Αφηρημένο

Ιστορικό

Ο καρκίνος του παγκρέατος (PDAC) χαρακτηρίζεται από άφθονη ινώδη ιστό πλούσιο σε τενασκίνη-C (TNC), ένα μεγάλο γλυκοπρωτεΐνη ECM συντίθεται κυρίως από παγκρεατικά αστεροειδή κύτταρα (ΚΕΕ). Στην ανθρώπινη παγκρεατική ιστούς, η έκφραση TNC αυξάνει στην πρόοδο από χαμηλού βαθμού προκαρκινικές βλάβες σε διηθητικό καρκίνο. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η λειτουργικό χαρακτηρισμό των επιπτώσεων της TNC στις βιολογικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος.

Μέθοδοι

Πολλαπλασιασμός, αναλύσεις μετανάστευση και την προσκόλληση πραγματοποιήθηκαν σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές που έλαβαν θεραπεία με TNC ή καλλιεργούνται σε ένα TNC πλούσια σε μήτρα. Σταθερό επιμολύνσεις που εκφράζουν το

μεγάλη

παραλλαγή TNC ματίσματος δημιουργήθηκαν για να ελέγξετε τα αποτελέσματα της ενδογενούς TNC. TNC-εξαρτώμενη σηματοδότησης ιντεγκρίνης ερευνήθηκε από ανοσοαποτύπωση, ανοσοφθορισμό και φαρμακολογική αναστολή.

Αποτελέσματα

Η ενδογενής TNC προωθείται παγκρέατος ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τη μετανάστευση. Μια TNC πλούσια σε μήτρα ενισχυμένη επίσης μετανάστευση καθώς και την προσκόλληση προς την μη επιστρωμένη επιφάνεια ανάπτυξη του χαμηλής διαφοροποίησης κυτταρικών σειρών. Σε αντίθεση, η προσκόλληση σε ινονεκτίνη μειώθηκε σημαντικά με την παρουσία του TNC. Οι επιδράσεις της TNC στην προσκόλληση κυττάρων παραλληλίζονται από αλλαγές στην κατάσταση ενεργοποίησης των παξιλλίνη και Akt.

Συμπέρασμα

TNC επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και την προσκόλληση των πτωχά διαφοροποιημένο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και ως εκ τούτου θα μπορούσε παίζουν ρόλο στην PDAC εξάπλωση και μετάσταση

in vivo

Η

Παράθεση:. Paron Ι, Μπέρτστολντ S, Vörös J, Shamarla Μ, Erkan Μ, Höfler Η, et al. (2011) τενασκίνης-C Ενισχύει καρκίνο του παγκρέατος ανάπτυξη των κυττάρων και την κινητικότητα του και επηρεάζει την κυτταρική προσκόλληση μέσω της ενεργοποίησης της ιντεγκρίνης Διαδρομής. PLoS ONE 6 (6): e21684. doi: 10.1371 /journal.pone.0021684

Επιμέλεια: Cara Gottardi, του Πανεπιστημίου Northwestern, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 12 Δεκ 2010? Αποδεκτές: 8 Ιούνη 2011? Δημοσιεύθηκε: 29, Ιουνίου, 2011

Copyright: © 2011 Paron et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από την (αριθμός Grant: 108038) Deutsche Krebshilfe. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) αντιπροσωπεύει το 85-90% του συνόλου των παγκρεατικών νεοπλασμάτων. Το 2010 43.140 άνθρωποι στις ΗΠΑ είχαν εκτιμάται ότι θα διαγνωστεί με καρκίνο του παγκρέατος και 36.800 να πεθάνουν από αυτό το θανατηφόρο ασθένεια, καθιστώντας PDAC η τέταρτη πιο κοινή αιτία θνησιμότητας των όγκων που σχετίζονται παρά την επίπτωση μόνο το 3% του συνόλου των περιπτώσεων [1 ]. τα ποσοστά επιβίωσης PDAC βελτιώθηκε μόνο οριακά τα τελευταία 30 χρόνια και PDAC ασθενείς εξακολουθούν να έχουν πολύ κακή πρόγνωση, με συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών κάτω από 5% και ένα μέσο ποσοστό επιβίωσης που κυμαίνεται από 2 μήνες σε ασθενείς με μεταστατική νόσο και 8 μήνες σε ασθενείς με μη-μεταστατική νόσο κατά τον χρόνο της διάγνωσης [2]. αποτελέσματα PDAC δεν άλλαξε πολύ τα τελευταία χρόνια, κυρίως λόγω της καθυστερημένης διάγνωσης. PDAC ως τοπική και περιφερειακή ασθένεια είναι κυρίως ασυμπτωματική και εργαλεία για την έγκαιρη ανίχνευση εξακολουθούν να αγνοούνται. Μόλις διαγνωστεί, ο καρκίνος του παγκρέατος είναι συχνά ανθεκτική σε οποιαδήποτε χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία θεραπεία, και πολλές κλινικές δοκιμές έχουν αποτύχει να αποδείξουν μια σημαντική βελτίωση στη συνολική επιβίωση κατά τη διάρκεια της τελευταίας δεκαετίας [3]. Ως εκ τούτου, μια καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που εμπλέκονται στην PDAC ανάπτυξη, συντήρηση και εξάπλωση είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη νέων στοχευμένων θεραπειών για τη θεραπεία αυτής της σήμερα ακόμη θανατηφόρο ασθένεια.

Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα της PDAC είναι η λεγόμενη » δεσμοπλαστικού «αντίδραση, μία άφθονη ινώδης ιστός που περιβάλλει τα καρκινικά κύτταρα και αποτελείται κυρίως από αιμοφόρα αγγεία και στρωματικά κύτταρα απλώνονται σε ένα ικρίωμα του εξωκυτταρικού πλέγματος (ECM). Η ανάπτυξη του δεσμοπλαστικού αντίδρασης οφείλεται κυρίως σε παγκρεατικά αστεροειδή κύτταρα (ΚΕΕ). ΚΕΕ είναι στρωματικά κύτταρα τα οποία, μετά από τη μετατροπή από μία ήρεμη σε ένα δραστικό μυοϊνοβλάστη φαινότυπο, εκκρίνουν πρωτεΐνες ECM και ένζυμα αποικοδόμησης μήτρας, δημιουργώντας έτσι ένα περιβάλλον που προάγει έντονα την εξέλιξη του καρκίνου και, ταυτόχρονα, επιβάλλει εμπόδιο στην παροχή φαρμάκου [ ,,,0],4] – [7].

