Αφηρημένο

Ο καρκίνος αναγνωρίζεται να είναι μια οικογένεια νόσων γονιδίου που βασίζονται οποίων οι αιτίες πρέπει να αναζητηθούν σε διαταραχές των βασικών βιολογικών διεργασιών. Ένα ολοένα και πιο βαθιά Κατάλογος των κανονικών δικτύων λεπτομέρειες την ειδική μοριακή αλληλεπίδραση των γονιδίων και των προϊόντων τους. Ωστόσο, η χαρτογράφηση των φαινοτύπων της νόσου σε μεταβολές των εν λόγω δικτύων των αλληλεπιδράσεων επιτυγχάνεται έμμεσα και μη συστηματικά. Εδώ έχουμε αντικειμενικά προσδιορίσουν μονοπάτια που σχετίζονται με κακοήθεια, στάσης, και το αποτέλεσμα του καρκίνου μέσω της εφαρμογής μιας αναλυτικής προσέγγισης που αξιολογεί συστηματικά διαφορές στη δραστηριότητα και τη συνέπεια των αλληλεπιδράσεων εντός κανονικών βιολογικών διεργασιών. Χρησιμοποιώντας μεγάλες συλλογές προσιτές στο κοινό γονιδιακής έκφρασης του γονιδιώματος-ευρεία, έχουμε εντοπίσει μικρά, κοινά σύνολα των οδών – TrkA υποδοχέων, η απάντηση απόπτωση σε βλάβες του DNA, Ceramide, τελομεράση, CD40L και της καλσινευρίνης – των οποίων οι διαφορές σθεναρά τη διάκριση διαφορετικών τύπων όγκων από τα αντίστοιχα φυσιολογικά δείγματα, προβλέψει βαθμό του όγκου, και να διακρίνουν φαινοτύπων, όπως η κατάσταση των υποδοχέων οιστρογόνων και την κατάσταση μετάλλαξη p53. Οδούς που εντοπίστηκαν μέσω αυτής της ανάλυσης αποδίδουν εξίσου καλά ή και καλύτερα από φαινοτύπους που χρησιμοποιείται στις αρχικές μελέτες στην πρόβλεψη της έκβασης του καρκίνου. Η προσέγγιση αυτή παρέχει ένα μέσο για να χρησιμοποιούν χαρακτηρισμούς γονιδίωμα-ευρεία στο χάρτη βασικές βιολογικές διεργασίες σε σημαντικά κλινικά χαρακτηριστικά της νόσου

Παράθεση:. Efroni S, Schaefer CF, Buetow KH (2007) Προσδιορισμός των βασικών διαδικασιών υποκείμενου καρκίνου φαινότυποι Χρήση βιολογική Ανάλυση Pathway. PLoS ONE 2 (5): E425. doi: 10.1371 /journal.pone.0000425

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Νίκος Μοναχός, Πανεπιστήμιο του Σέφιλντ, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 5 Ιαν 2007? Αποδεκτές: 29 Μάρτη, 2007? Δημοσιεύθηκε: 9 του Μάη του 2007

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της δήλωσης Creative Commons Public Domain που ορίζει ότι, μόλις τοποθετηθεί στο δημόσιο τομέα, το έργο αυτό μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο σκοπό

Χρηματοδότηση:.. η έρευνα υποστηρίχθηκε από την εντός των τειχών ερευνητικού προγράμματος του Εθνικού Ινστιτούτου Υγείας, Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου

Ανταγωνιστικά συμφέροντα :. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Βιολογικός φαινόμενα προκύπτουν ως συνέπεια της δράσης των γονιδίων και των προϊόντων τους στα μονοπάτια. Ασθένειες προκύπτουν μέσα από αλλοίωση αυτών των πολύπλοκων δικτύων [1] – [5]. Προκειμένου να καταστεί μηχανιστική ισχυρισμούς που συμπληρώνουν τις τρέχουσες προσεγγίσεις για γονιδιώματος-ευρεία ανάλυση [6] – [9], έχουμε χαρτογραφήσει κανονικές βιολογικές οδοί προς φαινοτύπους καρκίνου. Ένα σύνολο του 2011 Affymetrix GeneChip υβριδοποιήσεις σειρά που λαμβάνονται από 9 διαφορετικές προσιτές στο κοινό πηγές δεδομένων [10] – [17] αναλύθηκαν. Οι υβριδοποιήσεις αντιπροσωπεύονται 70 διαφορετικούς τύπους όγκων (1348 δείγματα). Επιπλέον 83 διαφορετικούς τύπους δείγματα φυσιολογικού ιστολογία περιελήφθησαν (663 δείγματα). Τα επίπεδα έκφρασης ρυθμίστηκαν χρησιμοποιώντας RMA [18]. Ο ορισμός της κανονικής χρησιμοποιείται εδώ αποκλείει αμέτοχος ή /και όγκου γειτονικών δειγμάτων που λαμβάνονται από άτομα με καρκίνο.

Η χρήση των οδών ως πλαίσιο για την ανάλυση, δεν είναι από μόνη της μυθιστόρημα. Αυτές περιλαμβάνουν την προβολή των γνωστών γονιδίων του καρκίνου και των δεδομένων γονιδιακής έκφρασης σε οδούς [19], [20]. Αυτό που διακρίνει το έργο που παρουσιάζονται εδώ είναι η συστηματική αξιολόγηση της δομής αλληλεπίδραση μεταξύ των προκαθορισμένων κανονικά δίκτυα. Κατά τη μέτρηση της κατάστασης της αλληλεπίδρασης συνδυάζει πληροφορίες από το κράτος γονίδιο και τη δομή του δικτύου. Πολλαπλές μέλη γονίδιο μπορεί να οδηγήσει σε μια κοινή σκορ οδό. Αντίθετα, τα αποτελέσματα της οδού μπορούν να παρουσιάζουν μεγαλύτερες διαφορές από το γονίδιο υπογραφές.

Προσεγγίσεις στη Διαδρομή Ανάλυση

Αυτή η έρευνα συμπληρώνει άλλες εργασίες που χρησιμοποιούν οδός πληροφορίες.

