Αφηρημένο

Η αποφυγή της απόπτωσης εμπλέκεται σχεδόν σε όλες τις πτυχές της εξέλιξης του καρκίνου, καθώς και η αντίσταση της θεραπείας. Σε αυτή τη μελέτη, η αντίσταση στην απόπτωση προσδιορίστηκε σε ογκογόνα επιθηλιακά πνεύμονα (Α549) κύτταρα, ως συνέπεια των ελαττωμάτων στη μιτοχονδριακή και αυτοφαγικά λειτουργία. Μιτοχονδριακή λειτουργία καθορίζεται εν μέρει από μιτοχονδριακή μορφολογία, μια διαδικασία που ρυθμίζεται από μιτοχονδριακό δυναμική την οποία η ένωση των δύο μιτοχόνδρια, σύντηξη, αναστέλλει την απόπτωση ενώ σχάση, η διαίρεση του μιτοχονδρίου, ξεκινά απόπτωση. Μιτοχονδριακή μορφολογία των κυττάρων Α549 εμφανίζεται ένα επίμηκες κύτταρα φαινότυπο-μιμούνται ανεπάρκεια σε μιτοχονδριακή πρωτεΐνη σχάσης, πρωτεΐνη Dynamin σχετίζονται 1 (Drp1). κύτταρα Α549 είχε απομειωθεί Drp1 μιτοχονδριακό πρόσληψη και μειωμένη Drp1-εξαρτώμενη σχάσης. Κυτοχρώματος απελευθέρωση c και κασπάσης-3 και PARP διάσπαση είχαν απομειωθεί και βασικά και με αποπτωτικά ερεθίσματα σε κύτταρα Α549. Αυξημένη μιτοχονδριακό μάζα παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549, υποδεικνύοντας ελαττώματα mitophagy (μιτοχονδριακή επιλεκτική αυτοφαγία). κύτταρα Α549 είχε μειωθεί LC3-II λιπιδίωση και αναστολή λυσοσωμικών προτείνοντας ελαττώματα αυτοφαγία να συμβεί πριν από την υποβάθμιση λυσοσωμικής. Η ανοσοχρώση υποδεικνύεται μιτοχονδριακή εντοπισμένη LC3 punctae σε Α549 κύτταρα μετά αυξήθηκαν μιτοχονδριακό αποσύζευξη ή με ένα συνδυασμό των μιτοχονδρίων εκπόλωση και έκτοπη έκφραση Drp1. Αυξημένη αναστολή της απόπτωσης σε κύτταρα Α549 συσχετίζεται με παρακωλύουν μιτοχονδριακή σχάση και mitophagy. Προτείνουμε μιτοχονδριακές ανωμαλίες σχάσης συμβάλει στην αποπτωτικών αντίσταση σε κύτταρα Α549

Παράθεση:. Thomas KJ, Jacobson MR (2012) ελαττώματα στο μιτοχονδριακό σχάση πρωτεΐνη Dynamin πρωτεΐνη που σχετίζεται με 1 συνδέονται με αποπτωτικά Αντίστασης και Autophagy σε καρκίνο του πνεύμονα Μοντέλο. PLoS ONE 7 (9): e45319. doi: 10.1371 /journal.pone.0045319

Επιμέλεια: Janine Santos, Πανεπιστήμιο Ιατρικής και Οδοντιατρικής του Νιου Τζέρσεϊ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10, Απρ, 2012? Αποδεκτές: 20, Αυγ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 20 Σεπτεμβρίου, 2012 |

Copyright: © Thomas, Jacobson. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. St. Νοσοκομείο Mary και Περιφερειακό Ιατρικό Κέντρο, Ίδρυμα Νοσοκομείο St Mary του. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι ένα μείζον πρόβλημα δημόσιας υγείας σε όλο τον κόσμο. Οι τρέχουσες στρατηγικές στη θεραπεία του καρκίνου (χημειοθεραπεία και ακτινοθεραπεία) στηρίζονται στην θανάτωση κυττάρων όγκου με μηχανισμούς σε μεγάλο βαθμό σχετίζεται με την ενεργοποίηση της απόπτωσης. Η απόπτωση είναι μια συντηρημένη κυτταρική διεργασία που ελέγχει την φυσιολογική ανάπτυξη και την ομοιόσταση των ιστών με την εξάλειψη των κατεστραμμένων κυττάρων. Η αναστολή της απόπτωσης συμβάλλει στην ογκογόνο μετατροπή φυσιολογικών κυττάρων με την επέκταση βιωσιμότητά τους, ευνοώντας τη συσσώρευση του μετασχηματισμού μεταλλάξεων [1]. Αντοχή σε απόπτωση συνδέεται με αυξημένη επεμβατικές και μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων [2].

Ένα κλασικό χαρακτηριστικό του καρκίνου είναι αποπτωτικά αντίσταση [3]. Πώς τα καρκινικά κύτταρα διαφεύγουν αποπτωτικό κυτταρικό θάνατο είναι προς το παρόν άγνωστη, αλλά αυξάνοντας την ευαισθησία του όγκου στην απόπτωση είναι ένας θεραπευτικός στόχος. Η απουσία αυθόρμητης απόπτωσης και απόπτωση θεραπεία επαγόμενης από μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) υποδηλώνει ότι οι ελλείψεις στην αποπτωτική διεργασία μπορεί να είναι υπεύθυνη για την αντοχή τους σε αντικαρκινική θεραπεία [4]. Οι μεταλλάξεις γονιδίων και αλλοιωμένη έκφραση των ρυθμιστικών αρχών απόπτωση ανιχνεύεται στον καρκίνο του πνεύμονα. Οι διαφορές στην ευαισθησία σε θεραπευτικά μέσα που επάγουν απόπτωση μπορεί να σχετίζεται με την έκφραση των ρυθμιστικών απόπτωσης στον καρκίνο του πνεύμονα. Αντι-αποπτωτικά θεραπεία διαμόρφωσης γίνεται ερευνηθεί εκτενώς [3].