τενασκίνης-C (TNC) είναι μια μεγάλη γλυκοπρωτεΐνη ECM αποτελείται από έξι μονομερή που συνδέονται στο Ν-άκρα τους με δισουλφιδικούς δεσμούς για να σχηματίσει ένα εξαμερές 1080-1500 kDa. Κάθε μονομερές αποτελείται από διαφορετικά δομικά μοτίβα διατεταγμένα σε μια γραμμική σειρά, ακόμη και μεταξύ 8 και 15 ινωδονεκτίνης τύπου III (FN-III) -όπως επαναλήψεις [8], [9]. Το εναλλακτικό μάτισμα του FN-ΙΙΙ επαναλήψεις τύπου είναι σε θέση να ρυθμίζουν τη βιολογική λειτουργία του TNC τροποποιώντας την αλληλεπίδραση της με άλλες πρωτεΐνες ECM, όπως φιμπρονεκτίνη (FN), ή με υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας, όπως ιντεγκρίνες ή αννεξίνη II, και με την παροχή Μερικές φορές απέναντι ρόλους σε TNC στην εξάπλωση των κυττάρων, την προσκόλληση και τον πολλαπλασιασμό [10], [11].

TNC εκφράζεται κυρίως κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη. Στους ενήλικες, TNC έχει περιορισμένο πρότυπο έκφρασης (στη βασική μεμβράνη του δέρματος, στους αγωγούς των σιελογόνων αδένων, στο βλεννογόνο του παχέος εντέρου και στα τοιχώματα των αγγείων των διαφόρων οργάνων), αλλά τα επίπεδα πρωτεΐνης αυξάνονται δραματικά κάτω από διάφορες φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, όπως αναδιαμόρφωση των ιστών, νεοαγγείωση και φλεγμονή [12], [13]. Επιπλέον, τα περισσότερα στερεά όγκοι εκφράζουν υψηλά επίπεδα του TNC. TNC είναι σε θέση να επηρεάσει την ανάπτυξη του καρκίνου επηρεάζοντας την κυτταρική προσκόλληση και κινητικότητα κατά τρόπο που μπορεί να προωθήσει την εισβολή και τη μετάσταση [14] και επηρεάζοντας την κυτταρική έκφραση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων, ογκογονίδια και τα γονίδια που εμπλέκονται στη διατήρηση της σταθερότητας γονιδιώματος [15]. Στην κανονική του παγκρέατος, του TNC εκφράζεται στο μυϊκό τοίχωμα των αιμοφόρων αγγείων και στρωματικών ιστού γύρω από τα interlobular αγωγών. έκφραση TNC είναι επάνω ρυθμισμένη σε οξεία και χρόνια παγκρεατίτιδα [16], και οι αυξήσεις στην πρόοδο από πρόδρομα αλλοιώσεις χαμηλού βαθμού (παγκρεατική ενδοεπιθηλιακή νεοπλασία, PanIN) να PDAC [17]. Σε PDAC TNC εκφράζεται αποκλειστικά στο στρώμα γύρω από τις νεοπλασματικές αδένων [16], [17]. Up-ρύθμιση του TNC σε εξέλιξης του καρκίνου φαίνεται να αφορά συγκεκριμένα το

μεγάλο

παραλλαγή ματίσματος, ως το μεγαλύτερο μεταγράφημα TNC, που αντιστοιχεί στο μη συρραμμένο μορφή TNC, βρίσκεται σε καρκίνο του παγκρέατος και σε χρόνια παγκρεατίτιδα, αλλά όχι σε οι συνήθεις πάγκρεας [17]. ΚΕΕ έχει αποδειχθεί ότι είναι η κύρια πηγή της TNC

in vivo,

ενώ PDAC κύτταρα δεν παρουσιάζουν καμία έκφραση TNC είτε με ανοσοϊστοχημεία ή ανοσοαποτύπωση. Ωστόσο, τα χαμηλά επίπεδα της TNC mRNA βρέθηκαν στο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές με πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR [17].

Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήσαμε μια εκτενή ανάλυση των συνεπειών των εξωγενών TNC στις λειτουργίες των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος και διερευνήσαμε την επίδραση της ενδογενούς υπερέκφρασης TNC στον παγκρεατικό καρκίνο κυτταρική γραμμή PANC-1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν μια κύριος ρόλος του TNC στη ρύθμιση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων και ECM στην εξέλιξη του καρκίνου του παγκρέατος.

Αποτελέσματα

Επιδράσεις της εξωγενούς TNC για παγκρεατικό ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

Αρχικά, ελέγχθηκε αν TNC προστίθεται στο μέσο καλλιέργειας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις θα μπορούσε να επηρεάσει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Η αύξηση του αριθμού των βιώσιμων Capan-1, AsPC-1 και SU.86.86 κύτταρα (έως 25%) σε συγκέντρωση TNC του 0.01-0.1 μg /ml παρατηρήθηκε, όπως μετράται με τη δοκιμασία ΜΤΤ μετά από 72 ώρες ανάπτυξης σε μέσο ελεύθερο ορού (Εικ. 1Α). Η ανάπτυξη του AsPC-1 και Capan-1 αναστάλθηκε στην υψηλότερη συγκέντρωση TNC (10 μg /ml, 41 και 34% μείωση, αντίστοιχα). TNC είχε ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της βιωσιμότητας των κυτταρικών γραμμών ΜΙΑ PaCa-2 PANC-1 και (Εικ. 1Α). Από TNC ασκεί τη λειτουργία του ως ECM-πρωτεΐνης, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μια μήτρα TNC-πλούσια. Όταν εμβολιάζονται στο TNC πλάκες επικαλυμμένες και αναπτύχθηκαν μέχρι και 72 ώρες σε μέσο χωρίς ορό, PANC-1 και ΜΙΑ PaCa-2 έδειξαν μία αύξηση 44% και 27% της βιωσιμότητας, αντίστοιχα, ενώ η αύξηση του Capan-1 και AsPC- 1 μειώθηκε (23% και 45%, αντίστοιχα) (Σχ. 1Β).