Πιο συγκεκριμένα, Segal et. al. [6] καθορισμένη βιολογική ενότητες και τους εξευγενισμένα σε ένα σύνολο στατιστικά σημαντική ενοτήτων. Ήταν σε θέση να χρησιμοποιούν αυτές τις ενότητες για να αποκτήσουν μια καλύτερη προοπτική σχετικά με τις διάφορες βιολογικές διαδικασίες που ενεργοποιούνται και απενεργοποιούνται σε διάφορες κλινικές καταστάσεις. Σημειώνουμε δύο κύριες διαφορές ανάμεσα σε αυτό που παρουσιάζουμε εδώ και την εργασία στο Segal et. al. [6]: πρώτον, οι βιολογικές μονάδες που χρησιμοποιούνται στο χαρτί, αν και άκρως κατατοπιστική και χρήσιμη, είναι εσωτερικά ορίζεται εντός του χαρτιού. Ο προσδιορισμός των γονιδίων σε αυτές τις ενότητες προήλθε από τα ίδια δεδομένα στα οποία είναι αργότερα εφαρμόζονται. Τα κανονικά μονοπάτια που χρησιμοποιούμε εξωτερικά ορίζεται ανεξάρτητα από τα δεδομένα που αναλύουμε, αντιπροσωπεύουν την τρέχουσα αντίληψη στον τομέα αυτό, και δεν προέρχονται ad-hoc. Δεύτερον, Segal et. al. δεν κάνουν σαφή χρήση των διασυνδέσεων, ή τη δομή του δικτύου, που υπάρχει μεταξύ των γονιδίων που περιλαμβάνουν βιολογικές μονάδες. Τα αποτελέσματα για τη δραστηριότητα και τη συνέπεια που παρουσιάζουμε εδώ εξαρτάται από την δομή του δικτύου και των ειδικών σχέσεων (όπως αναστολή και προώθησης) που είναι χαρακτηριστικά των πληροφοριών δικτύου.

Μια άλλη σημαντική προσέγγιση είναι αυτή της Ρόδου et. al. [21], στο οποίο χρησιμοποιείται το δίκτυο του ανθρώπου interactome να προσδιορίσει υποδίκτυα ενεργοποιούνται στον καρκίνο. Η προσέγγιση της Ρόδου el. al. χρήση, σε αντίθεση με αυτή που παρουσιάζεται εδώ, δεν επιχειρεί να υπολογιστικά και αλγοριθμικά ανάδειξη των διαφορών σε φαινοτύπους με την κατασκευή ενός ταξινομητή γύρω μετρήσιμα χαρακτηριστικά του δικτύου. Αντ ‘αυτού, δημιουργεί υποδίκτυα από την ένωσή τους με σύνολα των γονιδίων που ταυτοποιούνται μέσω του άνω (ή κάτω) έκφραση σε κάθε βιολογικό φαινότυπο. Rhodes et. al. προσέγγιση κάνει χρήση της δομής του δικτύου για την κατασκευή του υποδίκτυο, αλλά δεν κάνει περαιτέρω χρήση στην παρατήρηση της συν-έκφραση ή συν-αποσιώπηση των συνόλων των γονιδίων, όπως συμβαίνει στο έργο που παρουσιάζεται εδώ.

Bild et. al. [14] και Glinski et. al. [22] αποδεικνύουν ότι οι υπογραφές γονίδιο που καθορίζεται από μικρό σύνολο προεπιλεγμένων κανονικών μονοπατιών μπορεί να διακρίνει τα χαρακτηριστικά του όγκου. Στο έργο τους, αρχίζουν με ένα περιορισμένο σύνολο των οδών, (π.χ. Bild et. Al. Χρησιμοποιούν 5 μονοπάτια) και δείχνουν ότι διαφέρουν σε διαφορετικούς φαινοτύπους. Καθώς αυτή η προσέγγιση ξεκινά με ένα μικρό σύνολο των μονοπατιών οι συγγραφείς επέλεξαν να εξετάσει, δεν έχει την ικανότητα να ανακαλύψουν νέες ενώσεις μονοπάτι με φαινοτύπους. Σε αντίθεση με την τρέχουσα εργασία, δεν απασχολεί την αντικειμενική μέθοδο για την ανίχνευση σύνολο μονοπατιών που μπορεί να διακρίνει φαινοτύπων.

Αναλύσεις σετ Gene Εμπλουτισμός [23] επιτρέπει στους συγγραφείς να επιλέξουν ένα σύνολο γονιδίων και να καθορίσει σχετική στατιστική τους σημασία σε μια λίστα των γονιδίων που διαχωρίζουν φαινοτύπους. σετ Gene εμπλουτισμό ξεκινά με την παραδοχή της ατομικής γονιδίων ως ταξινομητές. Μονοπάτι μέλους μετράται για την αξιολόγηση των συνδυασμένων εισφορών. Και πάλι, η μέθοδος δεν κάνει χρήση της δομής του δικτύου, ούτε παρέχει μια συστηματική υπόψη για τη συνδυασμένη γνώση των οδών να μειωθεί στο βέλτιστο σύνολο ταξινόμηση των διαδικασιών. Δεδομένου ότι η μέθοδος ξεκινά με τη διάκριση των μεμονωμένων γονιδίων, μπορεί να στηριχθεί μόνο σε αυτή τη στατιστική συμπερασματολογία, και δεν ευθύνονται για τυχόν διαφορές που προέρχονται από την αλληλεξάρτηση των πολλαπλών αλληλεπιδράσεων γονιδίων. Για παράδειγμα, εάν το γονίδιο Α φαίνεται να permutate τυχαία σε δύο φαινοτύπους και γονίδιο Β φαίνεται να permutate τυχαία σε δύο φαινοτύπους τότε κάθε ένα από τα γονίδια που θα σκοράρει κακώς σε μια δοκιμή στατιστικής σημαντικότητας. Ωστόσο, η βαθμολογία καθορίζεται από συνδυασμό εξάρτησή τους (π.χ. (εάν Α τότε Β)) θα μπορούσε να παράσχει πολύ μεγαλύτερη διάκριση.