ενδογενής απόπτωση χαρακτηρίζεται από διαπερατοποίηση των μιτοχονδρίων, η απελευθέρωση του κυτοχρώματος c, και ενεργοποίηση του καταρράκτη κασπάσης [5]. Μιτοχονδριακή έλεγχος της απόπτωσης λαμβάνει χώρα ανάντι ενεργοποίηση της κασπάσης και διαμεσολαβείται από την Bcl-2 οικογένεια πρωτεϊνών [5]. πρωτεΐνες Bcl-2 επηρεάζουν επίσης μιτοχονδριακή δυναμική, μια διαδικασία που εξισορροπεί μιτοχονδριακή σχάση και σύντηξη γεγονότα για να ρυθμίσει το σχήμα, τη δομή και τη λειτουργία του μιτοχονδρίου [5]. Τα μιτοχόνδρια είναι δυναμικές οργανίδια όπου το σχήμα τους αντιστοιχεί στην μεταβολική κατάσταση [6], απαιτείται η υγεία του κυττάρου [7] και η ισορροπία μεταξύ της σύντηξης και σχάσης για ομοιόσταση. Κανονικά, μιτοχονδριακή σχάση μεσολαβητής Drp1 θραύσματα μιτοχόνδρια [5]. Drp1 είναι ένα μεγάλο ΟΤΡάσης που ελέγχει tubulation μεμβράνη και σχάση σε κύτταρα θηλαστικών [5]. Τα κύτταρα που υποβάλλονται σε μιτοχονδριακό σχάσης θα έχει βραχύτερο μήκος μιτοχονδριακών όταν συγκρίνονται με κύτταρα που υφίστανται μιτοχονδριακή [8] ​​σύντηξης. Παρά το γεγονός ότι αυτά τα γεγονότα είναι παροδικές, κύτταρα ανεπαρκή σε μία μιτοχονδριακή πρωτεΐνη δυναμική ή υπό ερεθίσματα θα διατηρήσει εξαρτώμενη από την κατάσταση μιτοχονδριακή μορφολογία τους [6]. Υπερβολική μιτοχονδριακή σχάση (κατακερματισμός) είναι απαραίτητη για την εγγενή απόπτωση είναι απαραίτητο για την απελευθέρωση κυτοχρώματος c και επακόλουθη ενεργοποίηση της κασπάσης [5].

Αναστολή της Drp1 εξαρτώμενη βλάπτει μιτοχονδριακή σχάση και μερικώς αναστέλλει την απόπτωση εγγενείς [7]. Ταυτόχρονη με μιτοχονδριακή διαπερατοποίηση μεμβράνης κατά τη διάρκεια της απόπτωσης, Drp1 σχηματίζει ολιγομερή και στρατολογείται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη να μεσολαβήσει σχάσης σε GTP-εξαρτώμενο τρόπο. [5] γεγονότα σχάσης διαμεσολαβούν την απόπτωση με τη ρύθμιση της απελευθέρωσης των προ-αποπτωτικών παραγόντων στο κυτοσόλιο. Η αναστολή της Drp1 αποτρέπει την απελευθέρωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης δυναμικό κατάρρευσης και κυτόχρωμα c, και προωθεί επιμήκη μιτοχονδριακής μορφολογικά φαινοτύπους [5]. Αναστολή της μιτοχονδριακής σχάσης απαγορεύει κυτοχρώματος ο μετατόπιση και οι καθυστερήσεις κυτταρικό θάνατο, παρέχοντας έτσι μια σύνδεση μεταξύ μιτοχονδριακή δυναμική και την επαγωγή απόπτωσης.

μιτοχονδριακού δυναμική όχι μόνο να επηρεάσει εγγενή απόπτωση, αλλά και ανακατευθύνει αποικοδόμηση αυτοφαγικά. Υπάρχει εκτεταμένη cross-talk μεταξύ mitophagy και την απόπτωση [9]. Αναστολή της μεσολαβητών σχάσης όπως πρωτεΐνη Dynamin σχετίζονται 1 (Drp1), η οποία εξασθενεί την εγγενή απόπτωση [10], έχει αποδειχθεί ότι μειώνουν mitophagy [11]. Προς τα κάτω ρύθμιση της αυτοφαγία κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου έχει παρατηρηθεί σε πολλές μελέτες [12]. Αυξημένη ογκογονικότητα έχει δειχθεί ότι μειώνουν αποικοδόμηση πρωτεΐνης στα επιθηλιακά κύτταρα του πνεύμονα [13]. Η αρνητικός ρυθμιστής της αυτοφαγία, mTOR (στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά), συχνά ενεργοποιείται [14] και οι αναστολείς mTOR δειχθεί για τον περιορισμό του πολλαπλασιασμού του όγκου σε μοντέλα NSCLC [15].

Η αντίσταση στην απόπτωση συνδέεται με μιτοχόνδρια και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην μιτοχονδριακή δυναμική. Ωστόσο, παραμένει άγνωστο αν τα καρκινικά κύτταρα να αποκτήσουν αντίσταση στην απόπτωση μεταβάλλοντας το μιτοχονδριακό δυναμική. Σε αυτή τη μελέτη, η οποία χαρακτηρίζεται μιτοχονδριακή δυναμική και της κατάντη διαδικασίας απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα. Οι διαφορές στη μιτοχονδριακή μορφολογία και λειτουργία παρατηρήθηκαν σε κύτταρα Α549. Παρέχουμε αποδεικτικά στοιχεία στα κύτταρα του καρκίνου του πνεύμονα που υποδηλώνει μια ανισορροπία στο μιτοχονδριακό δυναμική υπάρχει, σύμφωνα με την οποία ελαττώματα Drp1 εξαρτώμενη μιτοχονδριακή σχάση αναστέλλουν την κατάντη διαδικασία αυτοφαγία και να συμβάλει στην αποπτωτική αντίσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και πλασμίδια

κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την ATCC (Πίνακας Ι) καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]. απεικόνιση ζωντανών κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε άνευ ερυθρού φαινόλης (PRF) OptiMEM (Invitrogen). Πλασμίδια [16] για το μιτοχονδριακό YFP (Mito-YFP, Clontech), Drp1-YFP [17], Drp1-myc [18], Drp1 K38A-myc [18], και Drp1 RNAi [19] ήταν δώρα από τον Dr. Richard Υουΐε (NINDS, Bethesda, MD) και επιμολύνθηκαν σε κύτταρα χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Plated κύτταρα (10

4 κύτταρα /φρεάτιο) σπάρθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε πλήρες OptiMEM για 24 ώρες στους 37 ° C, πριν από τη θεραπεία και η ένταση φθορισμού ανάγνωσης. θεραπεία Κύτταρα περιλαμβάνονται: Η επώαση με 1 μΜ σταυροσπορίνη (STS, Sigma) και /ή 50 μΜ-ίτηκ (Sigma) για 3 ώρες σε PRF OptiMEM χωρίς ορό σε αποπτωτικά δοκιμασίες. Τα κύτταρα στερήθηκαν τροφής χρησιμοποιώντας EBSS (Invitrogen) και /ή σε επεξεργασία με 10 ηΜ βαφιλομυκίνη Α1 (Sigma) για 24 ώρες σε δοκιμασίες αυτοφαγία.

