Αφηρημένο

Ιστορικό

Πρόσφατα στοιχεία από το

in vitro

και

in vivo

μελέτες έχει αποδειχθεί ότι η παρεκκλίνουσα επανενεργοποίηση του Sonic Hedgehog (ΕΛΕΡΠΕ) μονοπατιού σηματοδότησης ρυθμίζει γονίδια που προάγουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό σε διάφορα ανθρώπινα καρκινικά βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ). Ως εκ τούτου, οι χημειοθεραπευτικοί παράγοντες που αναστέλλουν την ενεργοποίηση των παραγόντων μεταγραφής Gli έχουν αναδειχθεί ως πολλά υποσχόμενη νέα θεραπευτικά φάρμακα για τον καρκίνο του παγκρέατος. GDC-0449 (Vismodegib), χορηγούνται από το στόμα μόριο που ανήκει στην κατηγορία 2-αρυλοπυριδίνης, αναστέλλει μονοπάτι σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ μπλοκάροντας τις δραστηριότητες της λειανθούν. Οι στόχοι αυτής της μελέτης ήταν να εξετάσει τους μοριακούς μηχανισμούς μέσω των οποίων GDC-0449 ρυθμίζει ανθρώπινου παγκρεατικού χαρακτηριστικά CSC

in vitro

.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

GDC-0499 αναστέλλεται κυτταρικής βιωσιμότητας και επαγόμενη απόπτωση σε τρία παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και τα παγκρεατικά ΚΕΠ. Αυτός ο αναστολέας επίσης κατέστειλε κυτταρική βιωσιμότητα, δεσμευτική Gli-DNA και μεταγραφική δραστηριότητες, και επαγόμενη απόπτωση μέσω της κασπάσης-3 ενεργοποίησης και διάσπαση PARP σε παγκρεατικά ΚΕΠ. GDC-0449-επαγόμενη απόπτωση σε ΚΕΠ έδειξαν αυξημένη έκφραση Fas και μειωμένη έκφραση PDGFRα. Επιπλέον, Bcl-2 ρυθμισμένα προς τα κάτω ενώ TRAIL-R1 /DR4 και έκφραση TRAIL-R2 /DR5 αυξήθηκε μετά την αγωγή του ΚΕΠ με GDC-0449. Καταστολή των δύο Gli1 συν Gli2 με shRNA μιμήθηκε τις αλλαγές στο βιωσιμότητα των κυττάρων, σχηματισμός σφαιροειδές, απόπτωση και γονιδιακή έκφραση παρατηρήθηκε σε GDC-0449-αγωγή παγκρεατικών ΚΕΠ. Έτσι, ενεργοποιούνται γονίδια Gli καταστείλει DRs και Fas εκφράσεις, up-ρυθμίζουν τις εκφράσεις των Bcl-2 και PDGFRα και να διευκολύνει την επιβίωση των κυττάρων.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η GDC-0499 μπορεί να να χρησιμοποιηθεί για την αντιμετώπιση του καρκίνου του παγκρέατος με τη στόχευση του παγκρέατος ΚΕΠ

Παράθεση:. Singh BN, Fu J, Srivastava RK, Shankar S (2011) σκαντζόχοιρος Σηματοδοσίας ανταγωνιστή GDC-0449 (Vismodegib) Αναστέλλει καρκίνο του παγκρέατος Stem χαρακτηριστικά των κυττάρων : Μοριακοί μηχανισμοί. PLoS ONE 6 (11): e27306. doi: 10.1371 /journal.pone.0027306

Επιμέλεια: Arun Ρίσι, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 2 Σεπ, 2011? Αποδεκτές: 13, Οκτώβρη του 2011? Δημοσιεύθηκε: 8 Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Singh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του παγκρέατος (PC) είναι μια ιδιαίτερα θανατηφόρα κακοήθεια. που χαρακτηρίζεται από καθυστερημένη διάγνωση και την αντίσταση της θεραπείας. PC είναι η τέταρτη κύρια αιτία του καρκίνου στις Ηνωμένες Πολιτείες με ένα 5-ετή επιβίωση λιγότερο από 5%. Η χειρουργική εκτομή είναι η μόνη δυνητικά θεραπευτική θεραπευτική επιλογή για τον υπολογιστή? Ωστόσο, λόγω της έλλειψης της συμπτώματα, η συντριπτική πλειοψηφία των ασθενών με μεταστατική νόσο, καθιστώντας κακοήθεια τους ακατάλληλο για χρήση [1], [2]. Το τρέχον πρότυπο-of-care θεραπείας, γεμσιταβίνη, επεκτείνει την επιβίωση των ασθενών με λίγες μόνο εβδομάδες [3]. Η ταυτοποίηση νέων μοριακών στόχων για το PC για να ξεπεραστεί η θλιβερή πρόγνωση είναι συνεπώς αναγκαίο. Οι επαναλαμβανόμενες γενετικές αλλοιώσεις σε καθορισμένες γονίδια σε συνδυασμό με διαταραχές των αναπτυξιακών κυτταρικών μονοπατιών σηματοδότησης έχουν συσχετιστεί με την ανάπτυξη PC και την εξέλιξη. Πρόσφατα στοιχεία από το

in vitro

και

in vivo

μελέτες δείχνουν ότι το Sonic Hedgehog (ΕΛΕΡΠΕ) οδός [4] έκτροπα επανενεργοποιηθεί και αναγνωρίζεται ως ένας από τους μεσολαβητές στην πλειονότητα των προσωπικών υπολογιστών σηματοδότησης? Ως εκ τούτου, ΕΛΕΡΠΕ αποκλεισμός έχει τη δυνατότητα να αποτρέψει την εξέλιξη της νόσου και την μεταστατική εξάπλωση [5].