Η μέθοδος με την Tomfohr, et. al. [24] Είναι ίσως το πιο κοντά σε αυτήν που παρουσιάζεται εδώ στο ότι εξετάζει συνδυασμένες ομάδες των γονιδίων και τις κατατάσσει ανάλογα. Ωστόσο, Tomfohr, et. al. δεν χρησιμοποιούν τη γνώση δομή του δικτύου να αποκτήσουν σκορ, αλλά αντ ‘αυτού να εκτελέσει Singular Value Decomposition (SVD) για να επιλέξετε ένα συγκεκριμένο metagene, και να καθορίσει μια δραστηριότητα μονοπάτι ως έκφραση αυτού του γονιδίου. Ως εκ τούτου, το αποτέλεσμα δεν χρησιμοποιούν την αλληλεξάρτηση του δικτύου, όπως κάνει το έργο παρουσιάστηκε παραπάνω

Μέθοδοι

Αξιολογώντας την κατάσταση του γονιδίου:.

Κατάσταση Gene στην αξιολόγηση του δικτύου αλληλεπίδραση υπολογίζεται από τις παρατηρούμενες δεδομένα ως μία από τις δύο εναλλακτικές καταστάσεις: κάτω και πάνω. Για να είναι σε θέση να προσδιορίσει αν ένα γονίδιο που βρίσκεται σε ένα «κάτω» κατάσταση ή «πάνω» κατάσταση, κοιτάζουμε της (RMA προσαρμοστεί [18]) τιμή της έκφρασης σε ένα δείγμα, σε σύγκριση με τις τιμές έκφραση του ίδιου γονιδίου σε όλα άλλα δείγματα. Για να είναι σε θέση να φιλοξενήσει μια πληθώρα κατανομές πιθανοτήτων, χρησιμοποιούμε μια κατανομή γάμμα ως πρότυπο τόσο για τη μορφή «κάτω» της διανομής, καθώς και το «πάνω» της διανομής, και να επαναπροσδιορίσει το πρόβλημα ως ένα μίγμα των δύο κατανομής γάμμα. Η καταστολή μορφή ακολουθεί συχνά μια εκθετική κατανομή, η οποία είναι μία ιδιαίτερη περίπτωση μιας κατανομής γάμμα. Η προωθούνται κατάσταση συχνά ακολουθεί μια μορφή παρόμοια με μια κανονική κατανομή, η οποία μπορεί να προσεγγιστεί από μια κατανομή γάμμα από ένα μεγάλο μέση. Ανά κάθε σετ καθετήρα μετράται με το μικροσυστοιχιών, θα εξετάσουμε την κατανομή της έκφρασης και να προσπαθήσουμε να ταιριάζει αυτό της διανομής σε ένα μίγμα των δύο κατανομών γάμα. Το κάνουμε αυτό με τη χρήση ενός αλγόριθμου (ΕΜ) Προσδοκία Μεγιστοποίηση, την επανάληψη πάνω από τα δεδομένα με τρόπο που εγγυάται την αύξηση της πιθανότητας της προσαρμογής των δεδομένων από τις πρότυπο διανομές. Στην περίπτωση των δύο κατανομές γάμα, πρέπει πρώτα να διαιρεί τα δεδομένα σε δύο ομάδες: τιμές «κάτω» και «επάνω» τιμές. Ο αριθμός των γονιδίων στο «επάνω» ομάδα είναι

N

U

και ο αριθμός των γονιδίων στο κατασταλεί ομάδα είναι

N

D

. Οι εκ των προτέρων πιθανότητες είναι, ως εκ τούτου:

Υποθέτουμε κάθε ομάδα διανέμει σύμφωνα με μια κατανομή γάμμα:

Ο στόχος του αλγορίθμου EM είναι να μας παρέχουν με τις εκτιμήσεις μέγιστης πιθανότητας για το

α

U, β

U

τιμές για την προωθούμενη ομάδα και το

μια

D, b

D τιμές

για την καταστολή της ομάδας. Επιπλέον, υπολογίζει τις εκτιμήσεις μέγιστης πιθανότητας των συντελεστών μίγματος, η

1, η

2.

Υποθέτουμε ότι η κατανομή έκφραση του κάθε γονιδίου είτε προέρχεται από ένα μίγμα δύο κατανομών (μία για το «πάνω» υπόθεση και ένα για το «κάτω» περίπτωση) είτε από ένα ενιαίο διανομής (για παράδειγμα, όταν το γονίδιο είναι «πάνω» σε όλα τα δείγματα που έχουμε). Έχουμε καθορίσει τον αριθμό των υποκείμενων κατανομών (ένα ή δύο) χρησιμοποιώντας τον αλγόριθμο EM σε συνδυασμό με μια μέθοδο επιλογής μοντέλου, δείτε παρακάτω.

Για να βρείτε το μέγιστο της πιθανότητας καταγραφής, θα πρέπει να βρούμε το μέγιστο της βοηθητική λειτουργία

Q

[25]: whereHere,

θ

είναι η συλλογή των παραμέτρων που καθορίζουν τη διανομή, και η εκθέτη 0 ορίζει τα μεγέθη που είχαν καθοριστεί στην προηγούμενη επανάληψη

.

Για να βρείτε maxima, διαφοροποιούμαστε

Q

σε σχέση με τις παραμέτρους του μοντέλου, και σε σύγκριση με zero.And το Ψ coefficientswhere (

x

) είναι η συνάρτηση psi.

χρησιμοποιώντας ένα πολλαπλασιαστή Lagrange για να ενσωματώσει την συγκράτηση έχουμε να μεγιστοποιήσει το στόχο functionwith σχέση με το

η

i

, εμείς deriveand obtainWe λύσουμε αυτό αριθμητικά (χρησιμοποιώντας MATLAB®) σε κάθε επαναληπτική βήμα, μέχρι να φθάσει σε κάποια προκαθορισμένη κριτήριο σύγκλισης

Επιλέγοντας ένα βέλτιστο αριθμό των κατανομών:.