(Α) τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 72 ώρες σε μέσο ελεύθερο ορού που περιείχε διαφορετικές συγκεντρώσεις του TNC (0,01, 0,1, 1 και 10 μg /ml). (Β) Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν για 72 ώρες σε μέσο ελεύθερο ορού επί TNC επικαλυμμένες πλάκες (1 μg /cm

2). Ανάπτυξης προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα υπολογίζονται ως μέση τιμή +/- S.E.M. τριών πειραμάτων και εκφράζονται ως ποσοστό σε σύγκριση με τους μη επεξεργασμένους μάρτυρες (° ρ & lt? 0,05, * ρ & lt? 0,01, ** ρ & lt? 0.001, σπουδαστές two-tailed t test)

Η

Εξωγενείς TNC διαμορφώνει. η κινητικότητα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του παγκρέατος

για να δοκιμαστεί η επίδραση του TNC για τη μετανάστευση των παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, επούλωσης τραύματος δοκιμασίες διεξήχθησαν διατήρηση των κυττάρων σε μέσο ελεύθερο ορού με σκοπό την ελαχιστοποίηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων. TNC δεν είχε καμία επίδραση σχετικά με το κλείσιμο του τραύματος όταν προστίθεται στο μέσο ανάπτυξης (Εικ. 2Α). Όταν καλλιεργούνται σε ένα TNC πλούσια μήτρα, παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έκλεισε το τραύμα σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, αλλά κάθε κυτταρική γραμμή παρουσίασαν αρκετά ατομική απόκριση σε διαφορετικές συγκεντρώσεις TNC. Σε λεπτομέρεια, η μετανάστευση των κυττάρων αυξήθηκε έως 1.7 και 1.1 φορές στην SU.86.86 και κυτταρικές γραμμές PANC-1, αντίστοιχα, φθάνοντας στατιστική σημαντικότητα σε συγκέντρωση TNC του 0,5 μg /cm2 σε SU.86.86 κύτταρα και 0,1 μg /cm2 σε κύτταρα PANC-1. Από την άλλη πλευρά, το κλείσιμο της πληγής μειώθηκε σημαντικά (μέχρι και 0,8 φορές) σε Capan-1 κύτταρα με συγκεντρώσεις TNC του 0,5 και 2,5 μg /cm2 (Εικ. 2Β). Μια συγκέντρωση TNC του 2,5 μg /cm2 είχε τοξικές επιδράσεις στα κύτταρα PANC-1, και η πληγή δοκιμασία επούλωσης δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί υπό την κατάσταση αυτή.

(Α) Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν επάνω σε μη επικαλυμμένο πλακών και μετά από 24 ώρες η μονοστιβάδα ξύνεται με ένα ρύγχος πιπέτας 10 μl. Τα κύτταρα μετά επωάστηκαν σε μέσο χωρίς ορό ή σε μέσον με την προσθήκη TNC σε διαφορετικές συγκεντρώσεις (0,2 μg /ml, 1 μg /ml και 5 μg /ml) έως και 48 ώρες. (Β) Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων επικαλυμμένες με τρεις διαφορετικές συγκεντρώσεις του TNC (0,1 μg /cm

2, 0.5 μg /cm

2 και 2,5 μg /cm

2) ή επάνω σε μη επικαλυμμένο πλακών και μετά από 24 ώρες η μονοστοιβάδα ξύστηκε με ένα ρύγχος πιπέτας 10 μΙ. Τα κύτταρα μετά επωάστηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού μέχρι και 48 ώρες. Η μετανάστευση των κυττάρων σε τραυματισμένους περιοχές εκτιμήθηκε καταμέτρηση μετανάστευσαν κυττάρων με το χέρι και από το λογισμικό TScratch [36] και ένα σύνολο 2-8 πεδία μετρήθηκαν ανά ομάδα σε κάθε πείραμα. Τα δεδομένα υπολογίζονται ως μέση τιμή +/- S.E.M. και εκφράζονται ως φορές αλλαγή σε σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν μη (° ρ & lt? 0,05, * ρ & lt? 0,01, ** p & lt? 0.001, μαθητές δύο-tailed t test)

Η

Επιπτώσεις της ενδογενούς TNC. στη βιωσιμότητα των κυττάρων και τη μετανάστευση

για να δοθεί περαιτέρω υποστήριξη των παρατηρούμενων αποτελέσματα προαγωγής του TNC επί παγκρεατικού ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και κινητικότητα κατά τη διαδικασία επικάλυψης, κύτταρα PANC-1 χρησιμοποιήθηκαν για να δημιουργηθούν σταθερές επιμολύνσεις που εκφράζουν το

μεγάλο παραλλαγή ματίσματος

TNC. Από TNC φυσιολογικά δρα ως μία εξωκυτταρική πρωτεΐνη, θετικοί κλώνοι περαιτέρω επιλέγονται με βάση την ικανότητα τους να εκκρίνουν TNC στο μέσο καλλιέργειας. Όπως φαίνεται στο σχήμα 3Α, τα επίπεδα έκφρασης της εκκρινόμενης TNC ήταν αρκετά διαφορετική μεταξύ θετικοί κλώνοι. Διαφορετικά επίπεδα έκφρασης αντικατοπτρίζεται σε ορισμένες από τις βιολογικές δράσεις του TNC, όπως την ικανότητά του να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων. Στην πραγματικότητα, ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων, όπως μετράται με τη μέθοδο ΜΤΤ μετά από 24, 48 και 72 ώρες ανάπτυξης σε πλήρες μέσο, ​​ήταν υψηλότερη στα TNC-θετικούς κλώνους σε σύγκριση τόσο με το μη επιμολυσμένα και με την ψευδο-διαμολυσμένα PANC-1 κύτταρα (Σχ. 3Β και C). Η ισχυρότερη επίδραση (σε σύγκριση με τα μη επιμολυσμένα κύτταρα) παρατηρήθηκε στον κλώνο Τ2, η οποία έδειξε επίσης τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης της εκκρινόμενης TNC (Εικ. 3Α και Β). Αναλυτικότερα, σε σύγκριση με τα μη επιμολυσμένα κύτταρα, κύτταρα PANC-Τ2 έδειξαν αύξηση στην κυτταρική βιωσιμότητα του 2,06 φορές +/- 0.01 μετά από 24 ώρες, από 2,49 φορές +/- 0.04 μετά από 48 ώρες και από 3,88 +/- 0,09 μετά από 72 ώρες. Σε PANC-T24, η αύξηση ήταν 1,21 φορές +/- 0.01 μετά από 24 ώρες και 1,14 φορές +/- 0.02 μετά από 48 ώρες, και PANC-T27 1,43 φορές +/- 0.02 μετά από 24 ώρες, 1,32 φορές σε +/- 0.03 μετά από 48 ώρες και 1,08 φορές +/- 0.05 μετά από 72 ώρες. Τα ποσοστά κυτταρικής βιωσιμότητας των PANC-1 κύτταρα που υπερεκφράζουν TNC σε σύγκριση με τα ψευδο-μορφομετατραπέντα κύτταρα ήταν 55% υψηλότερη σε 24 ώρες, 68% υψηλότερη σε 48 ώρες και 99% υψηλότερη σε 72 ώρες (Εικ. 3C).