Η

Ανάλυση του μιτοχονδριακού Μορφολογία και Συνδεσιμότητα

μιτοχονδριακού μορφολογία αναλύθηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως [16] χρησιμοποιώντας την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο συνεστιακό (CARV περιστρεφόμενο δίσκο, DMI 6000B, Leica) και το λογισμικό MetaMorph. ανάλυση μιτοχονδριακού μήκος διεξήχθη στις εικόνες χρησιμοποιώντας ImageJ μετά την επεξεργασία για να βρείτε τα άκρα. Το μέσο μήκος των μιτοχονδρίων προσδιορίστηκε μετά τη χρήση του ελεύθερου εργαλείο επιλογής γραμμής για να μετρήσει το μήκος (μικρόμετρα) μεμονωμένων μιτοχονδρίων που λαμβάνονται σε ένα τυχαία επιλεγμένο πεδίο από 100 × 100 pixels και 10-15 κύτταρα ανά κυτταρική σειρά εξετάστηκαν. Σχετικά μεταδεδομένα είχαν εμφανιστεί και η κλίμακα της εικόνας (Απόσταση σε εικονοστοιχεία: 1? Γνωστή Απόσταση: Αξία από Μεταδεδομένα? Pixel Αναλογία: 1? Μονάδα Μήκος: μικρόμετρα? Παγκόσμια: ελέγχεται) ορίστηκε για την ανάλυση της εικόνας της συνέπειας. Παροδική επιμόλυνση και κυτταρικό Drp1 RNAi knockdown πειράματα εκτελέστηκαν όπως περιγράφεται [16]. Μιτοχονδριακή απεικόνισης με 0,5 μg επιμολυσμένα Mito-YFP ή Mito-DsRED, οι εκτιμήσεις των μιτοχονδρίων μήκος και το μιτοχονδριακό δοκιμασίες FRAP έχει περιγραφεί [16], [20].

Κινητά απεικόνισης και φθορομετρία

μιτοχονδριακό μάζα εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλακός φθορισμού μετά από χρώση των κυττάρων με 200 ηΜ Mitotracker Πράσινο για 30 λεπτά στους 37 ° C, και πλύση άπαξ με PRF-OptiMEM [21]. Μετρήσεις Η ένταση φθορισμού που αναφέρθηκαν είναι φόντο αφαιρούνται (495/515 nm).

δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης εκτιμήθηκε σε μία πλάκα 96 φρεατίων χρησιμοποιώντας αναγνώστη φθορισμού πλάκας (Tecan). Τα κύτταρα (10

4 ανά φρεάτιο) φορτώθηκαν με 10 ηΜ TMRE για 30 λεπτά στους 37 ° C σε κανονικό μέσο ανάπτυξης. Το μέσο φόρτωσης TMRE απομακρύνθηκε και οι καλλιέργειες τοποθετήθηκαν σε άνευ ερυθρού φαινόλης, άνευ ορού μέσο και επωάστηκαν για επιπλέον 15 λεπτά για να επιτραπεί για το σήμα φθορισμού TMRE να φθάσει σταθερή κατάσταση. Η ένταση φθορισμού στη συνέχεια σταματούν 1 /min για 5 λεπτά για να δημιουργηθεί μία γραμμή βάσης. Μετά από 5 λεπτά, προστέθηκαν 6 ολιγομυκίνη μΜ (Cell Signaling) για να προκληθεί υπερπόλωση του Δψ

m. Με την παρουσία του ολιγομυκίνη, 10 μΜ CCCP προστέθηκε στα 18 λεπτά με τα κύτταρα για να προκαλέσει αποπόλωση της ΔΨ

m. έκφραση TMRE παρίσταται ως σχετική αναλογία ΔF /F

0 που δείχνει σημαίνουν και SEM, όπου F δείχνει την ένταση φθορισμού και F

0 υποδηλώνει αρχικές τιμές πριν την διέγερση. Όλες οι κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν εμφανίζεται ολιγομυκίνη προκαλούμενη υπερπόλωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. εντάσεις φθορισμού Οι φόντο αφαιρούνται (554/576 nm).

Mitophagy μετρήθηκε χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία για τον εντοπισμό συνεντόπισης του ΜΙΤΟ-YFP επιμολυσμένη θετικά κύτταρα με ανοσοχρώση έναντι ποντικού μονοκλωνικό αντι-LC3B (Novus Biologicals) με AlexaFluor® 594 δευτερογενές αντίσωμα IgG αντι-ποντικού (Invitrogen). Κύτταρα (5 × 10

4 ανά φρεάτιο) διαμολύνθηκαν σε εναιώρημα με 0,5 μg ΜΙΤΟ-YFP χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen) και σπάρθηκαν επί θαλάμους βοριοπυριτικό γυαλί LabTekII (Nunc) για 24 ώρες. Μετά τη σταθεροποίηση με παραφορμαλδεΰδη 4%, τα κύτταρα ανοσοχρώση με πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού αντι-LC3B (Novus Biologicals) και οπτικοποιήθηκαν με AlexaFluor® 594 κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (590/617 nm). μετρήθηκε ο αριθμός των διακριτών μιτοχονδρίων εντοπίζεται LC3 θετικά punctae ανά κύτταρο. σχηματισμό Autophagosome σημειώθηκε από LC3 punctae.

Όλες οι μετρήσεις φθορισμού έχουν σχετικές μονάδες φθορισμού (RFU).