σηματοδότηση ΕΛΕΡΠΕ ξεκινά με τη δέσμευση της βραχείας δράσης συνδέτη πολυπεπτιδίου δηλαδή Shh (Sonic Hedgehog, ινδική σκαντζόχοιρος ή Desert Hedgehog) για να υποδοχέα, Patched οποία με αυτόν τον τρόπο, μειώνει τις ανασταλτικές επιδράσεις του Patched επί smoothened [6]. Smoothened στη συνέχεια εντοπίζεται στην πρωτογενή cilium του κυττάρου, ένα οργανίδιο που παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στη σηματοδότηση SHH [7]. Εκεί, smoothened ενεργοποιεί μια ενδοκυτταρική καταρράκτη που έχει ως αποτέλεσμα την ενεργοποίηση και την πυρηνική μετατόπιση του Gli παράγοντα μεταγραφής της οικογένειας Gli2 [8]. Gli2 μετατοπίζεται στον πυρήνα και επάγει την μεταγραφή των γονιδίων στόχων ΕΛΕΡΠΕ, όπως Gli1, ένα αξιόπιστο δείκτη της SHH σηματοδότηση [8], [9]. Gli2 είναι ένα κρίσιμο συστατικό της ΕΛΕΡΠΕ σηματοδότησης και απενεργοποίηση της οδηγεί σε αναστολή της ΕΛΕΡΠΕ σηματοδότησης. Αυτοί οι παράγοντες μεταγραφής Gli ενεργοποιήσετε γονίδια στον πυρήνα που προωθούν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, κυτταρική επιβίωση, βλαστική ικανότητα και ο προσδιορισμός των κυττάρων μοίρα σε μια ποικιλία οργάνων [5], [10]. οδός ΕΛΕΡΠΕ είναι ένα μορφογονίδιο που απαιτούνται για τη σωστή διαμόρφωση των προτύπων κατά τη διάρκεια της εμβρυογένεσης? Ωστόσο, η απορρύθμιση της οδού αυτής είναι υπεύθυνος για πολλά ανθρώπινους καρκίνους [8], [10], [11]. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι η Shh σηματοδοτικό μονοπάτι στο επίπεδο των γονιδίων Gli έχει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη φυσιολογικό πάγκρεας και υπάρχουν στοιχεία στερέωσης που απορρυθμισμένης SHH σηματοδότηση διαδραματίζει κάποιο ρόλο στην παγκρεατικού καρκίνου [12]. Επιπλέον, πολλές εκθέσεις δείχνουν ότι ανθρώπινους καρκίνους του παγκρέατος πάνω ρητή Gli γονίδια [13], [14].

παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας Gli έχουν διττή λειτουργία όπως ενεργοποιητή και καταστολέα που ορίζονται εν μέρει μόνο και μπορεί να ανταποκριθεί σε συνδυαστική και συνεργατική δραστηριότητα Gli. Η οικογένεια Gli παίζει κρίσιμο ρόλο στη διαμεσολάβηση και την ερμηνεία της ΕΛΕΡΠΕ σημάτων [15]. SHH γνώμονα καρκίνοι προκύπτουν από μία ποικιλία μεταλλάξεων που επηρεάζουν διαφορετικά συστατικά, συμπεριλαμβανομένων των βασικών πρωτεϊνών μεταγραφικού τελεστές Gli, οδηγεί σε μια ποικιλία ανθρώπινων κακοηθειών περιλαμβανομένων μυελοβλάστωμα, ραβδομυοσάρκωμα, μελάνωμα, καρκίνωμα βασικών κυττάρων, και του μαστού, του πνεύμονα, του ήπατος, του στομάχου, του προστάτη, και του παγκρέατος [16], [17], [18], [19], [20]. Ιδιοσυστατικά, η Shh-Gli σηματοδότηση είναι ενεργή σε καρκινώματα βασικών κυττάρων, μυελοβλαστώματα και καρκίνους του οισοφάγου, λόγω μετάλλαξης στο Patched ή λειαίνονται [21], [22]. Μελανώματα και καρκινώματα του προστάτη έδειξαν περαιτέρω έναν άξονα SHH-Gli σηματοδότηση [23]. Σε γαστρεντερικών καρκίνων, η Shh ενεργοποίηση σηματοδότησης συμβαίνει μέσω μεταγραφικής επάνω ρύθμισης του συνδετήρα SHH [24]. Έχει πρόσφατα προταθεί ότι η Shh σηματοδότηση εξελίσσεται κατά τη διάρκεια της καρκινογένεσης του παχέος εντέρου [25], [26] και σε μεταστατική νόσο [27], ενώ σε φυσιολογικό κολονικό ιστό, η Shh σηματοδότηση εμπλέκεται σε διαφοροποίηση [28]. Πρόσφατα, έχουν γονίδια έχουν προφίλ που ρυθμίζονται προς τα κάτω του Gli1 και Gli2 που εμπλέκονται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου [29], [30], και επιβίωση των κυττάρων (PDGFRα και Bcl-2) [22]. Gli2 εκφράζεται επίσης σε πολλούς καρκινωμάτων των βασικών κυττάρων [31], υποδηλώνοντας ότι αυτά τα γονίδια μπορεί επίσης να εμπλέκονται στην ανάπτυξη του PC, το οποίο θα μπορούσε να είναι συνεπής με μερική δράση του ως μεσολαβητή των σημάτων SHH [32]. Ωστόσο, οι ρόλοι των γονιδίων Gli (Gli1 και Gli2) σε κυτταρικές αποκρίσεις επιβίωσης και κυτταρικού θανάτου ΕΛΕΡΠΕ με γνώμονα παραμένουν ασαφή, και ειδικότερα, το ρόλο τους στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση των παγκρεατικών ΚΕΠ είναι άγνωστη και οι μεταγενέστεροι γονιδίων-στόχων που εμπλέκονται στον καθορισμό του κυττάρου μοίρα.