κύτταρα PANC-1 επιμολύνθηκαν σταθερώς με ένα φορέα που προωθεί την έκφραση του

μεγάλο

TNC (PANC-T2, PANC-T24 και PANC-T27 κύτταρα) και με τον κενό φορέα (PANC-C21, PANC-C23 και PANC-C27 κύτταρα). (Α) Ανοσοκηλίδωση των καταβυθισμένου μέσο καλλιέργειας κυττάρων των επιμολυσμένων κυττάρων PANC-1 αναπτύχθηκαν μέχρι 80% συρροή. Για να διασφαλιστεί ότι ένας συγκρίσιμος αριθμός των επιμολυσμένων κυττάρων ήταν η πηγή του εκκρινόμενης TNC, έκφραση GAPDH σε εκχυλίσματα ολόκληρων κυττάρων ελέγχθηκε. κύτταρα PANC-T2 παρουσιάζουν τα υψηλότερα επίπεδα της εκκρινόμενης TNC, ενώ τα χαμηλότερα επίπεδα παρατηρούνται σε PANC-T24 και PANC-T27. Οι κλώνοι ελέγχου σε σύγκριση δεν δείχνουν καμία έκκριση TNC. (Β) Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο. Ανάπτυξης προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ σε διαφορετικά χρονικά σημεία (24, 48 και 72 ώρες). Τα δεδομένα υπολογίζονται ως μέση τιμή +/- S.E.M. τριών πειραμάτων και εκφράζονται ως ποσοστό σε σύγκριση με τα κύτταρα PANC-1 (° ρ & lt? 0,05, * ρ & lt? 0,01, ** ρ & lt? 0.001, σπουδαστές two-tailed t test). Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού είναι σημαντικά υψηλότερο για PANC-T2 σε όλα τα χρονικά σημεία (ρ & lt? 0.001), για PANC-Τ24 στις 24 ώρες (ρ & lt? 0.001) και στις 48 ώρες (ρ = 0,022) και για PANC-T27 στο 24 (ρ & lt ? 0.001) και 48 ώρες (ρ = 0.009). (Γ) Ο πολλαπλασιασμός όλων των PANC-1 θετικούς κλώνους (PT) σε σύγκριση με τα ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (PC) είναι σημαντικά υψηλότερο για κάθε ελεγχόμενο χρονικό σημείο (24 ώρες: p = 0,004, 48 ωρών: ρ = 0.012, 72 ώρες : p = 0,026) (D) επιμολυσμένα κύτταρα PANC-1 καλλιεργήθηκαν, μετά από μέσο 24 ωρών άλλαξε με μέσο που περιέχει 0,1% FBS και, μετά από ολονύκτια επώαση, η μονοστιβάδα αποξέστηκε με ένα ρύγχος πιπέτας 10 μΙ. Τα στοιχεία υπολογίζονται όπως περιγράφεται στο Β Σε σύγκριση με την μη επιμολυσμένα κύτταρα 1 PANC-, η μετανάστευση είναι σημαντικά ταχύτερη για PANC-T2 (ρ & lt? 0.001 σε αμφότερα τα χρονικά σημεία) και για PANC-T27 (ρ = 0,042 σε 24 ώρες? p = 0,009 σε 48 ώρες). (Ε) Όλοι μαζί, οι PANC-1 θετικών κλώνων (PT) μεταναστεύουν πολύ πιο γρήγορα σε σύγκριση με τα ψευδο-επιμολυσμένα κύτταρα (PC) και στα δύο χρονικά σημεία (ρ & lt? 0.001)

Η

Η μετανάστευση των κυττάρων για την. Αντιθέτως δεν επηρεάστηκε από τα επίπεδα έκφρασης της εκκρινόμενης TNC. Σταθερό επιμολυσμένα PANC-T2, PANC-T24 και PANC-T27 κύτταρα κλείσει την πληγή πιο γρήγορα από ό, τι μη επιμολυσμένα και mock επιμολυσμένων κυττάρων. Σε σύγκριση με το μη επιμολυσμένα PANC-1 κύτταρα, αυτή η επίδραση ήταν σημαντική στις 24 ώρες (1.52-φορές +/- 0.09) και στις 48 ώρες (1.46-φορές +/- 0.08) για PANC-T2 και στο 24 (1.66- fold +/- 0.13) και 48 ώρες (1,46-φορές +/- 0.08) για PANC-T27 (Σχ. 3D). Όλοι οι θετικοί κλώνοι μαζί είχαν υψηλότερο ρυθμό μετανάστευσης σε σύγκριση με τα ψευδο-επιμολυσμένα κλώνους (62% στις 24 ώρες και 43% στις 48 ώρες, Σχ. 3Ε).

Εξωγενείς TNC διεγείρει κυτταρική προσκόλληση σε μη επικαλυμμένες πλάκες και μειώνει εξάπλωση των κυττάρων σε FN