ELISA, φωσφοπρωτεΐνη Καθαρισμός και κηλίδωση Western

Γενικές μέθοδοι για western αποτύπωση και υποκυτταρική κλασματοποίηση έχουν περιγραφεί [20]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν: Sigma (β-ακτίνη, GAPDH), Cell Signaling (κασπάση-3, HSP60, HTRA2, PARP), BD Translabs (Drp1, ρ53, TIM23), Calbiochem (VDAC), Novus (LC3-ΙΙ), Abcam ( vimentin, φιμπρονεκτίνη) και MitoSciences (Mitobiogenesis Δοκιμασία, πολύπλοκο IV υπομονάδα Ι, φραταξίνη). Το αντίσωμα έναντι Drp1 pS637 ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Δρ Craig Blackstone (NINDS, Bethesda, MD). καθαρισμός φωσφοπρωτεΐνη διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16]

Στατιστικά

Οι δοκιμές για την ανάλυση που αναφέρεται στην επεξήγηση του σχήματος και η σημασία συμβολίζεται ως εξής:. ns, δεν είναι σημαντική

P

& gt? 0,05? *

P

& lt? 0,05? **

P

& lt? 0,01? ***

P

& lt?. 0.001

Αποτελέσματα

μιτοχονδριακού Επιμήκυνση σε Α549 κύτταρα

Η μιτοχονδριακή δυσλειτουργία έχει παρατηρηθεί σε πολλούς τύπους καρκίνου κυτταρικές σειρές [22]. Ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας της λειτουργίας των μιτοχονδρίων είναι μιτοχονδριακή μορφολογία. Μιτοχονδριακή μορφολογία εξετάστηκε σε κάθε μια από την κανονική και καρκίνου του πνεύμονα κυτταρικές γραμμές μας (Πίνακας Ι) χρησιμοποιώντας ένα ΜΙΤΟ-YFP για την επισήμανση με φθορισμό μιτοχονδριακή μήτρα των κυττάρων (Σχήμα 1Α). Μιτοχονδριακή μήκος προσδιορίστηκε επίσης για κάθε κυτταρική σειρά (Εικόνα 1Β). παρατηρήθηκαν σαφείς διαφορές στην μορφολογία, συμπεριλαμβανομένου του μήκους των μιτοχονδρίων, μεταξύ των κυτταρικών σειρών πνεύμονα επιθηλιακών που ποικίλουν σε ογκογόνο δυναμικό (Πίνακας Ι) και η σχετική ογκογόνο δυναμικό του κάθε κυτταρική σειρά ελέγχθηκε μετά από την εκτέλεση πειραμάτων κυτταρικής μετανάστευσης (Σχήμα S1) [23] . Η μη και ασθενώς ογκογόνο NL20 και κύτταρα NL20TA είχε μια ετερογενή φαινότυπο αλλά οι ογκογόνο Calu1 και Α549 κύτταρα εμφανίζονται κατά κύριο λόγο την επιμήκη μορφή των μιτοχονδρίων. Μια τάση παρατηρήθηκε οπότε τα μη ογκογόνα κύτταρα (NL20) είχαν τη μικρότερη μέση μιτοχονδριακό μήκος (μέση τιμή ± SEM? 5.2 ± 0.4 μm) και η μεγαλύτερη μέση μιτοχονδριακό μήκος παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549 (μέση ± SEM? 8.0 ± 0.8 μm) (Σχήμα 1).

(Α) Εκπρόσωπος έκφραση Mito-YFP στα κύτταρα. Αριθμημένα κουτιά (1-4) είναι μεγεθύνσεις (10 ×) των αντίστοιχων αριθμημένα κουτιά περιοχές στις αρχικές εικόνες της NL20, NL20TA, Calu1 και Α549. μπαρ κλίμακα είναι 2 μm. (Β) Μέση μιτοχονδριακή μήκος (άξονας γ? ± SEM) μετρήσεις (n = 35-50) από τρία ανεξάρτητα πειράματα για NL20, NL20TA, Calu1, και τα κύτταρα Α549. 1-way ANOVA ανάλυσης με Tukey μετα-τεστ (

P

& lt? 0.0001).

Η

Αυξημένη μιτοχονδριακού Μάζα σε Α549 κύτταρα

Το μιτοχονδριακό μάζα υπολογίστηκε στα ζώντα κύτταρα χρησιμοποιώντας Mitotracker Πράσινη FM, η οποία συσσωρεύεται στα μιτοχόνδρια, ανεξάρτητα του μιτοχονδριακού δυναμικού μεμβράνης [24]. Μετά την κανονικοποίηση για τον όγκο των κυττάρων, παρατηρήθηκε ότι τα κύτταρα Α549 είχε αυξηθεί μιτοχονδριακό μάζα σε σύγκριση με τις άλλες κυτταρικές σειρές πνευμονικού επιθηλίου (Εικόνα 2Α). Για την επικύρωση περαιτέρω αυτή τη σχέση, την έκφραση ενός μιτοχονδριακού κωδικοποιούμενης πρωτεΐνης, μιτοχονδριακό σύμπλοκο IV υπομονάδα Ι (το τερματικό ένζυμο της αναπνευστικής αλυσίδας) συγκρίθηκε με την πυρηνική κωδικοποιείται μιτοχονδριακές πρωτεΐνες που συνδέονται, TIM23 (μεταθετάσης της εσωτερικής μιτοχονδριακής μεμβράνης 23) και φραταξίνη με δύο ανεξάρτητες μεθόδους, ανοσοστύπωμα και ELISA (Σχήμα 2Β, D? αντίστοιχα). Κύτταρα Α549 είχε αυξημένα επίπεδα πρωτεΐνης συμπλόκου IV υπομονάδα Ι, σε σύγκριση με τα κύτταρα NL20 (Σχήμα 2Β-Ε). Η επιλεκτική συσσώρευση των μιτοχονδρίων στα κύτταρα Α549 δεν μιμήθηκε από άλλα οργανίδια κατά την ανάλυση της πρωτεϊνικής έκφρασης (ER, καλνεξίνη? Golgi, syntaxin 6? Κυτοσόλιο, GAPDH) με κηλίδα western (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, δείκτες μιτοχονδριακή βιογένεση TFAM (παράγοντας μεταγραφής μιτοχονδριακή Α) και PGC1α (ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα γάμμα συνενεργοποιητή-1 άλφα) εξετάστηκαν για να διερευνήσει περαιτέρω μιτοχονδριακή μάζα στις κυτταρικές γραμμές. Η εξέταση αυτών των δεικτών σε επίπεδο γονιδιακής έκφρασης δεν υποδηλώνει ότι οι αυξήσεις στο μιτοχονδριακό μάζα που παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549 που αποδίδεται στην αυξημένη μιτοχονδριακή βιογένεση. διαφορές αλλαγή γονίδιο φορές η έκφραση δεν ήταν σημαντική και στις δύο αξιολογήσεις γονίδιο (

TFAM

,

P

& lt? 0,142?