Μεγάλη προσοχή έχει πρόσφατα επικεντρωθεί στο ρόλο του καρκίνου του βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) /καρκίνος κύτταρα έναρξης (CICs) στην έναρξη και την πρόοδο των στερεών κακοηθειών. ΚΕΠ μπορεί να είναι υπεύθυνη για την έναρξη του όγκου, αυτο-ανανέωση /συντήρηση, τη συσσώρευση μετάλλαξη, και μετάσταση χάρη στην ικανότητά τους να εκφράζουν αντι-αποπτωτική και ανθεκτικά στα φάρμακα πρωτεϊνών, διατηρώντας έτσι την ανάπτυξη του όγκου [33], [34]. Το μονοπάτι σηματοδότησης η Shh είναι ένας ρυθμιστής κλειδί φυσιολογικών διεργασιών κυττάρου που περιλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [35]. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι το σύστημα σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ παίζει καθοριστικό ρόλο και στην CSC βιολογία συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης των ΚΕΠ αυτο-ανανέωση, τη διαφοροποίηση? και ογκογόνο δυναμικό, γεγονός που υποδηλώνει σηματοδότηση SHH θα μπορούσε να είναι ένας ελπιδοφόρος θεραπευτικός στόχος σε υπολογιστές [14]. Ενεργοποίηση σηματοδότηση SHH μπορεί να καταργήσει την αντίσταση των ΚΕΠ στη χημειοθεραπεία και θα μπορούσε να οδηγήσει στην ανάπτυξη νέων θεραπευτικών προσεγγίσεων για την θεραπεία των προσωπικών υπολογιστών.

Για τον εντοπισμό κατάντη στόχοι των γονιδίων Gli που ρυθμίζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση στον καρκίνο του παγκρέατος βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ), χρησιμοποιήσαμε έναν αναστολέα της σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ, GDC-0449 (λειαίνονται αναστολέα), η οποία έχει ταυτοποιηθεί σε μια οθόνη μικρό μόριο που βασίζεται σε κύτταρα για αναστολείς της Gli οικογενειακή μεσολάβηση της μεταγραφής [36]. GDC-0449 λειτουργεί ως ισχυρός αναστολέας της λειαίνονται και δείχνει ένα υψηλό βαθμό επιλεκτικότητας για ΕΛΕΡΠΕ-Gli σηματοδότησης [36]. Στην ανθρώπινη παγκρεατική ΚΕΠ, δείξαμε την αναστολή του μονοπατιού σηματοδότησης SHH με τη στόχευση των παραγόντων μεταγραφής Gli. GDC-0449 προκάλεσε σημαντικές κυτταρικό θάνατο σε τρία παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές (AsPC-1, PANC-1 και ΜΙΑ PaCa-2) και του παγκρέατος ΚΕΠ. Σε περαιτέρω λεπτομερείς αναλύσεις των παγκρεατικών ΚΕΠ, GDC-0449 μειώθηκαν συστατικά σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ (Gli1, Gli2, Patched-1, Patched-2, ΕΛΕΡΠΕ και λειανθούν) έκφρασης, δεσμευτική δραστηριότητες Gli-λουσιφεράσης Gli-DNA και. Επιπλέον, νοκ ντάουν και των δύο εκφράσεων Gli1 και Gli2 χρήση shRNA παρέχει αντίσταση στην GDC-0499-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα. Επιπλέον, GDC-0449 μείωσε την έκφραση του PDGFRα ταυτόχρονη με αυξημένα επίπεδα του Fas, αύξησε την έκφραση του TRAIL-R1 /DR4 και TRAIL-R2 /DR5, μειωμένη έκφραση Bcl-2, και που προκαλείται από δραστικότητα κασπάσης-3 και διάσπαση PARP. GDC-0449 που προκαλείται από αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και την απόπτωση μπλοκαρίστηκαν με Gli1 συν Gli2 shRNA, δείχνοντας έτσι έναν ρόλο του Gli για κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την επιβίωση σε ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι GDC-0449 καταστέλλει παγκρεατικών πολλαπλασιασμό ΚΕΠ και την επιβίωση με αναστολή σηματοδοτικό μονοπάτι ΕΛΕΡΠΕ στο επίπεδο των γονιδίων Gli.

Αποτελέσματα

SHH μονοπάτι σηματοδότησης συστατικά εκφράζονται σε ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και του παγκρέατος ΚΕΠ

μετράται πρώτα την έκφραση διαφόρων συστατικών της SHH πορείας στα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου AsPC-1, PANC-1, και κυτταρικές σειρές MIA-PaCa-2 και του παγκρέατος ΚΕΠ με RT-PCR (Σχ. 1). Τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι τα συστατικά του μονοπατιού σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ, συμπεριλαμβανομένου του συνδέτη (Shh), τα μόρια σηματοδότησης (Patched-1, το Patched-2 και smoothened) και τελεστές (Gli1, και Gli2) εκφράζονται σε ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και παγκρεατική ΚΕΠ. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η Shh οδός είναι ανέπαφη σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και ΚΕΠ, και υποστηρίζει την ιδέα ότι η πρόσδεση του συνδέτη Shh στο διορθωμένο υποδοχέα μειώνει ανασταλτικές επιδράσεις της επί smoothened, επιτρέποντας μεταγωγής σήματος που θα οδηγήσει σε ενεργοποίηση και πυρηνική μετατόπιση του Gli παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας [13], [37].

παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα (AsPC-1, PANC-1 και ΜΙΑ PaCa-2) και του παγκρέατος ΚΕΠ αναπτύχθηκαν για 48 ώρες. Ολικό RNA απομονώθηκε και έκφραση της Shh, Patched-1, patched-2, λειαίνονται, Gli-1 και Gli-2 μετρήθηκε με qRT-PCR. HK-ΘΑΡΡ χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος εξομάλυνση. Όλες οι δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και υπολογίστηκαν με βάση ΔΔ

C

t μέθοδο. Το n-φορές μεταβολή στην έκφραση mRNAs προσδιορίστηκε σύμφωνα με τη μέθοδο του 2

-ΔΔCT με GAPDH χρησιμοποιείται ως ενδογενή έλεγχο.