Προφανώς, οι περισσότερες διανομές πάρουμε ως βάση μας για τις συνολικές διανομές, η καλύτερη εφαρμογή που έχουμε για τα δεδομένα και την Όσο καλύτερη είναι η πιθανότητα θα είναι. Εξετάστε, για παράδειγμα, όπως πολλές διανομές, καθώς υπάρχουν σημεία δεδομένων. Αυτό θα ταίριαζε τα δεδομένα ακριβώς και παράγουν τη μέγιστη πιθανότητα. Για να ξεπεραστεί αυτό, και για να είναι σε θέση να επιλέξει το βέλτιστο αριθμό, συγκρίνουμε μοντέλα με διαφορετικό αριθμό διανομές χρησιμοποιώντας το κριτήριο Bayesian Πληροφοριών (BIC) [26], υπολογίζεται συνάρτηση κόστους στιγμή που υπάρχει αυτή αντισταθμίζει την πρόσθετη αύξηση στην πολυπλοκότητα. Το στατιστικό μοντέλο που επιλέγεται είναι το ένα με το μεγαλύτερο BIC

υπολογίζει και παρόμοια:. Αλλά χρειαζόμαστε την πιθανότητα να είναι στην «προωθούνται» κατάσταση για μία συγκεκριμένη τιμή της έκφρασης: Και sincewe μπορούν να αποκτήσουν τις απαραίτητες τιμές από: για παράδειγμα, η έκφραση του γονιδίου CDKN1A στο σύνολο δεδομένων [13] (μια συλλογή από δείγματα 698 όγκων) ακολουθεί αυτό της διανομής (βλέπε Εικόνα 1):

Οι Up /Down κλήσεις για γονιδιακή κράτη βασίζονται σε μια αξία έκφραση που ταξινομούνται ως κατοικούν σε ένα από τα δύο διακριτές κατανομές.

η

Οι δύο διακριτές κατανομές (Κάτω και Πάνω) είναι εμφανής και ο αλγόριθμος δίνει τις παραμέτρους για τις δύο κατανομές γάμα.

δραστηριότητα Pathway και οδός συνέπειας

Pathway βαθμολογίας συνέπειας: Για να προσδιορίσετε το σκορ οδός συνέπειας ενός συγκεκριμένου μονοπατιού σηματοδότησης σε ένα δείγμα, ακολουθούμε τα εξής βήματα:

Κάθε μονοπάτι είναι μια συλλογή των αλληλεπιδράσεων. γονίδια εισόδου και εξόδου γονίδια καθορίζουν κάθε αλληλεπίδραση. Για κάθε αλληλεπίδραση στο μονοπάτι, πρέπει πρώτα εξετάσουμε τα γονίδια εισόδου και να καθορίσει, για κάθε τέτοιο γονίδιο, η πιθανότητα να είναι σε ένα «κάτω» ή «πάνω» κατάσταση (βλέπε «κατάσταση γονίδιο» παραπάνω)

μπορούμε στη συνέχεια να καθορίσει την πιθανότητα της υλοποίησης της ειδικής αλληλεπίδρασης με το κοινό πιθανότητα όλες τις απαραίτητες συνιστώσες (γονίδια)

στη συνέχεια, θα εξετάσουμε τη μοριακή έξοδο της αλληλεπίδρασης. Συνήθως, η έξοδος αυτή είναι μια λίστα των γονιδίων, για την οποία έχουμε καθορίσει την πιθανότητα να είναι σε ένα «κάτω» ή «πάνω» κατάσταση (βλέπε «κατάσταση γονίδιο» παραπάνω)

Στη συνέχεια, υπολογίζουμε την πιθανότητα η γονίδιο (-α) εξόδου είναι σε ένα από τα δύο κράτη, υπό την δεδομένη πιθανότητα αλληλεπίδρασης (που υπολογίζεται (β))

Τέλος, για να αποκτήσετε το σκορ οδός συνέπειας, υπολογίζουμε το σκορ συνέπειας για κάθε αλληλεπίδραση στο μονοπάτι και ο μέσος όρος των βαθμολογιών σε όλες τις αλληλεπιδράσεις για την οποία είχαμε την ευκαιρία να αποκτήσουν μια βαθμολογία. Στο Σχήμα 2 δείχνουμε ένα παράδειγμα για να τον υπολογισμό της αξίας συνοχή μιας αλληλεπίδρασης που λαμβάνονται από το μονοπάτι «Σηματοδότηση γεγονότα που προκαλούνται από τον υποδοχέα παράγοντα βλαστοκυττάρων (c-Kit)», ένα από τα NCI-Φύση Επιμέλεια οδούς από τη βάση δεδομένων Pathway Αλληλεπίδρασης (PID ) [27]. Τα συγκεκριμένα βήματα για τον υπολογισμό της συνέπειας σε αυτό το παράδειγμα είναι:

Δημιουργία πιθανότητες σε όλα τα γονίδια που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση. Αυτό γίνεται σύμφωνα με τα βήματα που περιγράφονται παρακάτω (ενότητα «κατάσταση γονίδιο» δείτε). Οι τιμές παίρνουμε είναι: P (CREBBP) = 0,95? P (STAT5A) = 0.8? P (KIT) = 0,7

Υπολογίστε την κοινή πιθανότητα ενός ενεργού αλληλεπίδρασης. Δεδομένου ότι τα μόρια εισαγωγής στην αλληλεπίδραση δεν είναι συν-εξαρτώμενη, η κοινή πιθανότητα αλληλεπίδρασης είναι P (CREBBP) × P (STAT5A) = 0.95 × 0.8 = 0.76

Να υπολογίσετε την πιθανότητα ότι το μόριο της παραγωγής είναι η αποτέλεσμα της αλληλεπίδρασης. Δεδομένου ότι το μόριο εξαρτάται αποκλειστικά και μόνο από την αλληλεπίδραση η πιθανότητα είναι απλή:

Ελέγχει αυτή υπολογισμού σε όλες τις αλληλεπιδράσεις στο μονοπάτι. Το τελικό σκορ ενός μονοπατιού είναι κατά μέσο όρο πάνω από όλες τις αλληλεπιδράσεις.

Η

Η

Η

Η

Το σκορ δραστηριότητα οδός είναι η μέση πάνω δραστηριότητα των αλληλεπιδράσεων σε μία οδό. Για παράδειγμα, στο προηγούμενο παράδειγμα, η δραστηριότητα αλληλεπίδραση είναι 0,76. Το κύριο πλεονέκτημα για τον υπολογισμό δραστηριότητες μονοπάτι πάνω από συνεκτικότητες οδός είναι ότι οι δραστηριότητες μπορεί να υπολογιστεί ακόμη και όταν δεν υπάρχουν αρκετά στοιχεία για να συνεργαστεί με την έξοδο, όπως συμβαίνει, για παράδειγμα, όταν η αλληλεπίδραση βασίζεται στην ενεργοποίηση ή τροποποίηση των μορίων χωρίς η παραγωγή ενός νέου μορίου ως έξοδο. Σε τέτοιες περιπτώσεις, μπορούμε ακόμα να υπολογιστεί η δραστηριότητα, αν και η συνέπεια χάνει το νόημά της.