Όπως προσκόλλησης κυττάρου μαζί με την μετανάστευση και ικανότητα εισβολής είναι ένα κρίσιμο βήμα που εμπλέκονται στον καρκίνο εξάπλωση και μετάσταση, η πρόσφυση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος σε TNC ερευνήθηκε περαιτέρω. Από το TNC υπερέκφραση συσχετίζεται με κακή διαφοροποίηση του όγκου

in vivo

[16], εστιάσαμε τη μελέτη μας σχετικά με τα ελάχιστα διαφοροποιημένες κυτταρικές σειρές PANC-1 και SU.86.86 [18], [19]. TNC επίστρωση ενισχυμένη έντονα την πρόσφυση των δύο κυτταρικών σειρών (PANC-1: 7.0 φορές, σ & lt? 0.001? SU.86.86: 4,6-φορές, σ & lt? 0.001). Όπως εκτιμάται από κρυσταλλικό ιώδες απορρόφηση φασματοσκοπία προσκολλημένων κυττάρων (Σχήμα 4Α, αριστερό πάνελ). Στο πλαίσιο των ιστών, κύτταρα αλληλεπιδρούν με TNC σε συνδυασμό με άλλες πρωτεΐνες ECM. Μεταξύ αυτών, FN συχνά συν-εκφράζονται με TNC [20]. Ως εκ τούτου, προκειμένου να δοκιμαστεί εάν TNC ρυθμίζει προσκόλληση κυττάρου παρουσία του FN, PANC-1 και τα κύτταρα SU.86.86 απλώθηκαν σε ένα μικτό υπόστρωμα του FN και TNC. TNC παρουσία προσδιορίζεται μια σημαντική μείωση στην προσκόλληση των δύο κυτταρικές σειρές στην FN στις 3 ώρες μετά την επίστρωση (PANC-1: 1,6 φορές, ρ & lt? 0,001? SU.86.86: 1,2 φορές, ρ = 0.003). (Εικόνα 4Α, αριστερά πίνακας). Για να ελεγχθεί αν αυτή η επίδραση θα μπορούσε να οφείλεται στο υπόστρωμα ανταγωνισμός μεταξύ των δύο πρωτεϊνών όταν χρησιμοποιούνται μαζί για την επικάλυψη της πλαστικής επιφάνειας, η σύνδεση του υποστρώματος αποτελεσματικότητα του συνθέτου μήτρας ερευνήθηκε με ELISA. Η αποτελεσματικότητα δέσμευσης του FN ή TNC από μόνη της δεν επηρεάστηκε όταν οι πλάκες επικαλύφθηκαν με τα δύο πρωτεΐνες ταυτόχρονα, όπως φαίνεται στο σχήμα 4Β και Γ βιωσιμότητα κυττάρου επίσης δεν επηρεάζονται σημαντικά όταν τα κύτταρα αναπτύχθηκαν πάνω σε πλάκες επικαλυμμένες με FN /TNC σε σύγκριση με FN επικαλυμμένο πλάκες (ΜΤΤ δοκιμασία, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι TNC παρεμβαίνει κυτταρικής πρόσφυσης σε FN, αλλά έχει ένα αντίθετο αποτέλεσμα επί μη επικαλυμμένων πλακών.

(Α) Τα κύτταρα απλώθηκαν σε μέσο που περιείχε 1% FBS, επωάζονται για 3 ώρες και σταθερό . Για φαρμακολογική αναστολή, τα κύτταρα επωάστηκαν με AZD0530 2 μΜ για 15 λεπτά πριν από την επίστρωση. Αριστερό πλαίσιο: TNC ενισχύει την κυτταρική προσκόλληση σε σύγκριση με μη επικαλυμμένα τρυβλία και μειώνει κυτταρική προσκόλληση στην FN. Δεξιό πλαίσιο: Όταν κατεργάζεται με AZD0530, τα κύτταρα εμφάνιζαν μειωμένη πρόσφυση σε σύγκριση με τα μη κατεργασμένα κύτταρα σε όλες τις συνθήκες που δοκιμάστηκαν. Τα δεδομένα υπολογίζονται ως μέσος όρος +/- SEM δύο πειραμάτων και εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με το μάρτυρα (Ctrl) (αριστερός πίνακας) ή με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (δεξιά πάνελ) (* ρ & lt? 0,01, ** ρ & lt? 0.001, ANOVA τεστ). (B, C) πλάκες 96-φρεατίων επικαλύφθηκαν με TNC (0,5 μg /cm

2), FN (1 μg /cm

2) ή και οι δύο πρωτεΐνες ταυτόχρονα (FN /TNC) και ELISA πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Η δραστικότητα σύνδεσης υποστρώματος του TNC ή FN δεν επηρεάζεται όταν οι δύο πρωτεΐνες areused για την επικάλυψη της πλαστικής επιφάνειας. (D, E) PANC-1 (D) και τα κύτταρα SU.86.86 (Ε) επιστρώθηκαν για 45 λεπτά προτού διεξαχθεί συνολική εκχύλιση πρωτεΐνης. Η φωσφορυλίωση του παξιλλίνη σε Tyr 118 (pPAX) και της Akt σε Ser 473 (ρΑΚΤ), και συνολικά επίπεδα παξιλλίνη και Akt έκφραση διερευνήθηκαν με ανοσοκηλίδωση χρησιμοποιώντας ειδικά αντισώματα και μετά την κατεργασία των κυττάρων με τον αναστολέα κινάσης Src AZD0530. ανίχνευση GAPDH χρησιμοποιήθηκε για την επιβεβαίωση της ίσης φόρτωσης πρωτεΐνης.

Η

TNC και FN επιρροή παξιλλίνη και ενεργοποίηση Akt με φωσφορυλίωση

Για να διερευνηθούν οι πορείες που εμπλέκονται στην κόλλα συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος επί TNC ή /και επί FN υποστρωμάτων, το επίπεδο φωσφορυλίωσης των παξιλλίνη σε Tyr 118, ένα πρώιμο στάδιο στην μεσολάβηση ιντεγκρίνης σηματοδότηση, καθώς και το επίπεδο της φωσφορυλίωσης της Akt σε Ser 473 και τα επίπεδα έκφρασης του βινκουλίνης, μιας πρωτεΐνης που εμπλέκεται στη σύνδεση εστιακής συμφύσεων στην κυτταροσκελετού της ακτίνης, αναλύθηκαν με ανοσοκηλίδωση.