Η

GDC-0449 μειώνει τη βιωσιμότητα των κυττάρων και επάγει την απόπτωση σε ανθρώπινα παγκρεατικά κυτταρικές σειρές καρκίνου του παγκρέατος και ΚΕΠ

Προηγούμενες κλινικές μελέτες έχουν δείξει ότι GDC-0449 είναι ένα μικρό αναστολέας μόριο λειανθούν. Πρέπει πρώτα επεδίωξε να εξετάσει τα αποτελέσματα της GDC-0499 για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση στον πίνακα των τριών ανθρώπινων παγκρεατικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών και του παγκρέατος ΚΕΠ. Η αναστολή της κυτταρικής επιβίωσης και επαγωγή της απόπτωσης παρατηρήθηκε εντός 24 ωρών μετά την έκθεση σε αυτό το φάρμακο (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), αλλά το μέγιστο που παρατηρείται σε 72 ώρες (Σχ. 2 και 3). Σε όλες τις κυτταρικές σειρές, επάγεται GDC-0449 απόπτωση είναι ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο φθάνοντας μέχρι και 65%. Συγκριτικά, GDC-0449 ήταν λιγότερο αποτελεσματικό στην επαγωγή της απόπτωσης σε ΚΕΠ (Εικ. 3). Για περαιτέρω μηχανιστικές μελέτες που έχουμε χρησιμοποιήσει παγκρεατική ΚΕΠ.

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GDC-0449 (0, 1, 5 και 10 μΜ) για 48 και 72 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με ΧΤΤ στο (Α) AsPC-1, (Β) ΜΙΑ PaCa-2, (Γ) PANC-1, και (Δ) του παγκρέατος ΚΕΠ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. @ Ή # σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη του ελέγχου (Ρ & lt? 0,05)

Η

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με GDC-0449 (0, 1, 5 και 10 μΜ) για 48 και 72 ώρες.. Στο τέλος της περιόδου επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και η απόπτωση μετρήθηκε. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. @ Ή # σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη του ελέγχου (P & lt? 0,05).

Η

GDC-0449 ρυθμίζει προς τα κάτω τους στόχους της ΕΛΕΡΠΕ οδού, αναστέλλει την αλληλεπίδραση Gli-DNA, μεταγραφική δραστηριότητα Gli και μειώνει Gli πυρηνική μετατόπιση σε παγκρεατικά ΚΕΠ

Εξετάσαμε επόμενο την επίδραση της GDC-0449 για την έκφραση του Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, PARP, Bcl-2, κασπάσης-3, και PDGFRα με ανάλυση δυτικού στυπώματος (Εικ. 4). GDC-0449 που προκαλείται από την έκφραση του Fas, DR4, DR5 και και ανέστειλε την έκφραση του Bcl-2 και PDGFRα σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Επιπλέον, GDC-0449 που προκαλείται από τη διάσπαση της κασπάσης-3 και ΡΑΚΡ σε παγκρεατικά ΚΕΠ, συσχετίζοντας με την έκταση της κυτταρικής επιβίωσης και της απόπτωσης.

παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε αγωγή με GDC-0449 (0, 1, 5 και 10 μΜ) για 48 ώρες. Η έκφραση του Fas, DR4 /TRAIL-R1, DR5 /TRAIL-R2, διάσπαση PARP, Bcl-2, και Caspase-3 με ανάλυση στυπώματος Western. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Είμαστε δίπλα επεδίωξε να εξετάσει τα αποτελέσματα της GDC-0449 στην οδό ΕΛΕΡΠΕ μετρώντας την έκφραση των υποδοχέων ΕΛΕΡΠΕ (Patched-1, Patched-2 και λειαίνονται ) και τελεστές (Gli1 και Gli2) με qRT-PCR (Σχ. 5Α). GDC-0449 ανέστειλε την έκφραση του smoothened, Patched-1, και το Patched-2. Παρομοίως, GDC-0449 ανέστειλε την έκφραση του παράγοντα μεταγραφής Gli1 και Gli2. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η GDC-0449 μπορεί να ρυθμίσει τα χαρακτηριστικά CSC αναστέλλοντας διάφορα στοιχεία της ΕΛΕΡΠΕ οδού.

. (Α), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε αγωγή με GDC-0449 (10 μΜ) για 36 ώρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, το RNA εκχυλίζεται και η έκφραση των Gli1, Gli2, το Patched-1, patched-2, λειαίνονται και Shh μετρήθηκε με qRT-PCR. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή ± SD. @ Σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη του ελέγχου (Ρ & lt? 0,05). (Β), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε αγωγή με και GDC-0449 (0, 1, 5 και 10 μΜ) για 48 ώρες. Πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν και το πείραμα gelshift διεξήχθη. Probe μόνο, έλεγχος (χωρίς GDC-0449) επεξεργασμένα δείγματα, και GDC-0449 (1, 5 και 10 μΜ), αντιστοίχως. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων. (C), δραστικότητα Gli-εξαρτώμενη λουσιφεράσης μειώνεται κατά GDC-0499. Παγκρέατος ΚΕΠ υπέστησαν μεταγωγή με κατασκεύασμα λεντοϊού που εκφράζουν ανταποκριτή Gli-εξαρτώμενη λουσιφεράση, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με GDC-0449 (0, 5 και 10 μΜ) για 48 ώρες. Κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν, και η δραστικότητα λουσιφεράσης μετρήθηκε. Κανονικοποιημένη δραστικότητα της λουσιφεράσης παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± SD. @ Ή # σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη του ελέγχου (P & lt? 0,05). (D), GDC-0449 αναστέλλει την έκφραση Gli1 και Gli2 σε ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ. Τα κύτταρα σπάρθηκαν επί επικαλυμμένων με ινονηκτίνη καλυπτρίδες και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με GDC-0449 (10 μΜ) για 48 ώρες. Ακολούθως, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη, αποκλείστηκε σε 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας και χρωματίστηκαν με Gli1 και Gli2 πρωτογενή αντισώματα (1:100) για 16 ώρες στους 4 ° C και πλύθηκαν με PBS. Στη συνέχεια, τα κύτταρα επωάστηκαν με σημασμένο με φθορισμό δεύτερο αντίσωμα (1:200) μαζί με DAPI (1 mg /ml) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και τα κύτταρα στερεώθηκαν και παρατηρήθηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Για την καλύτερη οπτικότητα, το χρώμα του ϋΑΡΙ άλλαξε από μπλε σε κόκκινο.