PGC1α

,

P

& lt? 0,119 ) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν κύτταρα Α549 αυξήθηκαν μιτοχονδριακό μάζα

(Α) Mitotracker πράσινο φθορισμό σχετικές μονάδες φθορισμού (άξονας γ, RFU) αντιπροσωπεύει μιτοχονδριακή μάζα (μέση και SEM).? μετρήσεις (n = 8 κοιλότητες) από τρία ανεξάρτητα πειράματα. 1-way ANOVA ανάλυσης με Tukey μετα-τεστ (

P

& lt? 0,0001). (Β) Αντιπροσωπευτική ανοσοστυπώματα καταδεικνύει έκφραση ενδογενών πρωτεϊνών συμπλόκου IV υπομονάδα Ι, TIM23, φραταξίνη, και VDAC σε NL20 (λωρίδα 1), NL20TA (λωρίδα 2), Calu1 (λωρίδα 3), και Α549 (διαδρομή 4) κύτταρα. β-ακτίνης παρουσιάζεται για φόρτωση. Μαρκαδόροι σε kilodaltons (kDa). (Γ) Τα ανοσοστυπώματα από δύο ανεξάρτητα πειράματα ποσοτικοποιήθηκαν να εμφανίζονται σχετικά πολύπλοκες IV υπομονάδας έκφρασης Ι πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε ως προς TIM23. Σημαίνει και SEM φαίνεται. 1-way ANOVA ανάλυση με Tukey μετα-τεστ σε σύγκριση με NL20. (Δ) Εκπρόσωπος μιτοχονδριακή βιογένεση δείκτη στάθμης δοκιμασία ELISA που δείχνει φραταξίνη και πολύπλοκη έκφραση IV. (Ε) Τρεις ανεξάρτητες δοκιμασίες ELISA μιτοχονδριακή βιογένεση ήταν ποσοτικά για να δείξει σχετική μιτοχονδριακό-κωδικοποιημένη έκφραση της πρωτεΐνης συγκρότημα IV ρυθμίζεται σύμφωνα με την πρωτεΐνη πυρηνικής κωδικοποιείται φραταξίνη. Σημαίνει και SEM φαίνεται. 1-way ANOVA ανάλυση με Tukey μετα-τεστ σε σύγκριση με NL20.

Η

Αντοχή στην CCCP επαγόμενη μιτοχονδριακού αποπόλωσης σε Α549 κύτταρα

μιτοχονδριακού αποσύνδεση από CCCP (καρβονυλ κυανιούχο m-χλωρο φαινυλ υδραζόνη) διασπά το δυναμικό μιτοχονδριακής μεμβράνης (Δψ

m) και μιτοχονδριακή βαθμίδα ρΗ (ΔpH

m) [20]. έκφραση TMRE παρίσταται ως σχετική αναλογία, ΔF /F

0, όπου F δεικνύει ένταση φθορισμού και F

0 δείχνει τις αρχικές τιμές πριν από τη διέγερση. Όλες οι κυτταρικές σειρές που αναλύθηκαν εμφανίζεται ολιγομυκίνη προκαλούμενη υπερπόλωση του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης. Με την παρουσία του ολιγομυκίνη, 10 μΜ CCCP συνέχεια προστέθηκε στα κύτταρα για να προκαλέσει αποπόλωση της Δψ

m.

Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι Α549 κυτταρικές γραμμές δεν αποπόλωση στο επίπεδο των άλλων κυτταρικών σειρών μετά τη θεραπεία CCCP. Σημαντικές διαφορές (Ρ & lt? 0,001? 2-way ANOVA) σε ΔF /F παρατηρούνται

0 από 23-30 λεπτά (& gt? 4 min μετά από την προσθήκη CCCP) μεταξύ Α549 και τις άλλες κυτταρικές γραμμές. Αυτό υποδηλώνει ότι οι εξαιρετικά ογκογόνα κύτταρα Α549 εμφανίσει μια αντίσταση στην μιτοχονδριακή αποπόλωση της μεμβράνης (Σχήμα 3). Χρώσης

TMRE από δύο ανεξάρτητα πειράματα (η = 8). έκφραση TMRE παρίσταται ως σχετική αναλογία ΔF /F

0 που δείχνει σημαίνουν και SEM, όπου F δείχνει την ένταση φθορισμού και F

0 υποδηλώνει αρχικές τιμές πριν την διέγερση μετά από την αφαίρεση του υποβάθρου. Οι κυτταρικές σειρές NL20 (μπλε), NL20 (πορτοκαλί), Calu1 (pink1) και Α549 (πράσινο) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ολιγομυκίνη (6 μΜ? 0 λεπτά) και CCCP (10 μΜ? 18 λεπτά) για να προκληθεί υπερπόλωση και αποπόλωση, αντίστοιχα. 2-way ANOVA ανάλυση με Bonferroni μετα-τεστ.

Η

Όπως καρκινικές κυτταρικές σειρές έχουν προηγουμένως δειχθεί να επηρεάζεται από πολλαπλά φάρμακα μεταφορείς αντίστασης (MDR), τα κύτταρα προ-επεξεργασία με 50 μΜ βεραπαμίλη να εμποδίσει δραστηριότητα MDR κατά τη διάρκεια TMRE φόρτωσης για να καθορίσει εάν MDR πρωτεϊνών στη μεμβράνη του πλάσματος είχε μια επίδραση στην εισροή TMRE. Μετά ολιγομυκίνης /θεραπεία CCCP από κύτταρα κατεργασμένα βεραπαμίλη, MDR δεν επηρεάζει την ενδοκυτταρική συσσώρευση TMRE σε σύγκριση με κύτταρα κατεργασμένα μη-βεραπαμίλη (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα)? καθώς αυτό φθορίζον υπόστρωμα ροδαμίνης δεν συσσωρεύεται σε ανθεκτικά κύτταρα φάρμακο. Σε αυτή τη μελέτη, τα κύτταρα Α549 είχαν λιγότερη αλλαγή στην Δψ

m όπως μετράται με φθορισμό TMRE μετά από θεραπεία CCCP και δραστηριότητα MDR δεν επηρεάζει αυτή τη δραστηριότητα. Τα δεδομένα αυτά συμφωνούν με άλλες αναφορές που δείχνουν τα καρκινικά κύτταρα επιδεικνύουν αντοχή σε αποπόλωση της μιτοχονδριακής μεμβράνης [25].

Μειωμένη Drp1 εξαρτώμενη από σχάση στο Α549 κύτταρα

μιτοχονδριακού εκπόλωση και σχάση αποτελούν προϋπόθεση για την εγγενή απόπτωση [5]. Με την αύξηση των μιτοχονδρίων μήκος, υποθέσαμε ότι τα κύτταρα Α549 θα έχουν μειωθεί μιτοχονδριακή σχάση, η οποία θα μειώσει τόσο αποπτωτικών έναρξη και την κατάντη καταβολική διαδικασία της αυτοφαγία.