Όπως φαίνεται στο Σχ. 4, TNC και FN είχε ελαφρά ενισχυτική δράση επί της κατάστασης φωσφορυλίωσης των Aktin γραμμών PANC-1 και SU.86.86 κύτταρο κατά την διάρκεια των πρώτων σταδίων της κυτταρικής προσκόλλησης (45 λεπτά). Η επίδραση αυτή δεν ήταν εμφανής πια μετά από 24 ώρες και σε μεταγενέστερα χρονικά σημεία (δεν φαίνεται). Όσο για προσκόλληση κυττάρου, TNC φαινόταν να έχει αντίθετα αποτελέσματα, ανάλογα με την πειραματική διάταξη. Στην πραγματικότητα φωσφο-Ακί ήταν ελαφρώς πάνω ρυθμισμένα κατά τη σύγκριση TNC επικαλυμμένες πλάκες

vs μη επικαλυμμένων πλακών

και ρυθμισμένα προς τα κάτω κατά τη σύγκριση πλάκες επικαλυμμένες FN /TNC

vs

FN επικαλυμμένες πλάκες. Η ίδια τάση θα μπορούσε να εκληφθεί κατά τη μέτρηση της ενεργοποίησης παξιλλίνης, ενώ τα επίπεδα βινκουλίνης δεν επηρεάζεται ούτε από TNC ή FN (δεν φαίνεται). Ο αναστολέας κινάσης Src AZD0530 (Saracatinib), η οποία αναστέλλει τη φωσφορυλίωση της παξιλλίνης και Akt, χρησιμοποιήθηκε για να επιβεβαιώσει ότι οι παρατηρούμενες επιδράσεις στην προσκόλληση των κυττάρων στην πραγματικότητα διαμεσολαβείται από μόρια του μονοπατιού σηματοδότησης ιντεγκρίνης. Σε πειράματα προσκόλλησης, μετά από επώαση με AZD0530 μια αναστολή της παξιλλίνης και φωσφορυλίωσης Akt παρατηρήθηκε (Εικ. 4D και Ε). Αυτή η επίδραση συνοδεύτηκε από μία σημαντική μείωση σε PANC-1 και SU.86.86 πρόσφυση σε όλες τις συνθήκες που δοκιμάστηκαν (PANC-1 FN: p = 0,004? Όλες οι άλλες συνθήκες ρ & lt? 0.001), με εξαίρεση την προσκόλληση SU.86.86 να μη επικαλυμμένων πλακών (Εικ. 4Α, δεξιά πλευρά).

στη συνέχεια, TNC επίδραση στη συναρμολόγηση εστιακή προσκόλληση διερευνήθηκε σε μορφολογικό επίπεδο με ανοσοφθορισμό. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5, PANC-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν για 45 λεπτά σε ένα TNC επικαλυμμένη επιφάνεια έδειξε ένα πιο διάχυτο πρότυπο συν-εντοπισμό βινκουλίνης και φωσφο-παξιλλίνη από αυτή που παρατηρήθηκε στην μη επικαλυμμένη επιφάνεια, όπου εστιακές συμφύσεις εμφανίστηκε πιο επιμήκεις και κυρίως συγκεντρώνεται στην περιφέρεια του η εξάπλωση των κυττάρων. Σε μια μήτρα FN, παρατηρήθηκαν μόνο ελαφρώς αξιοσημείωτες διαφορές σε φωσφο-παξιλλίνη και διανομή βινκουλίνης μεταξύ κυττάρων προσκολλημένα στην FN και FN /TNC. Σε αμφότερες τις περιπτώσεις, φωσφο-παξιλλίνη περιοχές /βινκουλίνης περιορίζονταν κυρίως στην περιφέρεια των προσκολλημένων κυττάρων, με μεγαλύτερη και πιο διασκορπισμένη θέσεις προσκόλλησης παρουσία TNC.

PANC-1 κύτταρα αφέθηκαν να προσκολληθούν ακάλυπτα ή TNC, FN και FN /TNC επικαλυμμένα καλυπτρίδες για 45 λεπτά, πλένονται απαλά, σταθεροποιήθηκαν και υπέστησαν χρώση με φθορίζοντα δευτερεύοντα αντισώματα. Εστιακή πλάκες προσκόλληση αποδείχθηκαν από συν-εντοπισμό βινκουλίνης (πράσινο) και φωσφο-παξιλλίνη (pPAX, κόκκινο). πυρήνες κυττάρων αντίθετα με Hoechst 33342.

Η

Συζήτηση

PDAC χαρακτηρίζεται από έντονη αύξηση του συνδετικού ιστού που περιβάλλει τα καρκινικά κύτταρα. Σημαντικότερους παράγοντες για αυτό το λεγόμενο «δεσμοπλαστικού» αντίδραση είναι ΚΕΕ, έναν υποπληθυσμό των παγκρεατικών κυττάρων που, όταν ενεργοποιηθεί από αυξητικούς παράγοντες, κυτοκίνες και το οξειδωτικό στρες, εκκρίνουν υπερβολικές ποσότητες των πρωτεϊνών της ECM και διαλυτών μεσολαβητών για τη θέσπιση cross-talk με καρκινικά κύτταρα. Διάφορες ενδείξεις υποδεικνύουν ότι η δεσμοπλαστικού μικροπεριβάλλον παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ταχείας ανάπτυξης και εισβολή του καρκίνου του παγκρέατος, η αγγειογένεση και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [4] – [7], [21] – [26].

TNC είναι μια μεγάλη πρωτεΐνη ECM στρωματικά οποία είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω στην εξέλιξη από PanINs να PDAC [17] και η έκφρασή του έχει συσχετιστεί με μια κακώς διαφοροποιημένο φαινότυπο PDAC [16]. Επιπλέον, η έκφραση TNC έχει συσχετισθεί με πτωχή πρόγνωση των ασθενών που πάσχουν από πνεύμονα και καρκίνου του εγκεφάλου [21], [27] – [29], ενώ κανένας συσχετισμός μεταξύ των επιπέδων έκφρασης και πρόγνωση έχει βρεθεί σε καρκίνο του παγκρέατος [16]. TNC είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με αρκετές πρωτεΐνες ECM (όπως FN, περλεκάνη, αγγρεκάνη, βερσικάνη και brevican) και πολλοί υποδοχείς κυτταρικής επιφάνειας (συμπεριλαμβανομένων των ιντεγκρινών α2β1, α7β1, α9β1, ανβ3, αννεξίνη II, EGFR και συνδεκανίου 4), διαμορφώνοντας κυτταρική σηματοδότησης και επηρεάζοντας την κυτταρική μετανάστευση και τον πολλαπλασιασμό [11]. Επιπρόσθετα, στον ενήλικο οργανισμό TNC έχει συγκολλητικές και αντι-συγκολλητικές ιδιότητες και εκφράζεται κατά την διάρκεια φυσιολογικών και παθολογικών καταστάσεων όπου η μετανάστευση κυττάρων και αναδιαμόρφωση ιστού εμπλέκεται, όπως και στη διαδικασία επούλωσης του τραύματος ή κατά τη διάρκεια της ογκογένεσης και της μετάστασης [11]. Ωστόσο, οι μοριακοί μηχανισμοί με τους οποίους TNC επηρεάζει την εξέλιξη του καρκίνου παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστες. Για να απαντηθεί αυτό το ερώτημα στο PDAC, ερευνήσαμε πώς TNC επηρεάζει βιολογικές ιδιότητες των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος.

Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ δείχνουν ότι TNC είναι σε θέση να υποστηρίξει και να προωθήσει την ανάπτυξη και τη μετανάστευση των κακώς διαφοροποιημένο καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές σειρές . Μια άλλη ενδιαφέρουσα παρατήρηση είναι ότι TNC μόνος δεικνύει ένα προ-κολλητική επίδραση επί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, σε αντίθεση με την αναφερόμενη αντι-προσκολλητική επίδραση στην πλειονότητα των άλλων κυτταρικών σειρών που μελετήθηκαν, όπως τα κύτταρα γλοιοβλαστώματος και του μαστού καρκίνωμα [22]. Αυτό προ-κολλητική επίδραση επί παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα συνδέεται με μια αύξηση στην κατάσταση φωσφορυλίωσης της Akt και σε μικρότερο βαθμό από παξιλλίνη. Αυτό υποδηλώνει ένα μηχανισμό που περιλαμβάνει διαμεσολαβούμενη από ιντεγκρίνη προσκόλλησης να TNC, κατ ‘αναλογία με ό, τι έχει προηγουμένως αποδειχθεί σε κύτταρα χονδροσαρκώματος, όπου μια αύξηση του Ser 473 φωσφορυλίωσης της Akt σε κύτταρα τήρηση TNC προάγει την επιβίωση των κυττάρων σε υποβαθμισμένες ορό μέσο [23]. Ωστόσο, τα αποτελέσματα της TNC επί παγκρεατικού βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό ήταν αρκετά ετερογενής και μια αναστολή της ανάπτυξης παρατηρήθηκε σε μερικές κυτταρικές γραμμές, ως επί το πλείστον στις υψηλότερες συγκεντρώσεις του TNC. Αυτό το αποτέλεσμα δεν αποτελεί έκπληξη, λόγω της ετερογένειας των κυτταρικών γραμμών PDAC αφορούν την καταγωγή και διαφοροποίησή τους [19], [20] και με τις πλειοτροπικές και συχνά αντίθετες επιδράσεις της TNC ανάλογα με το πλαίσιο των κυττάρων και των ιστών.

In vitro

μελέτες αναφέρουν συχνά αντιφατικά αποτελέσματα, με TNC τόσο την τόνωση της [24], καθώς και την αναστολή [25] την ανάπτυξη των κυττάρων και την προώθηση τόσο την κυτταρική προσκόλληση και την αποκόλληση [26]. Επιπλέον, απέναντι κόλλας και των μεταναστευτικών απαντήσεις TNC στην ίδια κυτταρική σειρά γλοιώματος, ανάλογα με τον υποδοχέα ιντεγκρίνης εμπλέκονται [30] και διαφορετικές κόλλας αποκρίσεις που προκαλούνται από τον ίδιο ιντεγκρίνης σε διαφορετικές κυτταρικές σειρές [31] έχουν περιγραφεί. Είναι ενδιαφέρον, σε μια FN επικαλυμμένη επιφάνεια TNC μειώνει την προσκόλληση των κυττάρων του καρκίνου του παγκρέατος και φωσφο-παξιλλίνη και φωσφο-Akt επίπεδα. Αυτό το αποτέλεσμα σε ένα μικτό μήτρα TNC-FN, το οποίο μοιάζει πολύ με το

in vivo

κατάσταση, όπου TNC και FN αλληλεπιδρούν στον όγκο που σχετίζεται με ECM, έχει ήδη περιγραφεί για γλοιοβλαστώματος και τα κύτταρα καρκινώματος μαστού [20], [22]. Σε αυτούς τους όγκους, TNC μειώνει την εξάπλωση των κυττάρων σε FN παρεμβαίνει με δεσμευτική FN στην syndecan-4 ιντεγκρίνης συν-υποδοχέα, θέτοντας έτσι σε κίνδυνο εστιακό σχηματισμό ινών επαφή και το στρες [29]. Δεδομένου ότι η αποδοτικότητα δέσμευσης υποστρώματος του FN δεν επηρεάστηκε από TNC στη μελέτη μας, όπως αξιολογείται με ELISA, ένας παρόμοιος μηχανισμός του ανταγωνισμού για τους υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας μπορεί να υποτεθεί σε PDAC κύτταρα. Λόγω αυτής της επίδρασης, η ενεργοποίηση των παξιλλίνη και κινάση εστιακής προσκόλλησης (FAK) και, κατά συνέπεια, ακτίνη ινών στρες και το εστιακό του σχηματισμού επαφής, καθώς και την πλήρη εξάπλωση των κυττάρων αναστέλλεται, με συνολική ενίσχυση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων [22]. Ασθενής σύνδεση προς FN συνήθως συσχετίζεται με αυξημένη πολλαπλασιασμό σε πολλά κύτταρα όγκου [32]. Στην πειραματική μας που έχει συσταθεί, δεν παρατηρήσαμε μια αύξηση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων για PANC-1 και SU.86.86 κυττάρων σε ένα μικτό υπόστρωμα του FN και TNC σε σύγκριση με το FN και μόνο, πιθανώς επειδή οι επιπτώσεις της TNC για πρόσφυση περιορίστηκαν σε σύντομους χρόνους (3 ώρες) και το συγκρότημα εστίασης πρόσφυση στις FN-προσκολλημένα κύτταρα ήταν μόνο ελαφρώς αλλαγμένη από TNC, όπως παρατηρείται με ανοσοφθορισμό. Αυτές οι παρατηρήσεις υποδεικνύουν ότι οι μηχανισμοί με τους οποίους TNC επηρεάζει την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό σε ένα υπόστρωμα FN δεν γενικά, αλλά εξαρτάται αυστηρά από την ειδική κυτταρική σειρά και για την πειραματική διάταξη που χρησιμοποιήθηκε.