Η

Από Gli διαμεσολαβεί τις επιδράσεις της Shh, εξετάσαμε έπειτα την αλληλεπίδραση Gli-DNA με δοκιμασία μετατόπισης ηλεκτροφορητικής κινητικότητας (EMSA) σε ανθρώπινο παγκρέατος ΚΕΠ. Θεραπεία της ΚΕΠ με GDC-0449 είχε ως αποτέλεσμα μειωμένη δραστικότητα σύνδεσης Gli-DNA με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 5Β).

Εξετάσαμε επόμενο την επίδραση της GDC-0449 επί Gli μεταγραφική δραστικότητα (Σχ. 5C ). Η έκθεση των ΚΕΠ με GDC-0449 για 36 ώρες οδήγησε σε αναστολή της δραστικότητας Gli-εξαρτώμενη αναφοράς λουσιφεράσης με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. GDC-0449 ανέστειλε την έκφραση του patched-1 και patched-2 επειδή είναι κατάντη στόχοι του Gli. Είμαστε δίπλα χρησιμοποιούμενη τεχνική ανοσοφθορισμού για να εξετάσει τα αποτελέσματα της GDC-0449 για την πυρηνική έκφραση της Gli (Εικ. 5D). Παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε θεραπεία με GDC-0449, και η πυρηνική έκφραση της Gli1 και παρατηρήθηκε Gli2. GDC-0449 ανέστειλε την πυρηνική έκφραση της Gli1 και Gli2. Συνολικά, τα στοιχεία αυτά δείχνουν ότι η GDC-0449 μπορεί να αναστέλλουν τη δέσμευση και την μεταγραφική δραστηριότητα Gli DNA.

Ανθρώπινο παγκρέατος ΚΕΠ απαιτούν ενεργή λειτουργία Gli για παρατεταμένη έκφραση των γονιδίων που εμπλέκονται στην κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό

προκειμένου να εξετάσει τις επιπτώσεις της Gli1 και Gli2 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση και κατάντη στόχους, θα ανέστειλε την έκφραση των μεταγραφικών παραγόντων Gli1 και Gli2 από shRNA. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Α, με τη μεσολάβηση λεντοϊού έκφραση Gli1 και Gli2 shRNA ανέστειλε την έκφραση των πρωτεϊνών Gli1 και Gli2 σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Εάν GDC-0449 αναστέλλει την βιωσιμότητα των κυττάρων και επάγει την απόπτωση μέσω αναστολής της μεταγραφής Gli παράγοντες, η αναστολή της Gli1 και Gli2 πρέπει εμποδίσει τις αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα του GDC-0449. Για να επιβεβαιώσετε το Gli-εξαρτώμενη αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα GDC-0449, χρησιμοποιήσαμε παγκρέατος ΚΕΠ εκφράζοντας Gli1 + Gli2 shRNA (Εικ. 6Β). GDC-0449 ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση που επάγεται στο ΚΕΠ /ομελέτα κύτταρα. Αναστολή της Gli1 και Gli2 μόνο από τον shRNA δεν ήταν σε θέση να αναστέλλει πλήρως τα αποτελέσματα της GDC-0449 για τη βιωσιμότητα της CSC (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συγκριτικά, η αναστολή της Gli1 συν Gli2 μαζί μέσω shRNA κατέστειλε τις επιδράσεις της GDC-0449 για τη βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση σε ΚΕΠ. Τα δεδομένα αυτά δείχνουν ότι και οι δύο Gli1 και Gli2 γονίδια που απαιτούνται για την αντι-πολλαπλασιαστική και προ-αποπτωτικά αποτελέσματα της GDC-0449.

(Α), νοκ-άουτ της Gli1 shRNA και Gli2 shRNA στο ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ. Παγκρέατος ΚΕΠ μετήχθησαν με λεντοϊού σωματίδια που εκφράζουν Ομελέτα, Gli1 shRNA, Gli2 shRNA ή Gli1 συν Gli2 shRNA (KO). (Β), του παγκρέατος ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε αγωγή με GDC-0449 (0, 1, 5 και 10 μΜ) για 72 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων και την απόπτωση μετρήθηκε σε κωδικοποιημένα και Gli1 συν Gli2 shRNA ΚΕΠ. Δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση ± SD, η = 4. @ ή # σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη του ελέγχου (Ρ & lt? 0,05). (C), Κωδικοποιημένα και Gli1 συν Gli2 shRNA παγκρεατικό ΚΕΠ υποβλήθηκαν σε αγωγή με GDC-0449 (0 και 10 μΜ) για 48 ώρες, και κυτταρολύματα εκχυλίσθηκαν για να προσδιοριστεί η έκφραση του DR4, DR5, PDGFRα, Fas και Bcl-2 με Western ανάλυση κηλίδος. β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (D), Αναστολή της πρωτοβάθμιας και δευτεροβάθμιας σφαιροειδή από GDC-0449. Η παγκρεατική ΚΕΠ (κωδικοποιημένα, και Gli1 + Gli2 shRNA) σπάρθηκαν σε εναιώρημα και υπέστη κατεργασία με GDC-0449 (10 μΜ) για 7 ημέρες. Στο τέλος της περιόδου επώασης, σφαιροειδή συλλέχθηκαν, και διαχωρίζεται με Accutase (Καινοτόμες τεχνολογίες κυψελών, Inc.). Για τη δευτεροβάθμια σφαιροειδή, τα κύτταρα επανασπάρθηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με GDC-0449 (10 μΜ) επί επιπλέον 7 ημέρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με trypan blue δοκιμασίας. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± SD. @ Ή # σημαντικά διαφορετική από την αντίστοιχη των ελέγχων, η P & lt?. 0.05

Η

Εξετάσαμε δίπλα τα αποτελέσματα της αναστολής της έκφρασης Gli στις κατάντη στόχος της ΕΛΕΡΠΕ οδού με ανάλυση Western blot (Σχήμα 6C.). GDC-0449 (10 μΜ) προκάλεσε την έκφραση του Fas, DR4 και DR5, διασπασμένη PARP, και ανέστειλε την έκφραση του Bcl-2 και PDGFRα σε CSC /κωδικοποιημένα κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι η έκφραση του PDGFRα μειώθηκε εξής GDC-0449 αγωγή με ταυτόχρονη αύξηση των Fas. Συγκριτικά, GDC-0449 δεν είχε σημαντικές επιπτώσεις στην έκφραση αυτών των κατάντη στόχους της ΕΛΕΡΠΕ μονοπατιού σηματοδότησης σε κύτταρα ΚΕΠ /Gli1 + Gli2 shRNA.