Η

Δείτε Μέθοδοι για λεπτομέρειες.

Η

Επιλέγοντας ένα ελάχιστο σύνολο των μονοπατιών για να ταξινομήσει φαινότυπο

Όπως έχουμε αποκτήσει δραστηριότητας και της συνέπειας βαθμολογίες μονοπάτι για κάθε οδό, είμαστε σε θέση να μετατρέψει την εκπροσώπηση της κάθε βιο-δείγμα από μια λίστα των μετρήσεων της γονιδιακής έκφρασης σε μια νέα παράσταση, εμφανίζοντας κάθε δείγμα με τη συλλογή της δραστηριότητας της οδού και τα αποτελέσματα της συνέπειας. Όπως χρησιμοποιούμε αυτή την αναπαράσταση για να γίνει διάκριση μεταξύ των φαινοτύπων, θέλουμε να βρούμε το ελάχιστο σύνολο των μονοπατιών σκορ που είναι σε θέση να κάνουν τη διάκριση μεταξύ φαινοτυπική τάξεις. Χρησιμοποιούμε επιλογής χαρακτηριστικών για να επιλέξετε ένα βέλτιστο ελάχιστο σύνολο (βλέπε αποτελέσματα). Χρησιμοποιήσαμε διαφορετικές μέθοδοι εξαγωγής χαρακτηριστικών γνωρισμάτων και τη λειτουργία ταξινόμησης [28], [29], συμπεριλαμβανομένων των εμπρός επιλογής, προς τα πίσω την επιλογή, και κυμαινόμενο αναζήτηση [29]. Αυτές οι μέθοδοι βοηθούν στην εξάλειψη των βαθμολογιών μονοπάτι που δεν συμβάλει στο να καταστεί η διάκριση και την προβολή συγκεκριμένων οδών που μαζί επίτευξη βέλτιστου ποσοστού κατάταξης.

Διαδρομή μετρική για να προβλέψει το αποτέλεσμα

εκπροσωπούν κάθε βιο-δείγμα χρησιμοποιώντας μονοπάτι μετρήσεις του μας επιτρέπει να αναζητήσουμε πρότυπα στη συλλογή των οδών. Με τη χρήση αλγορίθμων ομαδοποίησης, βλέπουμε ότι μονοπατιού μετρικές τιμές διαχωρίζουν τα δείγματα σε ομάδες. Αν κοιτάξουμε τα μοτίβα επιβίωση των ομάδων αυτών, βλέπουμε ότι σε ορισμένες περιπτώσεις και για ορισμένες οδούς, οι ομάδες συσχετίζονται με διαφορετικά πρότυπα επιβίωσης.

Αποτελέσματα

Η ανάλυση εφαρμόζεται εδώ αντιμετωπίζει ένα μονοπάτι ως δίκτυο γονιδίων των οποίων οι αλληλεπιδράσεις είναι λογικά αξιολογηθεί στο πλαίσιο μονοπάτι για να δημιουργήσει σύνολα των βαθμολογιών. Βιολογικές πληροφορίες δομή της οδού ελήφθη από δημόσιες πηγές [27], [30], [31].

Κάθε μονοπάτι έχει αξιολογηθεί για τη συνοχή και τη δραστηριότητα. Μια βαθμολογία μονοπάτι συνοχή υπολογίζεται ως ο μέσος όρος πιθανότητα της λογικής συνέπειας της συλλογής των αλληλεπιδράσεων με δεδομένες τις υπολογίζονται μέλη των γονιδίων (βλέπε Μέθοδοι). Η βαθμολογία δραστηριότητα μονοπάτι υπολογίζεται ως ο μέσος όρος πιθανότητα μεμονωμένων αλληλεπιδράσεων του μονοπατιού που είναι ενεργό με δεδομένες τις υπολογίζονται γονίδιο κράτη. Χρησιμοποιώντας τις βασικές αρχές της μηχανής εποπτεύεται μάθησης [28], [29] ένας αλγόριθμος ταξινόμησης που διακρίνονται κάθε ογκογόνο φαινότυπο (π.χ. καρκίνος του δείγματος στίχο κανονική) δημιουργήθηκε και επικυρωθεί. Με βάση την απλότητα και τη συγκρισιμότητα των εναλλακτικών προσεγγίσεων που ελέγχθηκαν, χρησιμοποιήθηκε ένα Bayesian γραμμική διακρίνουσα ταξινομητή.

Κατ ‘αρχάς, ένας αλγόριθμος ταξινόμησης προήλθε να διακρίνει διαφορετικές καρκίνο φαινότυποι από φυσιολογικούς ιστούς φαινότυπο. Ένας ταξινομητής που προέρχονται από ένα δείγμα 1800 κατάρτισης σύνολο (10 φορές επικύρωση) αποδεικνύεται% επιτυχία 98 σε μία ανεξάρτητη σειρά δοκιμών επικύρωσης των 211 δειγμάτων (βλέπε Εικόνα 3 και Πίνακα 1).

Κάθε πίνακας στην εικόνα αντιστοιχεί σε μια διαφορετική διαφορά φαινοτυπική, σύμφωνα με λεζάντες πίνακα. Ο οριζόντιος άξονας σε κάθε πάνελ αντιστοιχεί στο μονοδιάστατη προεξοχή υπολογίζονται από τον αλγόριθμο ταξινόμησης, που σηματοδοτεί απόσταση μεταξύ βιολογικά δείγματα, σύμφωνα με τις μετρήσεις πολυδιάστατη οδό. Ο κάθετος άξονας είναι ένα jitter διασποράς των δειγμάτων για να καταστεί δυνατή μια σαφή εικόνα του διαχωρισμού.