Είναι γνωστό ότι η ικανότητα των καρκινικών κυττάρων να αλληλεπιδρούν με πρωτεΐνες εξωκυτταρικής μήτρας, όπως FN, είναι ζωτικής σημασίας για την κυτταρική εισβολή και τη μετανάστευση. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι ο αριθμός των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων που προσκολλώνται στην FN σε σύντομους χρόνους μειώνεται με την παρουσία του TNC αλλά εξακολουθεί να είναι υψηλός και στο εύρος του αριθμού των κυττάρων ακολουθώντας TNC μόνο. TNC μπορεί επομένως να λειτουργήσει ως ρυθμιστής της πρώιμης μεταναστευτικών γεγονότων, τα οποία περιλαμβάνουν αισθητήρες υπόστρωμα και πρόσφυση, και μπορεί να προάγει κυτταρική μετανάστευση μέσω της μείωσης των κυττάρων συγκολλητικότητα προς FN, έτσι επάγει μια πιο δυναμική αλληλεπίδραση μεταξύ του κυττάρου όγκου και τα συστατικά του ECM. Απαιτείται περαιτέρω εργασία για να καταλάβουμε πώς TNC επηρεάζει τη διαδικασία συγκόλλησης κατά τη διάρκεια του παγκρέατος αλληλεπίδραση των καρκινικών κυττάρων με FN, οι οποίες εμπλέκονται υποδοχείς των κυττάρων και ποιες πρόσθετες ενδοκυττάριων οδών μπορεί να μεταβληθεί.

Εν κατακλείδι, τα παρόντα δεδομένα δείχνουν ότι TNC επηρεάζει ανάπτυξη, την κινητικότητα και την προσκόλληση των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος, αυτά τα αποτελέσματα είναι αποκλίνουσες, ανάλογα με τη διαφοροποίηση των κυττάρων και για τη σύνθεση της εξωκυττάριας μήτρας. Θεραπευτικές στρατηγικές που αποσκοπούν στη διατάραξη της TNC πλούσια σε μήτρα μπορεί να είναι ως εκ τούτου χρήσιμες σε αντίθεση με την εξαιρετική επιθετικότητα των PDAC.

Υλικά και Μέθοδοι

Συντήρηση των κυτταρικών σειρών

παγκρεατικά κύτταρα της γραμμές Capan-1, AsPC-1, PANC-1, ΜΙΑ PaCa-2 και SU.86.86 [18], [19], [33] (American Type Culture Collection, ATCC) διατηρήθηκαν σε μέσα DMEM με υψηλή συγκέντρωση γλυκόζης που περιείχε 10% εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) και 1 Χ πενικιλλίνη /Streptomicine (Invitrogen, Carlsbad, CA) στους 37 ° C σε humified ατμόσφαιρα με 5% CO2. Τα κύτταρα ελέγχθηκαν για μόλυνση μυκοπλάσματος με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (TAKARA, Shiga, Japan).

Παραγωγή σταθερών κλώνων που υπερεκφράζουν TNC

Το πλασμίδιο TNC-L, στον οποίο το μεγάλο, μη ματισμένου ισομορφή TNC είναι κλωνοποιημένο σε έναν φορέα pCMV-Script (Stratagene, La Jolla, CA, USA), ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr. JH Pringle (Τμήμα του Καρκίνου Σπουδών & amp? Μοριακής Ιατρικής, Πανεπιστήμιο του Leicester της Ιατρικής Σχολής, Ηνωμένο Βασίλειο) [34 ]. Η πλήρης TNC-L κωδικοποιητική αλληλουχία ελέγχθηκε με ανάλυση αλληλουχίας. Στη συνέχεια, το πλασμίδιο TNC-L και ο κενός φορέας pCMV-Script πρώτα γραμμικοποιείται με το ένζυμο περιορισμού APA-L1 και διαμολύνονται μετά σε καρκινικά κύτταρα PANC-1 χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο FuGENE διαμόλυνσης (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Μετά από 2 ημέρες, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επιλογή G418 σε συγκέντρωση 1 mg /ml. Μετά από 2 εβδομάδες σε παρουσία G418, διάφορες αποικίες παρατηρήθηκαν και ενισχύονται. Οι αποικίες ελέγχθηκαν για την παρουσία του γονιδίου επιμολύνθηκαν με δοκιμασία PCR χρησιμοποιώντας τους εκκινητές 5-CGTGTACGGTGGGAGGTCTA-3 (επί pCMV-Script) και 5-GACACCAGGTTCTCCAGCTC-3 (στο γονίδιο TNC). Η ικανότητα του PCR-θετικών αποικιών να εκκρίνουν TNC επιβεβαιώθηκε με κηλίδωση Western. Οι θετικοί κλώνοι PANC-T2, PANC-Τ24, PANC-T27 και ο έλεγχος (mock επιμολυσμένων) Οι κλώνοι PANC-C21, PANC-C23, PANC-C27 επιλέχθηκαν για τα ακόλουθα πειράματα.

TNC και επίστρωση FN

TNC αγοράστηκε από την Millipore (Millipore GmbH, Schwalbach, Γερμανία) και FN από Biochrom (Βερολίνο, Γερμανία). Για πλάκες 96-φρεατίων (βιωσιμότητα και προσκόλληση), επικάλυψη εκτελέστηκε με TNC σε μια τελική συγκέντρωση 1 μg /cm2. Για πλάκες 24 φρεατίων (επούλωσης πληγών δοκιμασίες) συγκεντρώσεις TNC του 0,1 μg /cm2, 0,5 μg /cm2 και 2,5 μg /cm2 χρησιμοποιήθηκαν. Για 6-φρεατίων (ανοσοστύπωση) σε συγκέντρωση 0,5 μg /cm2 χρησιμοποιήθηκε. επικάλυψη FN εκτελέστηκε με μια τελική συγκέντρωση 2 μg /cm2 για πλάκες 96-φρεατίων και 1 μg /cm2 για πλάκες 24- και 6-φρεατίων. πρωτεΐνες Coating αφέθηκαν να προσροφάται επί μία νύκτα στους 4 ° C, τα φρεάτια στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS για την απομάκρυνση μη δεσμευμένων πρωτεϊνών και αποκλείστηκαν για 30 λεπτά στους 37 ° C με την προσθήκη 0,2% θερμο-μετουσιωμένο (85 ° C για 12 λεπτά) BSA σε PBS. Οι πλάκες τελικά πλύθηκαν δύο φορές με αποστειρωμένο PBS και αποστειρώνονται με έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία επί 20 λεπτά.