Στη συνέχεια εξετάσαμε την επίδραση της GDC-0449 για το σχηματισμό της πρωτοβάθμιας και δευτεροβάθμιας σφαιροειδές (Εικ. 6D). GDC-0449 ανέστειλε το σχηματισμό της πρωτοβάθμιας και δευτεροβάθμιας σφαιροειδή στο CSC /ομελέτα κύτταρα. Συγκριτικά, η μεταγωγή Gli1 συν Gli2 shRNA σε ΚΕΠ κατέστειλε τα ανασταλτικά αποτελέσματα της GDC-0449 επί του σχηματισμού πρωτογενούς και δευτερογενούς σφαιροειδές. Αυτά τα στοιχεία υποδηλώνουν ότι η GDC-0449 μπορεί να αναστείλει παγκρέατος χαρακτηριστικά CSC.

Συζήτηση

Η μελέτη μας δείχνει, για πρώτη φορά, ότι λειαίνονται εξαρτώμενη θεραπευτικός παράγοντας GDC-0449 ρυθμίζει την κυτταρική επιβίωση σε ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ. Συγκεκριμένα, GDC-0449 ανέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα και επαγόμενη απόπτωση σε τρία παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και τα παγκρεατικά ΚΕΠ. Σε παγκρεατικό ΚΕΠ, GDC-0449 κατέστειλε επίσης την βιωσιμότητα των κυττάρων, δεσμευτική και Gli-μεταγραφικό δραστηριότητες Gli-DNA, απόπτωση που επάγεται μέσω της κασπάσης-3 ενεργοποίησης και διάσπαση PARP. Ανάλυση των μοριακών μηχανισμών του GDC-0449 που προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο σε ΚΕΠ έδειξαν αυξημένη έκφραση Fas και μειωμένη έκφραση PDGFRα, η οποία ρυθμίζει επίσης Fas. Επιπλέον, Bcl-2 προς τα κάτω-ρυθμίζονται, ενώ DR4 και εκφράσεις DR5 αυξήθηκαν μετά τη θεραπεία της GDC-0449. Καταστολή των δύο Gli1 συν Gli2 από shRNA μιμήθηκε τις αλλαγές στην βιωσιμότητα των κυττάρων, σχηματισμό σφαιροειδές, την απόπτωση και την έκφραση του γονιδίου του θανάτου που σχετίζονται με παρατηρείται στην GDC-0449-επεξεργασία παγκρέατος ΚΕΠ. Έτσι, ενεργοποιείται γονίδια Gli καταστέλλουν DRs και εκφράσεις Fas ενώ μέχρι ρύθμισης Bcl-2 και PDGFRα εκφράσεις για την αναστολή της Fas. Τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν τον κρίσιμο ρόλο της σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ στο ανθρώπινο παγκρεατικό ΚΕΠ και τη δυνατότητα στόχευσης Gli1 και Gli2 λειτουργίες ενεργοποιητή χρησιμοποιώντας GDC-0449 σε παγκρεατικά καρκινικά βλαστικά κύτταρα.

ΕΛΕΡΠΕ γεγονότα σηματοδότησης έχουν εμπλακεί σε πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και επιβίωση καθώς είναι το μοριακό σήμα κατατεθέν των διαφορετικών οντοτήτων ανθρώπινου όγκου που περιλαμβάνουν οισοφαγικό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων, καρκίνωμα βασικών κυττάρων [38], υποσύνολα μυελοβλάστωμα [39], του καρκίνου του προστάτη [40], ο καρκίνος του παχέος εντέρου [41], οι όγκοι του εγκεφάλου [42 ], ραβδομυοσάρκωμα [43], και του καρκίνου του μαστού [44]. Πολλαπλές γραμμές αποδείξεων υποστηρίζουν την ιδέα ότι η Shh σηματοδότησης αποτελεί προϋπόθεση για την αύξηση της βιωσιμότητας των παγκρεατικών ΚΕΠ, έτσι ώστε το κλείδωμα ενεργό σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ με τα θεραπευτικά μόρια αναστολέα όπως GANT-61 (στόχευση τελεστές Gli1 και Gli2) και κυκλοπαμίνη (στόχευση των υποδοχέων ΕΛΕΡΠΕ λειαίνονται) προκάλεσε κυτταρικό θάνατο [45]. Έχουμε δείξει ότι τα ανθρώπινα παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές και ΚΕΠ εκφράζουν σταθερά διάφορα συστατικά του μονοπατιού SHH συμπεριλαμβανομένων τελεστές (Gli1 και Gli2), και οι υποδοχείς (Patched-1, patched-2, και smoothened), και το σημαντικότερο ο συνδετήρας: SHH, υποδηλώνοντας , η Shh οδός είναι ένα από τα «πυρήνας» μονοπάτι σηματοδότησης ή αυτοκρινή τρόπο SHH σηματοδότησης σε αυτά τα κύτταρα. Η ενεργοποίηση του καταρράκτη σηματοδότησης SHH επάγει σταθερά Gli παράγοντες οικογένεια μεταγραφής (Gli1 και Gli2), ως εκ τούτου, και τα δύο γονίδια Gli mRNA [46], που εκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές και ΚΕΠ, δηλώνοντας πιθανή εμπλοκή του SHH σηματοδότησης σε ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινογένεση.