Drp1 και ανταγωνιστές μιτοχονδριακή σύντηξη της OPA1 (οπτική ατροφία 1), Bax /Bak και Mfn1 /2 (Mitofusin 1/2), εν μέρει, ρυθμίζουν το σχήμα, τη δομή και τη λειτουργία των μιτοχονδρίων από μιτοχονδριακές δυναμική [8]. Εξέταση της μιτοχονδριακής μορφολογίας (Σχήμα 1Α? Εικόνα 4Α, βασικοκυτταρικό) δείχνει κυρίως επιμήκη μιτοχόνδρια σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 4Α2: μιτοχονδριακό μήκος, σημαίνουν ± SEM? 8.3 ± 0.8 μm). Αυτός ο φαινότυπος δείχνει ελαττώματα σχάσης ή μια προς τα πάνω ρύθμιση της σύντηξης. Σταθερή κατάσταση επίπεδα Drp1 πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ανοσοστύπωμα (Σχήμα 4Β, C). κύτταρα Ποσοτική ανάλυση δείχνει ότι βασική έκφραση της πρωτεΐνης σε κύτταρα Drp1 Α549 ήταν το πολύ 44% που παρατηρήθηκε σε κύτταρα NL20 (Εικόνα 4D).

(Α) Μιτοχονδριακή μορφολογία του NL20 (αριστερά) και Α549 (δεξιά) μετά Mito -DsRED επιμόλυνση. Εκπρόσωπος εικόνες που εμφανίζονται: βασικοκυτταρικό (επάνω) και μετά από Drp1 RNAi (μεσαία) ή Drp1-YFP επιμόλυνση (κάτω). Η γραμμή κλίμακας δείχνει 2 μm. Αριθμημένα κουτιά (1-6) είναι μεγεθύνσεις (10 ×) των αντίστοιχων αριθμημένα κουτιά περιοχές στις αρχικές εικόνες. (Β) Ανοσοστύπωμα ενδογενούς έκφρασης Drp1 πριν (λωρίδες 1,3) και μετά (λωρίδες 2,4) Drp1 RNAi επιμόλυνση σε NL20 και τα κύτταρα Α549. (Γ) Ανοσοστύπωμα ενδογενούς (διαδρομές 1,2? Βέλος) και έκτοπη (διαδρομές 3,4? Κεφαλή βέλους) έκφραση Drp1 πριν και μετά Drp1-YFP επιμόλυνση σε NL20 και τα κύτταρα Α549. (B, C) β-ακτίνης ανιχνεύσει εκ νέου για να δείξει τη φόρτωση? δείκτες σε kDa. (D) Σχετική έκφραση πρωτεΐνης Drp1 ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνη, πριν και μετά Drp1 RNAi επιμόλυνση σε NL20 (λευκή ράβδος) και Α549 (μαύρη μπάρα) κύτταρα (δύο ανεξάρτητα πειράματα). 2-way ANOVA ανάλυση με Bonferroni μετα-τεστ. (Ε) Εκπρόσωπος εικόνες από την ανάλυση FRAP των NL20 (αριστερά) και Α549 (δεξιά) κύτταρα επιμολυσμένα με Mito-YFP. Κύτταρα απεικονίζεται υπό βασικές (κορυφή), Drp1 K38A-myc προς τα κάτω ρύθμιση των Drp1 (μέση) και Drp1-myc υπερέκφραση (κάτω) συνθήκες. Αριθμημένα κουτιά (1-6) είναι μεγεθύνσεις (10 ×) των αντίστοιχων αριθμημένα κουτιά περιοχές στις αρχικές εικόνες. μπαρ κλίμακα είναι 1 μm. (F-Η) Κινητό κλάσμα τιμές Mito-YFP που συμβαίνουν μέσα σε ένα ενιαίο υποκυτταρική περιοχή ενδιαφέροντος (n = 60 κύτταρα). Η μέση και SEM δείχνεται από δύο ανεξάρτητα πειράματα. 1-way ANOVA ανάλυση με Tukey μετα-τεστ. Οι πρόσθετες στατιστικές FRAP φαίνεται στο σχήμα S2.

Η

Για να χειριστούν περαιτέρω μιτοχονδριακή μορφολογία, Drp1 χτυπήθηκε κάτω χρησιμοποιώντας RNAi [16], [19] (Εικόνα 4Α, Β + Drp1 RNAi), η οποία αναμένεται να επιμηκυνθεί μιτοχόνδρια. Μετά Drp1 RNAi μεσολάβηση γκρεμίζω στο NL20 και Α549 κύτταρα, υπήρχε μια ισχυρή μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης Drp1 (Σχήμα 4Β, D). Μιτοχονδριακή μήκος αυξάνεται, όπως αναμένεται, σε κύτταρα NL20 μετά τη θεραπεία Drp1 RNAi (Σχήμα 4Α: μέση ± SEM? Βασική (Α1), 4.9 ± 0.5 μm? Drp1 RNAi (Α3), 7.8 ± 0.6 μm? 1-way ANOVA, Tukey ανάρτηση -test,

P

& lt? 0.001). Το μιτοχονδριακό φαινότυπος μετά τη θεραπεία Drp1 RNAi σε κύτταρα Α549 ήταν πρησμένο και βολβώδη (Σχήμα 4A4)? μια μορφολογία που προκλήθηκε από υπερδιάχυση των μιτοχονδρίων, λόγω της έλλειψης ισορροπίας που συνήθως παρέχεται από σχάση [26]. Για να προσδιοριστεί εάν η μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης Drp1 συμβάλλει στην επιμήκη μιτοχονδριακή φαινότυπο που παρατηρείται κανονικά σε κύτταρα Α549, κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με Drp1-YFP πλασμίδιο για να υπερεκφράζουν πρωτεΐνη σύντηξης Drp1-YFP, η οποία είναι λειτουργικά ικανή να επάγει σχάσης [16]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α (+ Drp1-YFP), Drp1 υπερέκφραση έσωσε το μιτοχονδριακό φαινότυπο σε κύτταρα Α549, μειώνοντας μιτοχονδριακή μήκη με εκείνες που παρατηρούνται σε βασικά κύτταρα NL20 (Σχήμα 4Α: μέση τιμή ± SEM? + Drp1-YFP (Α6), 5,1 ± 0.7 μm? 1-way ANOVA, Tukey post-test,

