, 71%) έδειξαν την ενεργοποίηση ΑΚΤ (Πίνακας 3)

Α, αριστερά:. SCC αρνητικά για έκφραση ΑΚΤ2? δεξιά: SCC θετικά για την έκφραση ΑΚΤ2. Β, αριστερά: ADC αρνητικά για έκφραση ΑΚΤ2? δεξιά: ADC θετικά για την έκφραση ΑΚΤ2. Μεγέθυνση 10 × 40 ×, αντίστοιχα. Γ Dual-χρώμα φθορισμού in situ υβριδισμού ανάλυση του αριθμού αντιγράφων του γονιδίου ΑΚΤ2. FISH ανάλυση των ΑΚΤ2 (κόκκινα σήματα) και την περιοχή του χρωμοσώματος 19p13.1 (πράσινα σήματα). Αριστερά, NSCLC δείγματος με διπλοειδή κύτταρα? δεξιά, NSCLC δείγμα με πολλαπλές συγκεντρωμένα σημεία του κόκκινου σήματα της ΑΚΤ2 με σήματα περιοχή 19p13.1 2 χρωμόσωμα (ενίσχυση του γονιδίου). Αρχική μεγέθυνση 100 ×

Η

Οι ασθενείς που συγκεντρώθηκαν για τη μελέτη αυτή είχε ήδη χαρακτηριστεί για έκφραση ΡΤΕΝ [38]:. Πλήρη απώλεια συνέβη σε 41 από 104 (39%) NSCLCs και μερική κάτω ρύθμιση παρατηρήθηκε σε 41 πρόσθετες περιπτώσεις. απώλεια PTEN παρατηρήθηκε συχνότερα σε κλώνοι ενός κυττάρου (22/40, 55%) από ό, τι στο ΚΔΚ (14/51, 27%) (βλέπε Εικόνα S5). Ωστόσο, όταν συσχετίζεται με την ενεργοποίηση ΑΚΤ, η απώλεια ή η μείωση των επιπέδων της ΡΤΕΝ πρωτεΐνης που δεν συνδέονται με την ενεργοποίηση ΑΚΤ (n = 95? P = 0.832). (Πίνακας 3)

Τέλος, αναλύσαμε το έκφραση της καταλυτικής υπομονάδας της ΡΙ3Κ, ρ110α. Τα κριτήρια αξιολόγησης αναφέρονται στο Υλικά και Μέθοδοι. Δείγματα ορίζεται (-) ήταν πλήρως αρνητικοί για ρ110α? δείγματα ορίζονται (+) περιείχε έως και 10% των θετικών κυττάρων ρ110α? δείγματα καθορισμένοι (++) αποτελείται 11-50% των ρ110α θετικών κυττάρων? και τα δείγματα που ορίζεται (+++) περιελάμβανε & gt? 50% της ρ110α θετικά κύτταρα. Σχήμα S4 δείχνει αντιπροσωπευτικές χρώσεις του (+), (++) ή (+++) έκφραση ΑΚΤ1 σε ΤΣΡ και ΕΕΠ. Οι όγκοι είχαν ταξινομηθεί σε μία ομάδα χαμηλού έκφρασης που περιλαμβάνει (-) και (+) και μια ομάδα υψηλής έκφρασης που περιλαμβάνει (++) και (+++). Παρατηρήσαμε ρ110α υπερέκφραση σε -29% του NSCLCs (27/92): 12 από τα 34 ήσαν κλώνοι ενός κυττάρου (35%) και 12 από 43 ήταν ADCs (28%) (Σχήμα 4Α και 4Β). Σε διαφορά με άλλα γονίδια μέσα στο μονοπάτι που έχουν αναλυθεί, βρήκαμε ότι NSCLCs με υπερεκφράζεται ρ110α παρουσιάζονται σημαντικά ενεργοποιείται ΑΚΤ (18 από 26? Ρ = 0,02) (Πίνακας 3)

Α, αριστερά:. SCC αρνητικά για έκφραση PIK3CA? δεξιά: SCC θετικά για την έκφραση PIK3CA. Β, αριστερά: ADC αρνητικά για έκφραση PIK3CA? δεξιά: ADC θετικά για την έκφραση PI3KCA. Μεγέθυνση 10 × 40 ×, αντίστοιχα. Γ Dual-χρώμα φθορισμού in situ υβριδισμού ανάλυση των PIK3CA αριθμού αντιγράφων του γονιδίου. FISH ανάλυση των PIK3CA (κόκκινα σήματα) και την περιοχή του χρωμοσώματος 3p14.1 (πράσινα σήματα). Αριστερά, NSCLC δείγματος με διπλοειδή κύτταρα? δεξιά, NSCLC δείγμα με πολλαπλές συγκεντρωμένα σημεία του κόκκινου σήματα της PIK3CA με 2 χρωμόσωμα περιοχή 3p14.1 σήματα (ενίσχυση του γονιδίου). Αρχική μεγέθυνση 100 ×.