η ανώμαλη ενεργοποίηση σηματοδότησης SHH εμπλέκεται σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους. Για τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών στόχων, η αναστολή της σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ έχει επιχειρηθεί σε πολλές ανθρώπινους καρκίνους [11], [41], [45]. Πρόσφατα, Gli και Smo ανταγωνιστές έχουν χρησιμοποιηθεί για να καταργήσει σηματοδότηση SHH σε ανθρώπινους καρκίνους (40). Φυσικά και συνθετικά λειαίνονται ανταγωνιστές όπως η κυκλοπαμίνη [24] και IPI-926 [11], αντίστοιχα, ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό, την επιβίωση και διαθέτουν λειτουργίες αντι-όγκου, με αποτέλεσμα την κατάργηση της σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ. Ωστόσο, κατά τη διάρκεια των κλινικών δοκιμών έχουν παρατηρηθεί διάφορα επίπεδα αντοχής. Φαρμακευτικοί παράγοντες συμπεριλαμβανομένων κυκλοπαμίνη (11), GDC-0499 και GANT-61 [41] έχουν ανασταλεί λειτουργίες επιβίωση και κατά του όγκου σε προκλινικά μοντέλα ανθρώπινων καρκίνων. Gli γονίδια είναι πιθανά μέλη της ΕΛΕΡΠΕ μονοπατιού, τα οποία δρουν ως κατάντη μεσολαβητές της σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ και έχουν ρυθμιστική δράση για τον κυτταρικό κύκλο και την απόπτωση. Ως εκ τούτου, ένας δυνητικός στόχος druggable έγκειται στο Gli παράγοντες μεταγραφής της οικογένειας, τα οποία είναι τα τελικά μεσολαβητές της μεταγραφικής ρύθμισης στο μονοπάτι σηματοδότησης SHH. Στην παρούσα μελέτη, η έκθεση σε GDC-0449 επάγει σημαντική κυτταροτοξικότητα και απόπτωση σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος και ΚΕΠ.

GDC-0449 αγωγή μείωσε αποτελεσματικά δέσμευσης Gli-DNA και Gli-μεταγραφική δραστικότητα σε ανθρώπινα παγκρεατικά ΚΕΠ. Αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι GDC-0449 μπορεί να προκαλέσει μετα-μεταγραφική μεταβολές του γονιδίου Gli, οι οποίες θα μπορούσαν να κατευθύνεται προς μια αύξηση στη φωσφορυλίωση που είτε εμποδίζουν δέσμευσης DNA ή αποσταθεροποιούν το σύμπλοκο Gli-DNA. Μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του γονιδίου Gli είναι ένας σημαντικός μηχανισμός που ρυθμίζει την ικανότητα των διαφόρων παραγόντων μεταγραφής να αναστέλλουν χωριστές σειρές γονιδίων, που εμπλέκονται στην ρύθμιση της αναστολής κυτταρικού θανάτου [41], σύμφωνα με προηγούμενες παρατηρήσεις σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν Gli1 [13 ]. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον, λειαίνονται εξαρτώμενη GDC-0449 αγωγή των παγκρεατικών ΚΕΠ αξιοσημείωτα ανέστειλε εκφράσεις των υποδοχέων ΕΛΕΡΠΕ (Patched-1, το Patched-2 και smoothened) και τελεστές (Gli1 και Gli2), δείχνοντας έτσι το δυναμικό για θεραπευτική εφαρμογή για τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος . Έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι GDC-0449 ταυτοποιήθηκε ως αναστολέας της μεταγραφικής δραστικότητας Gli1, και επίσης κατήργησε Gli2 διαμεσολαβούμενη μεταγραφή [36]. Στη συνέχεια, έχουμε παρατηρήσει ότι η μείωση στην έκφραση Gli2 προηγηθεί εκείνη του Gli1 σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Περαιτέρω, μελέτες σε ποντίκια έχουν δείξει ότι Gli2 είναι πρωτογενείς μεσολαβητές σηματοδότηση SHH και είναι γνωστό ότι ρυθμίζει την έκφραση μεταγραφικά Gli1 [25]. Επειδή το σηματοδοτικό μονοπάτι ΕΛΕΡΠΕ έχει ήδη ενεργοποιηθεί σε ανθρώπινα παγκρεατικά ΚΕΠ, μελέτες με τη χρήση shRNA νοκ ντάουν της Gli1 και Gli2 μόνη της και ταυτόχρονα διεξήχθησαν. GDC-0449 ανέστειλε σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα και επαγόμενη απόπτωση σε shRNA Gli1 και Gli2 μόνη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Είναι ενδιαφέρον, σημαντική προστασία από GDC-0449-επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και την απόπτωση καταγράφηκε σε shRNA νοκ ντάουν τόσο Gli1 και Gli2. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν περαιτέρω την ιδέα ότι GDC-0449 μπορεί να έχει Gli-εξαρτώμενη και ανεξάρτητη από τον τρόπο δράσης (Εικ. 7) και δείχνουν περαιτέρω τη σημασία της λειτουργικής Gli γονίδια στη διατήρηση της κυτταρικής επιβίωσης σε ανθρώπινα παγκρεατικά ΚΕΠ.

ενεργοποιείται Gli1 και Gli2, κατάντη της ΕΛΕΡΠΕ-Patched-λειαίνονται, ρυθμίζουν τους στόχους της ΕΛΕΡΠΕ σηματοδότησης συμπεριλαμβανομένων των Bcl-2, PDGFRα, Fas, και Δρ. GDC-0449 (στόχευση λειανθούν) αναστέλλει τις έμμεσες λειτουργίες του Gli ενεργοποιητές, με αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο.