Η

Από γραμμική ταξινομητές σειρά κάθε μια από τις πορείες στο πρόβλημα σε μια μεταβλητή στο ταξινομητή, το είναι δυνατή μέσω της ανάλυσης χαρακτηριστικό για τον προσδιορισμό υποσύνολα μεταβλητών ταξινομητή (μονοπάτια) ότι, ως ομάδα, να διακρίνει τους φαινοτύπους με υψηλή ακρίβεια. επιλογής χαρακτηριστικών χρησιμοποιήθηκε για να προσδιορίσει ένα σύνολο που αποδεικνύουν τη βέλτιστη ακρίβεια 98% της αρχικής κατάταξης στην ανάλυση δείγμα επικύρωσης. Αποτελείται από τις βαθμολογίες δραστηριότητας των έξι οδών:. TrkA Διαδρομή περιπάτου, οδός βλάβες του DNA, Ceramide Διαδρομή περιπάτου, τελομεράση Διαδρομή περιπάτου, CD40L Pathway και καλσινευρίνης Pathway

Ο καρκίνος είναι μια ασθένεια με μεγάλη φαινοτυπική και μοριακή ετερογένεια. Ακόμη και μέσα σε μια συγκεκριμένη περιοχή του οργάνου, φαινοτυπική ετερογένεια σχετίζεται με σημαντικές διαφορές στην έκβαση του καρκίνου. Είναι επομένως πρόσθετο ενδιαφέρον για τον εντοπισμό μοριακών διαδικασιών που διέπουν τις φαινοτυπικές διαφορές και ότι προβλέπουν το αποτέλεσμα. Ως εκ τούτου, προκύπτουν υπογραφές για μία ποικιλία υποτύπων του καρκίνου του μαστού. Αυτοί οι υπότυποι περιλαμβάνουν: ιστολογική βαθμού (βαθμοί Elston 1 εναντίον 3, ή βαθμοί 2 έναντι 3)? κατάσταση P53 (μεταλλαγμένα /άγριου τύπου)? υποδοχέα οιστρογόνου θετική /αρνητική κατάσταση (ER +/-)? και του υποδοχέα προγεστερόνης θετική /αρνητική κατάσταση (PgR +/-). Η απόδοση των ταξινομητών εμφανίζεται στο Σχήμα 3. Σε όλες τις περιπτώσεις, ταξινομητές με έναν μικρό αριθμό διόδων (τρεις έως έξι) επιτύχει υψηλό επίπεδο ακρίβειας (83% έως 95%). Ο Πίνακας 1 δείχνει τις διαφορετικές ομάδες μονοπάτι που ταξινομούν διαφορετικούς φαινοτύπους.

Αξιολογήσαμε επόμενο την ικανότητα των καρκινικών υποτύπου-ειδικά υπογραφές για τη διαστρωμάτωση του 236 δείγματα καρκίνου του μαστού κατά έκβαση. Μετά από ανεξέλεγκτους ομαδοποίηση των δειγμάτων καρκίνου του χρησιμοποιώντας τις οδούς που προαναφέρθηκαν, Kaplan Meier αναλύσεις διεξήχθη (Σχήμα 4). Σε τρεις περιπτώσεις, η μοναδική οδός, από το υπο-είδος υπογραφής σημαντικά προβλεπόμενη έκβαση: την οδό Κιρκαδικού Ρυθμοί, από τον βαθμό 1/3 υπογραφή (P = 2.9E-11)? η οδός Sonic Hedgehog, από τον βαθμό 2/3 υπογραφής (Ρ = 4Ε-8)? και αγρίνης σε Μετασυναπτικοί Διαφοροποίηση, από την υπογραφή P53 (P = 4.6E-7). Οι τρεις οδοί στην υπογραφή PgR +/- διαχωρίζονται τα δείγματα σε δύο ομάδες με μία τιμή Ρ 0,0001, με την οδό λογιστική Bone Διαμόρφωση για το μεγαλύτερο μέρος του αποτελέσματος. Επιπλέον, οι πέντε μονοπάτια στο ER +/- υπογραφή διαχωρίζονται τα δείγματα σε δύο ομάδες με μια τιμή Ρ 0.004, με την οδό SREBP αντιπροσωπεύουν το μεγαλύτερο μέρος του αποτελέσματος.

(Α) (1) Kaplan -Meier οικόπεδο επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του μαστού από το [15], κατανεμημένες ανάλογα με την ομαδοποίηση με βάση τη δραστηριότητα οδού. Πάνελ (2) στο (Α) δείχνει την βαθμολογία δραστηριότητα της οδού της hedgehog Sonic χρωματιστό σύμφωνα με υπαγωγή με οποιαδήποτε από τις αναλόγως χρωματισμένο καμπύλες επιβίωσης στο (1)? (Β) Οι ίδιες αναλύσεις γίνονται με τους ασθενείς με καρκίνο του μαστού από [15], με βάση την οδό οστικής ανακατασκευής (βλέπε κείμενο για την επιλογή της οδού). (C) Kaplan Meier για την επιβίωση του καρκίνου του πνεύμονα δεδομένων ασθενούς από το [17], κατανεμημένες ανάλογα με τη δραστηριότητα του μονοπατιού Csk και το (D) NFKβ οδού. Σε κάθε πίνακα, η (2) υπο-πίνακα δείχνει τη μεγαλύτερη επιρροή μετρικό μονοπάτι έξω από την ομάδα της διαστρωμάτωσης μονοπάτια. Αυτό δεν σημαίνει ότι η οδός εκπροσωπούνται είναι υπεύθυνη για ολόκληρο το διαχωρισμό σε δύο ομάδες.