P

& gt? 0,05). Η μιτοχονδριακή μορφολογία των κυττάρων Α549 μετά από Drp1 υπερέκφραση ομοίως έμοιαζε με εκείνη των βασικών κυττάρων NL20 (Σχήμα 4Α1). Μιτοχονδριακή μήκος σε κύτταρα NL20 (Σχήμα 4Α: μέση τιμή ± SEM? Βασική (Α1), 4.9 ± 0.5 μm) μειώθηκαν επίσης μετά Drp1 υπερέκφραση (Σχήμα 4Α: μέση τιμή ± SEM? + Drp1-YFP (Α5), 2.1 ± 0.3 μm? 1 κατευθύνσεων ANOVA, Tukey post-test,

P

& lt?. 0.001)

Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η ανεπάρκεια των επιπέδων της πρωτεΐνης Drp1 συμβάλλει στη μείωση των μιτοχονδρίων γεγονότα σχάσης σε κύτταρα Α549. FRAP (ανάκτηση φθορισμού μετά από φωτολεύκανση) χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των μιτοχονδρίων συνδεσιμότητα, η οποία συνάγει μιτοχονδριακή γεγονότα σχάσης [16], σε ζωντανά NL20 και Α549 κύτταρα (Σχήμα 4Ε-Η). FRAP καμπύλες συνοψίστηκαν με υπολογισμό της κινητής κλάσμα μιτοχονδριακού κατευθυνόμενης κίτρινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (ΜΙΤΟ-YFP), η οποία υπολογίζει το μιτοχονδριακό συνδεσιμότητα [16]. FRAP πειράματα επιβεβαιώνουν ότι τα κύτταρα Α549 μειώθηκαν μιτοχονδριακή σχάση (Σχήμα 4F-Η). Κινητό τιμές κλάσματος δείχνουν ότι τα μιτοχόνδρια στα κύτταρα NL20 έχουν σημαντικά χαμηλότερη λειτουργική συνδεσιμότητα (πάνω σχάσης) σε σύγκριση με τα κύτταρα Α549 basally (Σχήμα 4F). Προς τα κάτω ρύθμιση των Drp1 με υπερέκφραση μιας κυρίαρχης αρνητικής εκδοχή του Drp1 (Drp1 K38A) εξισορροπημένη την μιτοχονδριακή συνδεσιμότητα μεταξύ των δύο κυτταρικές γραμμές (Σχήμα 4Η). Μετά Drp1 υπερέκφραση (+ Drp1-myc), μιτοχονδριακή σχάση ενισχύεται σε κύτταρα Α549 όπως ότι τα κινητά τιμές κλάσματος είναι πιο συγκρίσιμα με τα βασικά κύτταρα NL20 (Εικόνα S2). Αυτά τα αποτελέσματα FRAP μιμούνται τις μιτοχονδριακές μορφολογικές παρατηρήσεις που δείχνουν μειωμένη Drp1 που εξαρτώνται από τη σχάση σε κύτταρα Α549 σε σύγκριση με τα κύτταρα NL20 και ότι μειωτικά σχάση σε κύτταρα Α549 μπορεί να διασωθεί από την υπερέκφραση του Drp1.

Drp1 Εντοπισμός σε Α549 κύτταρα

Για την περαιτέρω εξετάσει μειώθηκε Drp1 που εξαρτώνται από τη σχάση σε κύτταρα Α549, κοιτάξαμε Drp1 εντοπισμό παρακάτω υποκυτταρική κλασματοποίηση μέσω ανοσοαποτύπωσης. Μιτοχονδριακή και κυτοσολικά κλάσματα εξετάστηκαν για τα επίπεδα της ενδογενούς πρωτεΐνης Drp1 (Σχήμα 5Α, Β). πρωτεΐνη Drp1 δεν παρατηρήθηκε στο μιτοχονδριακό κλάσμα των κυττάρων Α549 που υποδηλώνει ότι Drp1 δεν προσλαμβάνεται ενεργά στα μιτοχόνδρια για σχάση. Σε αντίθεση, τα κύτταρα NL20 έδειξε πρόσληψη Drp1 στο μιτοχονδριακό κλάσμα, το οποίο συνάγει μιτοχονδριακή σχάση συμβαίνει σε κύτταρα NL20, όπως προτείνεται από τις μιτοχονδριακές μορφολογικές αναλύσεις (Σχήμα 1Α, 4Α) και επιβεβαιώθηκε από δεδομένα FRAP (Σχήμα 4F-Η). Σε κύτταρα θηλαστικών, Drp1 στρατολογείται στην εξωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη εξής αποπτωτική επαγωγή [5]. Για να εξετάσουμε αυτό το μετάθεση, Drp1 εντοπισμό οπτικοποιήθηκε με ανοσοαποτύπωση παρακάτω υποκυτταρικό κλάσμα μετά σταυροσπορίνη (STS) θεραπεία. STS είναι ένας αναστολέας της πρωτεϊνικής κινάσης που είναι γνωστό ότι επάγει απόπτωση [27]. Μετά αποπτωτική επαγωγή με STS, πρόσληψης πρωτεϊνών Drp1 από το κυτοσολικό στο μιτοχονδριακό κλάσμα παρατηρήθηκε σε τόσο NL20 και κυττάρων Α549 (Σχήμα 5Β). Από την παρατήρηση αυτή, έχουμε υποθέσει ότι τα κύτταρα Α549 μειώθηκαν Drp1 μιτοχονδριακής πρόσληψης που μπορεί να ενισχυθεί με αποπτωτική διέγερση. Αυτό υποδηλώνει ότι Drp1 μπορούν να προσληφθούν στα μιτοχόνδρια σε κύτταρα Α549 αλλά η διαδικασία του μιτοχονδριακού σχάσης εμποδίζεται σε αυτή την κυτταρική γραμμή.