Η

Για να εκτιμηθεί αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση της GDC-0449 με περισσότερες λεπτομέρειες, έχουμε την επόμενη συσχέτιση της έκφρασης του κυτταρικού κύκλου και γονίδια που σχετίζονται με την απόπτωση με ΕΛΕΡΠΕ σηματοδότησης σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Σε αρκετές βλαστικών κυττάρων και καρκινικών κυττάρων, η Shh ενεργεί ως παράγοντας επιβίωσης [9], [47]. ΕΛΕΡΠΕ έχει αναφερθεί για τον έλεγχο του πολλαπλασιασμού διαφόρων τύπων κυττάρων μέσω διαφόρων μοριακών μηχανισμών, όπως αύξηση των PDGFRα και Bcl-2 εκφράσεις, μειώνονται σε DRs και Fas εκφράσεις, και η αναστολή της διάσπασης της ΡΑΚΡ και κασπάσης-3 ενεργοποίησης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου υπερεκφράζουν Gli γονίδια [41], ή, ένα υπερέκφραση των κυρίαρχων-αρνητικών FADD σε κύτταρα που εκφράζουν SHH ή ουσιαστικά δραστική smoothened [41]. Στη μελέτη μας, GDC-0449 προκάλεσε μία αξιοσημείωτη αύξηση στην έκφραση του Fas και δύο DRs (TRAIL-R1 /DR4 και TRAIL-R1 /DR5), που υποδηλώνει την πιθανή εμπλοκή των εν λόγω DRs στο Drug-επαγόμενη απόπτωση. Πρόσφατες αναφορές έδειξαν την απουσία Gli θέσεις στην περιοχή του υποκινητή του DR4 και DR5 δεσμευτική. Η ρύθμιση της έκφρασης DR από το Gli είναι προς το παρόν άγνωστη και μπορεί να είναι μέσω ενός έμμεσο μηχανισμό. Ωστόσο, GDC-0449 που προκαλείται από τη ρύθμιση των δύο DRs σε παγκρεατικά ΚΕΠ, γεγονός που υποδηλώνει μεταγραφική ρύθμιση δραχμών από το παρόν άγνωστο μηχανισμό. Προσδιορίσαμε επίσης οι συνεισφορές των αποπτωτικών οδών κυτταρικού θανάτου (μιτοχόνδρια μεσολάβηση εγγενείς και του θανάτου του υποδοχέα σηματοδότηση διαμεσολαβούμενη εξωγενούς), με βάση τη γνωστή ρύθμιση της PDGFRα ανάντη του Fas [2], [48], και του Bcl-2, η οποία μπορεί να αποτελέσουν άμεσο στόχο της μεταγραφής των δύο Gli1 και Gli2, ένα βασικό αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών στην επιβίωση ΕΛΕΡΠΕ-εξαρτώμενη κυτταρική [49]. Δείξαμε ότι GDC-0449 αγωγή μειώνει πρωτεΐνη προ-επιβίωσης έκφραση Bcl-2 σε παγκρεατικά ΚΕΠ. Έτσι, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού ΕΛΕΡΠΕ μπορούν να ρυθμίσουν τα γονίδια που εμπλέκονται και στις δύο κυτταρικές-εξωγενή και ενδογενή κυττάρων-μονοπάτια της απόπτωσης.

Μαζί, αυτή η μελέτη αποκαλύπτει ότι η ενδογενής σηματοδότησης ΕΛΕΡΠΕ ελέγχει την ικανότητα αυτο-ανανέωσης του ανθρώπινου παγκρέατος ΚΕΠ στοχεύοντας στόχων προς τα κάτω ροή του Gli. Συμπερασματικά, GDC-0449 μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία του ανθρώπινου καρκίνου του παγκρέατος, επειδή μπορούν να στοχεύσουν παγκρεατικό καρκίνο ΚΕΠ.

Μέθοδοι

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Αντισώματα εναντίον SHH, λειαίνονται, Fas, TRAIL-R1 /DR4, TRAIL-R2 /DR5, και β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Αντισώματα έναντι Gli1, Gli2, το Patched-1, patched-2, PDGFRα και κασπάσης-3 ελήφθησαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Ενισχυμένη χημειοφωταύγειας (ECL) Western αντιδραστήρια ανίχνευσης στυπώματος ήταν από την Amersham Life Sciences Inc. (Arlington Heights, IL). GDC-0449 (Vismodegib? C19H14Cl2N2O3S) αγοράστηκε από Tocris (Ellisville, ΜΟ). Όλα τα άλλα χημικά που χρησιμοποιήθηκαν ήταν αναλυτικού βαθμού και αγοράστηκαν από την Fisher Scientific (Suwanee, GA) και Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ).

Κυτταρική καλλιέργεια

Ο καρκίνος του παγκρέατος κυτταρικές γραμμές ( AsPC-1, PANC-1 και ΜΙΑ PaCa-2) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS) και 1% αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και

2 5% CO. Ανθρώπινων παγκρεατικών ΚΕΠ (CD133

+ /CD44

+ /CD24

+ /ESA

+) ελήφθησαν από Celprogen Inc. (San Pedro, CA). Αυτοί απομονώθηκαν από πρωτογενείς όγκους και έχουν περιγραφεί προηγουμένως [33]. Οι CSCs καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 1% Ν2 Συμπλήρωμα (Invitrogen), 2% Β27 συμπλήρωμα (Invitrogen), 20 ng /ml ανάπτυξη ανθρωπίνων αιμοπεταλίων παράγοντα (Sigma-Aldrich), 100 ng /ml επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (Invitrogen) και 1 % αντιβιοτικό-αντιμυκητικό (Invitrogen) στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2. Παγκρέατος ΚΕΠ ήταν συνήθως ελέγχεται από τη μορφολογία και την ανάπτυξη χαρακτηριστικά

παραγωγή λεντοϊών σωματιδίων και Gli1 shRNA και Gli2 shRNA μεταγωγή

Gli1 shRNA (5′-GCCTGAATCTGTGTATGAA-3 ‘?. 5′-GTTTGAATCTGAATGCTAT-3 «? 5’- AGCTAGAGTCCAGAGGTTC-3 ‘? 5′- CCGGAGTGCAGTCAAGTTG-3′ και 5’-GGCTGGACCAGCTACATCA-3 ‘) και Gli2 shRNA (5′-CCGAGAAGCAAGAAGCCAA-3′? 5’- CACAGCATGCTCTACTACT-3 ‘? 5’- TCGCTAGTGGCCTACATCA