Η

Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι ένας αριθμός ευρημάτων στη βιβλιογραφία προκύπτουν ανεξάρτητα από την ανάλυση μονοπάτι μας για τον καρκίνο του μαστού δείγματα. Καθώς η σημασία της ER +/- διάκριση στην αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού είναι καλά εδραιωμένη, κοιτάξαμε κάθε μία από αυτές τις υποομάδες ξεχωριστά. Έχει παρατηρηθεί [32] ότι ο TrkA Pathway (που προσδιορίζονται τόσο το γενικό ογκογόνο υπογραφή και το βαθμό 2/3 υπογραφή) παίζει σημαντικό ρόλο στην ER- περιπτώσεις. Η ανάλυσή μας δείχνει ότι το γενόσημο ογκογόνο υπογραφή διαχωρίζει τα δείγματα ER- σε δύο ομάδες (Ρ = 4.6E-9) με το μονοπάτι TrkA αντιπροσωπεύουν το μεγαλύτερο μέρος του αποτελέσματος, η υψηλή δραστικότητα αυτής της οδού που συσχετίζεται με κακή πρόγνωση. Ομοίως, έχει παρατηρηθεί [33], [34] ότι οι β-κατενίνης παίζει ένα σημαντικό ρόλο στην απόκριση σε ταμοξιφαίνη, μια τυπική θεραπεία για ER + νόσο. Για την ανάλυση της φύσης του tamoxifen επαγόμενης απόκρισης, που προέρχονται ενός ταξινομητή να διακρίνει τις περιπτώσεις ER + που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με ταμοξιφένη από τις περιπτώσεις που δεν είχαν υποστεί τέτοια επεξεργασία και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται τα μονοπάτια στο προκύπτον υπογραφή να συγκεντρώνονται οι περιπτώσεις με αποτέλεσμα . Το μονοπάτι β-κατενίνης αναδείχθηκε ως η πιο σημαντική (P = 1E-13) της οδού στην πρόβλεψη αποτελέσματος.

Από καιρό έχει προταθεί ότι η μοριακή ταξινομήσεις του καρκίνου μπορεί να έχει την ικανότητα να ξεπεράσουν τους ορισμούς όργανο ή ιστό ειδικά . Πιο συγκεκριμένα, έχει προταθεί ότι η μοριακή ορισμούς που θα αντανακλούν τις καθολικές ιδιότητες του κυτταρικού τύπου ή οντολογία και ότι στηρίζουν μια κοινή μοριακή αιτιολογία μπορεί να προκύψουν σε όλη ορισμούς ιστοσελίδα οργάνων. Για να εκτιμηθεί εάν οι υπογραφές που παρατηρήθηκαν παραπάνω στον καρκίνο του επιθηλίου του μαστού μπορεί να γενικευθεί σε άλλους καρκίνους, εξετάσαμε την ικανότητά τους να προβλέψουν φαινοτύπων σε πνεύμονα και καρκίνο του παχέος εντέρου. Εφαρμόσαμε υπογραφές που προέρχονται από τους υποτύπους του καρκίνου του μαστού να συγκεντρώνονται τα αποτελέσματα του καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 4). Πορείες πρόβλεψη έκβαση περιελάμβαναν την IL-7 Pathway (Ρ = 0,002) και το Csk Pathway (P = 3Ε-11). Έχει ήδη επισημανθεί ότι αυτές οι οδοί έχουν συνδεθεί με αποτέλεσμα στον καρκίνο του πνεύμονα [35], [36]

Τέλος, εξετάσαμε την ικανότητα της γενικής ογκογόνο υπογραφής για την πρόβλεψη του οργάνου τόπου συγκεκριμένο αποτέλεσμα. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι οδοί υπογραφή διαχωρίζονται τα δείγματα καρκίνου του μαστού 236 σε πέντε διαφορετικές υποομάδες επιβίωση (Ρ = 2Ε-8) και ο καρκίνος του πνεύμονα 90 δείγματα σε δύο διαφορετικές υποομάδες (Ρ = 5Ε-17).

Συζήτηση

Τα παραπάνω αποτελέσματα δείχνουν ότι η χρήση της οδού ως μονάδα ανάλυσης μπορεί να αυξήσει τις τρέχουσες μεμονωμένων γονιδίων προσεγγίσεις που βασίζονται σε φαινότυπο χαρτογράφηση στην υποκείμενη μοριακή διαδικασία. Αντικειμενικό προσδιορισμό των διαδικασιών στο παρελθόν που σχετίζονται με φαινότυπους χρησιμοποιώντας γονιδίωμα-ευρεία σύνολα δεδομένων παρέχει μερική επικύρωση των παρατηρούμενων αποτελεσμάτων. Νεοπαρατηρουμένων αντιστοιχίσεις διαδικασία για να φαινοτύπων, ωστόσο, απαιτούν σαφώς είτε επαλήθευσης από ανεξάρτητο σύνολα δεδομένων ή πειραματική επιβεβαίωση.

Οι παρατηρήσεις που γίνονται μέσω αυτής της ανάλυσης είναι προκλητική. Πολλά από αυτά τα μονοπάτια (π.χ. απόπτωση, συντήρηση του τελομερούς) έχουν προηγουμένως περιγραφεί ως καθολική συστατικά της ογκογένεσης [2]. Επιπλέον, οι διαδικασίες που προσδιορίζονται που μπορούν να κρύβονται πίσω σχετίζονται κοινή μορφή καρκίνου φαινοτύπους, όπως φλεγμονή. Είναι ενδιαφέρον, τα νέα μονοπάτια αναγνωρίζονται επίσης ως μέρος του γενικού ογκογόνων υπογραφή όπως απεικονίζεται στα έξι μονοπάτια συλλογική (π.χ. οδοί Ceramide και καλσινευρίνης). Το πρόσφατο ενδιαφέρον για Ceramide υποστηρίζει αυτή την υπόθεση. Ceramide έχει καιρό είναι γνωστό ότι εμπλέκονται στην απόπτωση [37] – [39] και τις πρόσφατες εργασίες εξετάζει την σχετικότητα του κεραμιδιού σε καρκίνο [40] – [42] και στη θεραπεία του καρκίνου [43], [44]. Παρόμοια ενδιαφέρον έχει αναπτυχθεί σε καλσινευρίνης. Ενώ το ενδιαφέρον στο παρελθόν περιοριζόταν στη δραστηριότητά της στην ανοσολογική απόκριση, γίνεται τώρα αναγνωρίζεται ως κυρίαρχο συμμετέχων στην ογκογένεση [45], [46]. Ο συνδυασμός αυτού του συνόλου των μονοπατιών μπορεί να καθορίσει τις βασικές διαδικασίες που είναι χαρακτηριστικές μιας καθολικής τύπου προγονικών κυττάρων.