(Α, Β, Ε) Αντιπρόσωπος ανοσοστυπώματα τριών ανεξάρτητων πειραμάτων (Α) χωρίς θεραπεία , (Β) 1 μΜ STS θεραπεία για 3 ώρες για να επάγει απόπτωση, και (Ε) 1 μΜ STS θεραπεία για 3 ώρες μετά Drp1-myc επιμόλυνση σε NL20 και τα κύτταρα Α549. Η ενδογενής Drp1 και η έκφραση πρωτεΐνης κυτόχρωμα c αξιολογήθηκαν συνολικά (λωρίδες 1,2), μιτοχονδριακή (λωρίδες 3,4) και κυτοσολικού (διαδρομές 5,6) κλάσματα. Μιτοχονδριακή (VDAC), κυτοσόλιο (GAPDH) και β-ακτίνη (συνολικά) περιλαμβάνονται ως κλασματοποίηση και φόρτωση ελέγχους. έκφραση Myc μετά Drp1-myc επιμόλυνσης φαίνεται στο (Ε). Μαρκαδόροι σε kDa. (C, D, F) έκφραση κυτοχρώματος c πρωτεΐνης ομαλοποιήθηκε σε β-ακτίνης σε NL20 (λευκές ράβδοι) και Α549 (μαύρες ράβδοι) κλάσματα κυττάρου υπό μη επεξεργασμένου συνθήκες (C), η θεραπεία 1 μΜ STS για 3 h (D) ή 1 μΜ θεραπεία STS για 3 ώρες με έκτοπη έκφραση της Drp1-myc (F). Η μέση και SEM δείχνεται από δύο ανεξάρτητα πειράματα. 2-way ANOVA ανάλυση με Bonferroni μετα-τεστ. Μιτοχονδριακή μορφολογία υπό αυτές τις συνθήκες φαίνεται στο Σχήμα S3C και S5.

Η

Μειωμένη κυτοχρώματος C Τύπου στο Α549 κύτταρα

Η αναστολή της μιτοχονδριακής σχάση καθυστερεί την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c στο κυτταρόπλασμα [28] ? Ως εκ τούτου, εξετάσαμε το κυτόχρωμα c μετατόπιση σε κύτταρα Α549 (Εικόνα 5, Εικόνα S3). Μιτοχονδριακή και κυτοσολικά κλάσματα εξετάστηκαν για την απελευθέρωση κυτοχρώματος c σε NL20, NL20TA, Calu1 και κυττάρων Α549 με και χωρίς CCCP επαγόμενη αποσύνδεση (Σχήμα S3A, Β). Συγκεκριμένα, Α549, το πιο ογκογόνο κυτταρική γραμμή σε αυτό το πάνελ (Σχήμα S1), εμφανίζεται ανεπάρκεια στην απελευθέρωση κυτοχρώματος c μετά από θεραπεία CCCP (Σχήμα S3b, C). STS-επεξεργασμένα κύτταρα Α549 έδειξε παρόμοια έλλειψη απελευθέρωσης κυτοχρώματος c όταν συγκρίνεται με NL20 κύτταρα (Σχήμα 5Β, Εικόνα S3C). Τα ανοσοστυπώματα ποσοτικοποιήθηκαν για να δείξει το κυτόχρωμα c επίπεδα πρωτεΐνης στα πειράματα κλασμάτωσης χωρίς και με STS-αγωγή (Σχήμα 5C, D). Σύμφωνα με βασική και STS συνθήκες, τα κύτταρα Α549 είχαν αυξημένα επίπεδα του κυτοχρώματος c πρωτεΐνης στο μιτοχονδριακό κλάσμα σε σύγκριση με τα κύτταρα NL20. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν κύτταρα Α549 έχουν μειωθεί Drp1-εξαρτώμενη μιτοχονδριακή σχάση και την κατάντη διαδικασία της απελευθέρωσης του κυτοχρώματος c έχει απομειωθεί. Για την περαιτέρω στήριξη αυτής της ιδέας, η υπερέκφραση του DRP1 σε κύτταρα Α549 διασωθεί STS-θεραπεία κυτοχρώματος προκαλούμενη απελευθέρωση c σε αυτή την κυτταρική γραμμή (Σχήμα 5Ε, F? Σχήμα S3C) αποδεικνύοντας ότι η εξασθενημένη κυτόχρωμα απελευθέρωσης C παρατηρήθηκε σε κύτταρα Α549 οφείλεται σε μια ανεπάρκεια σε Drp1 . Αναμενόμενη μιτοχονδριακή μορφολογικές φαινότυποι παρατηρήθηκαν μετά STS-θεραπεία και σε συνδυασμό με Drp1-myc υπερέκφραση (Σχήμα S5), που υποστηρίζουν τα δεδομένα ανοσοκηλίδος κυτόχρωμα απελευθέρωσης C σε NL20 και κύτταρα Α549.

αποπτωτικά Αντοχή σε Α549 κύτταρα

Από μιτοχονδριακές ανωμαλίες σχάσης καθυστερήσει κυτοχρώματος απελευθέρωση γ [28] και την ενεργοποίηση της κασπάσης [5], εξετάσαμε προς τα κάτω προ-αποπτωτικά γεγονότα που ακολούθησαν την απελευθέρωση του κυτοχρώματος c. Διάσπαση της κασπάσης-3, κύριος μεσολαβητής της απόπτωσης των θηλαστικών [29], παρατηρήθηκε μετά STS- και δοξορουβικίνη-θεραπεία (Σχήμα 6Α, το Σχήμα S4A, C) σε NL20, NL20TA, και τα κύτταρα Calu1. Σε αντίθεση, κασπάσης-3 διάσπασης ήταν απούσα σε απόπτωση διεγερμένα κύτταρα Α549 (Εικόνα 6Α? Σχήμα S4A). διάσπαση PARP, ένας μεταγενέστερος συνιστώσα της απόπτωσης που προκαλείται εν μέρει από την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 [30], εξετάστηκε επίσης παρακάτω αποπτωτική επαγωγή (Σχήμα 6Β, το Σχήμα S4B, D). διάσπαση PARP παρατηρήθηκε σε κύτταρα NL20 εξής αποπτωτικά ερεθίσματα αλλά απουσίαζε από κύτταρα Α549. Η αναστολή της STS-επαγόμενη διάσπαση ΡΑΚΡ σε κύτταρα NL20 παρατηρήθηκε μετά την ταυτόχρονη θεραπεία με-ίτηκ (Σχήμα 6C), ενός γνωστού αναστολέα της κασπάσης, καταδεικνύοντας ότι αυτή είναι μια διαδικασία κασπάσης που προκαλούνται στα κύτταρα NL20. Πλήρης διάσπαση PARP παρατηρήθηκε σε NL20 κύτταρα STS-αγωγή υπερεκφράζουν Drp1 πρωτεΐνη (Σχήμα 6C). STS-θεραπεία διάσπασης που προκαλείται PARP αποκαταστάθηκε στα κύτταρα Α549 που υπερεκφράζουν Drp1 (Σχήμα 6C).