Η

Αξίζει να σημειωθεί ότι, από την ολοκληρωμένη ανάλυση της TMAs βρήκαμε ότι η ενεργοποίηση ΑΚΤ παρατηρήθηκε συχνότερα σε όγκους που δείχνουν ανώμαλη έκφραση περισσότερων από ένα μόνο γονίδιο εντός του μονοπατιού PI3K (απώλεια PTEN ή υπερέκφραση ΑΚΤ1, ΑΚΤ2, ρ110α αντίστοιχα). Στην πραγματικότητα, η ενεργοποίηση ΑΚΤ ανιχνεύθηκε σε 15-64% των όγκων που δείχνει εκτροπή σε ένα μόνο γονίδιο, 44-89% των όγκων με παρεκκλίνουσα έκφραση δύο γονιδίων, 67-100% των όγκων με την έκτοπον έκφρασιν τριών γονιδίων και 100% της όγκους με παρεκκλίνουσα έκφραση και των τεσσάρων γονιδίων. Αντίθετα, παρεκκλίνουσα έκφραση των μελών του μονοπατιού PI3K ήταν λιγότερο συχνή σε όγκους που δεν δείχνει ενεργοποίηση της σηματοδότησης ΑΚΤ (βλέπε Πίνακα 4)

Η

Μηχανισμοί της πρωτεΐνης υπερέκφραση:. Ανάλυση FISH

FISH ανάλυση σε NSCLCs εκτελέστηκε για ΑΚΤ1, ΑΚΤ2 και PIK3CA για τον προσδιορισμό των μοριακών μηχανισμών της υπερέκφρασης των αντίστοιχων πρωτεϊνών. Δείτε Υλικά και Μέθοδοι για την ταξινόμηση των όγκων με FISH. Βρήκαμε 20/82 NSCLC (24%) με αριθμό αντιγράφων κέρδος του γονιδίου ΑΚΤ1 στο χρωμόσωμα 14, εκ των οποίων 16 ήταν υψηλές πολυσωμία (& gt? 4 αντίγραφα) και 4 εστιακή ενίσχυση (SCC-11, SCC-12, SCC-14 και SCC-21) (Σχήμα 2C). Όπως ήταν αναμενόμενο, αρκετές ΑΚΤ1 FISH-θετική NSCLCs (12 από 20 περιπτώσεις, 60%) εμφάνισαν μέτρια ή υψηλή έκφραση ΑΚΤ1. Βλέπε πίνακες S9 και S10 για μια λεπτομερή λίστα των γενετικών αλλαγών ανιχνεύονται σε ασθενείς με ενιαίο SCC και ADC. Στην περίπτωση της ΑΚΤ2, παρατηρήσαμε 24/73 NSCLCs (31%) με αριθμό αντιγράφων κέρδος του γονιδίου στο χρωμόσωμα 19, εκ των οποίων 23 ασθενείς είχαν υψηλά πολυσωμία και 1 ασθενής είχε εστιακό ενίσχυση (SCC-11). Δείτε την Εικόνα 3C για ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα. Ωστόσο, η σημασία της ενίσχυσης ΑΚΤ2 στον καρκίνο του πνεύμονα παραμένει ασαφής, δεδομένου 13/24 (54%) περιπτώσεις ΑΚΤ2 FISH-θετικούς όγκους δεν παρουσίασαν αυξημένη έκφραση της αντίστοιχης πρωτεΐνης.

ανάλυση FISH με το χρωμόσωμα 3q26. 32 ανιχνευτές αποκάλυψε την παρουσία μιας αύξησης του αριθμού αντιγράφων γονιδίου PIK3CA σε 19 περιπτώσεις (-26%), όλα εκ των οποίων παρουσιάζονται υψηλές πολυσωμία, με 7 περιπτώσεις δείχνουν επίσης εστιακό ενίσχυση (ADC-5, SCC-4, SCC-14, SCC-16, SCC-19, SCC-30, SCC-34) (Εικόνα 4C). Η πλειοψηφία των NSCLCs με αυξημένο αριθμό αντιγράφων του PIK3CA (13 από τις 19 περιπτώσεις, 68%) εμφάνισαν μέτρια ή υψηλή έκφραση ρ110α.

Ωστόσο, δεν είναι όλες οι NSCLCs FISH-θετικά ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση της σηματοδότησης ΑΚΤ. Όπως φαίνεται στους Πίνακες S6, S7 και S8, 11/18, 10/19 και 14/23 περιπτώσεις που ήταν FISH-θετικά για PIK3CA, ΑΚΤ1 και ΑΚΤ2 προέκυψαν θετικά για ρΑΚΤ, αντίστοιχα.

μηχανισμούς ενεργοποίησης ΑΚΤ : ανάλυση μετάλλαξη PIK3CA και KRAS

Οι ασθενείς δεδουλευμένων για αυτή τη μελέτη είχαν ήδη αναλυθεί για μεταλλάξεις ΑΚΤ1 [24]. Ασθενής SCC-29 παρουσίασε σωματική μετάλλαξη στο γονίδιο που κωδικοποιεί ΑΚΤ1 αποτέλεσμα ένα γλουταμινικό οξύ σε υποκατάσταση λυσίνης στο αμινοξύ 17 (E17K) [24]. Ο όγκος από αυτόν τον ασθενή έδειξαν αυξημένη έκφραση ΑΚΤ και τη δραστηριότητα. Ομοίως, νοηματικές μεταλλάξεις σε PIK3CA έχουν σπάνια αναφερθεί [42] – [45]. Βρήκαμε μία υποκατάσταση GAG1633 → AAG που οδηγεί στην αλλαγή E545K αμινοξύ σε μία SCC (SCC-6) (Σχήμα 5Α και Β). Αντίθετα, 7 NSCLCs έδειξε μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS: G12A (GGT → GCT) (n = 1)? G12C (GGT → TGT) (n = 4)? G12V (GGT → Γ.Ο.Σ.) (n = 1)? G13C (GGC TGC →) (n = 1) (Σχήμα 5C). μεταλλάξεις KRAS εντοπίστηκαν κυρίως στην ΚΔΚ (6 από 32? 19%), όπως περιγράφεται [46], [47]. Πέντε από τις 7 περιπτώσεις με μεταλλάξεις στο γονίδιο KRAS παρουσίασαν σημαντική ενεργοποίηση ΑΚΤ (Σχήμα 5D).

Α. ανίχνευση μετάλλαξη στα εξόνια 9 και 20 του PIK3CA από NSCLC.