Αντίθετα, η ανάλυση μονοπάτι του καρκίνου του υπο-φαινότυπους μπορεί επίσης να παρέχει νέες μηχανιστικές γνώσεις που αποκαλύπτουν υποκείμενη βιολογία. Για παράδειγμα, η ταμοξιφένη είναι αποτελεσματική στη θεραπεία ορισμένων περιπτώσεων καρκίνου του μαστού ER +. Σε αυτές τις περιπτώσεις, η ταμοξιφένη πρέπει να επηρεάζουν τη δραστηριότητα των δικτύων αλληλεπίδρασης. Είναι επομένως λογικό να υποθέσουμε ότι θα υπάρξουν παρατηρήσιμες διαφορές στην δραστηριότητα του δικτύου μεταξύ εκείνες τις περιπτώσεις όπου το tamoxifen είναι αποτελεσματική και αυτές οι περιπτώσεις όπου το φάρμακο δεν είναι αποτελεσματικό. Η προσέγγισή μας χρησιμοποιεί μονοπάτι υπογραφές για την πρόβλεψη της διακύμανσης στην έκβαση, η οποία λαμβάνεται ως μέτρο της αποτελεσματικότητας του φαρμάκου. Θεωρούμε ότι η προσέγγισή μας μπορεί να αποκαλύψει αυτά τα δίκτυα που είναι και οι δύο διαφορικά ενεργοποιούνται σε ανταπόκριση στη θεραπεία με ταμοξιφαίνη και σημαντικά για την ανάπτυξη του όγκου και την αειφορία.

Η προσέγγιση που εφαρμόζεται εδώ έχει παραλληλισμούς με τη χρήση των χαρτών του γονιδίου για τη μετάφραση φαινοτύπων σε η μοριακή τομέα. Πρώτον, τα μοντέλα της οδού αντιπροσωπεύουν μια αναπαραγόμενη πλαίσιο που μπορεί να δοκιμαστεί σε όλες τις μελέτες και να επεκταθεί ως καθίστανται διαθέσιμες νέες γνώσεις. Επίσης, οι οδοί και η δομή τους να παρέχουν ένα υψηλότερο σκοπό την κατασκευή για την αξιολόγηση του ρόλου των γονιδίων.

Κάθε αλληλεπίδραση μέσα σε ένα μονοπάτι απαιτεί τη συμβολή πολλών παρατηρήσεων γονιδίου. Κάθε επίπεδο ενιαία δραστηριότητα γονιδιακής συμβάλλει μόνο στο πλαίσιο των άλλων γονιδίων που συμμετέχουν σε μία αλληλεπίδραση εντός του δικτύου διαδικασία. Αυτό αποδεικνύεται από την παρατήρηση ότι ήμασταν σε θέση να αντλήσει αποτελεσματικά ταξινομητές, απευθείας από το γονίδιο-κράτους τιμές μόνο (για τα γονίδια που συνθέτουν τα κύρια έξι μονοπάτια).

Είναι επίσης ενδιαφέρον ότι πέντε από τις έξι οδούς που χρησιμοποιούμε για να ταξινομήσει φυσιολογικά και δείγματα όγκων αποτελούν ένα ενιαίο συνδεδεμένο δίκτυο (Σχήμα 5, η οδός τελομεράσης παραμένει ασύνδετα). Αυτή η διασύνδεση μπορεί να παρέχει νέες ευκαιρίες για την ανάπτυξη παρεμβάσεων. Γνώση των συνδέσεων μπορεί να προτείνει εναλλακτικούς στόχους που θα έχουν πολλαπλές επιδράσεις οδού. Ελάχιστα, δύναται να επιτρέπει την αναγνώριση της πολυπλοκότητας που σχετίζονται με την επιλογή στόχου πριν από το σχεδιασμό παρεμβάσεων.

Το χρώμα εντάχθηκε μονοπάτια μοιράζονται κόμβους.

Η

Είναι κατανοητό ότι η πιθανολογική κατάταξη των γονιδίων σε εναλλακτικές καταστάσεις των κάτω και πάνω είναι μια απλοποίηση των πολύ μεγαλύτερη μοτίβα πολυπλοκότητα της συμπεριφοράς των γονιδίων και δράση. Ωστόσο, η αξιολόγηση εμπειρική των παρατηρούμενων δεδομένων διαπιστώνει ότι τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης που συνήθως μπορεί να χωρέσει μία από τις δύο εναλλακτικές κατανομές επίπεδο έκφρασης. Επιπλέον, η απλοποίηση αυτή έχει αποδειχθεί πολύτιμη σε άλλους ερευνητικούς τομείς. Για παράδειγμα, η απλούστευση που αφαιρεί ψηφιακής λογικής από το υποκείμενο συνεχή ροή των ηλεκτρονίων σε ολοκληρωμένα κυκλώματα επέτρεψε το σχεδιασμό των συσκευών της απίστευτα πολύπλοκες λειτουργίες [47].

Είναι σαφές ότι η τρέχουσα γνώση των βιολογικών μονοπατιών είναι ελλιπής και ατελής. Ως εκ τούτου, οι διαδικασίες που εντοπίστηκαν είναι σχεδόν σίγουρα δεν είναι οι μόνοι παράγοντες που επηρεάζουν τις φαινοτύπους ενδιαφέροντος. Παρ ‘όλα αυτά, όπου εντοπίζονται οι διαδικασίες, μπορούν να χρησιμεύσουν ως σημαντικούς στόχους για περαιτέρω έρευνα. Επιπλέον, η προσέγγιση προσανατολισμένη στη διαδικασία επιτρέπει σε κάποιον να διακρίνει ποια συστατικά των πολύπλοκων δικτύων στα οποία συμμετέχουν γονίδια διαφορικά συμβάλλουν στην φαινότυπο ενδιαφέροντος. Η συνδυασμένη χρήση της δραστηριότητας και βαθμολογίας συνέπεια επιτρέπει τη διάκριση των διεργασιών ενεργοποιημένης λόγω του φαινοτύπου έναντι εκείνων των οποίων η λογική διαφέρει μεταξύ των φαινοτύπων. Το τελευταίο (συνοχή), ενδεχομένως είναι αιτιολογικά αποδίδονται στον φαινότυπο και προτείνει υποψηφίους που έχουν μεταβληθεί. Ωστόσο, χρησιμοποιώντας τα δεδομένα γονιδιακής έκφρασης, τα αποτελέσματα της συνοχής μπορεί να υπολογιστεί μόνο για τις αλληλεπιδράσεις που περιλαμβάνουν γεγονότα της μεταγραφής, περιορίζοντας διακριτική εξουσία τους.