Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι μια φλεγμονή που σχετίζεται με κακοήθεια με υψηλό ποσοστό θνησιμότητας. CXCR2 έκφραση των ωοθηκών είναι επιθετικοί με χειρότερη έκβαση. Ως εκ τούτου, ερευνήθηκε μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται σε CXCR2 με γνώμονα την πρόοδο του καρκίνου με τη σύγκριση CXCR2 θετικές και αρνητικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου των ωοθηκών. Σταθερά επιμολυσμένα CXCR2 SKOV-3 κύτταρα είχαν έναν ταχύτερο ρυθμό ανάπτυξης σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα με άδειο φορέα. Ιδιαίτερα, παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF), εκφράζεται σε αφθονία στον καρκίνο των ωοθηκών, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ενισχύεται με τη μείωση της G0-G1 φάση σε CXCR2 επιμολυσμένα κύτταρα. TNF αυξημένη παράγοντα-κΒ (NF-κΒ) δραστηριότητα πυρηνικής σε μεγαλύτερο βαθμό σε CXCR2 επιμολυσμένα κύτταρα από τα κύτταρα ελέγχου καθώς και παρέχεται μια μεγαλύτερη ενεργοποίηση του ΙκΒ. CXCR2 επιμολυσμένα κύτταρα εξέφρασαν υψηλότερα επίπεδα προφλεγμονωδών συνδετών του, CXCL1 /2 και βελτιωμένη περισσότερο πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, εισβολή και σχηματισμού αποικίας. CXCR2 θετικά κύτταρα ενεργοποιούνται επίσης πιο EGFR, η οποία οδήγησε σε υψηλότερες Akt ενεργοποίηση. Ενισχυμένη δραστικότητα ΝΡ-κΒ σε CXCR2 θετικά κύτταρα μειώθηκε κατά έναν αναστολέα ΡΙ3Κ /Akt, αντί ενός αναστολέα Erk. CXCL1 προστίθεται σε CXCR2 θετικά κύτταρα οδήγησε σε αυξημένη ενεργοποίηση του ΙκΒ. CXCL1 οδήγησε επίσης σε σημαντικά μεγαλύτερο αριθμό μεταστατικών κυττάρων σε CXCR2 επιμολυσμένα κύτταρα, τα οποία έχει αποκλειστεί από τον αναστολέα του ΝΡ-κΒ, Bay 11-7082. Επιπλέον, ενισχυμένο πολλαπλασιασμό κυττάρων σε CXCR2 θετικά κύτταρα ήταν πιο ευαίσθητα σε CXCL1 αντίσωμα ή έναν αναστολέα του ΝΡ-κΒ. Τέλος, CXCR2 επιμόλυνση γονικών κυττάρων αυξημένη δραστηριότητα προαγωγέα CXCL1 μέσω μιας θέσης ΝΡ-κΒ. Έτσι, αύξηση των προφλεγμονωδών χημειοκινών CXCL1 /2, με ενίσχυση της ενεργοποίησης του NF-κΒ μέσω EGFR-μετενεργοποίησε Akt, συμβάλλει στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών CXCR2 γνώμονα

Παράθεση:. Dong YL, Kabir SM, Lee ES, Υιός DS ( 2013) CXCR2-Driven καρκίνου των ωοθηκών εξέλιξη Περιλαμβάνει πάνω ρύθμιση προφλεγμονωδών χημειοκίνες με ενίσχυση NF-κΒ ενεργοποίηση μέσω του EGFR-μετενεργοποίησε Ακί σηματοδότησης. PLoS ONE 8 (12): e83789. doi: 10.1371 /journal.pone.0083789

Επιμέλεια: Ichiro Aoki, Yokohama City University School of Medicine, Ιαπωνία

Ελήφθη: 5, Ιουνίου του 2013? Αποδεκτές: 8 Νοέμβρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 20 του Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Dong et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) Εθνικό Ινστιτούτο Γενικών Ιατρικών Επιστημών (NIGMS) SC1 089.630 (EL) και το Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων (NIAID) SC1AI089073 (DS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών, μία από τις πολλές καρκίνων που σχετίζεται με φλεγμονή, είναι η πέμπτη κορυφαία αιτία θανάτου από καρκίνο μεταξύ των γυναικών. Είναι μια ύπουλη ασθένεια, επειδή είναι συνήθως ασυμπτωματική μέχρι όγκοι έχουν εξαπλωθεί πολύ πέρα ​​από τις ωοθήκες [1]. Η προφλεγμονώδεις μικροπεριβάλλον του όγκου του καρκίνου των ωοθηκών είναι κλινικά συνδέεται με περιτοναϊκή διάχυση του όγκου και μαζική ασκίτη, που ακολουθείται από ένα υψηλό ποσοστό θνησιμότητας. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα του παράγοντα νέκρωσης όγκου (TNF), υποδηλώνοντας τη δυνητική σημασία του TNF ως ρυθμιστής της προφλεγμονώδους μικροπεριβάλλον του όγκου σε αυτό το κακοήθειας [2] – [4]. Ιδιαίτερα, ο TNF έχει δειχθεί ότι ρυθμίζει δίκτυα χημειοκίνης σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μέσω της οδού σηματοδότησης πυρηνικού παράγοντα-κΒ (NF-κΒ) [5] – [6]. Οι χημειοκίνες μπορεί να είναι κρίσιμη μεσολαβητές σε ένα μικροπεριβάλλον του όγκου, συμβάλλοντας στην εξέλιξη του καρκίνου και μετάσταση [7] – [8]. Μεταξύ υποδοχείς χημειοκινών, των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα συχνά εκφράζουν CXCR2, η οποία έχει ζητηθεί ο καρκίνος των ωοθηκών εξέλιξη [9]. CXCR2 είναι επίσης εξαιρετικά εκφρασμένη σε ορισμένους άλλους τύπους καρκινικών κυττάρων όπως αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα [10], του λάρυγγα καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων [11], ενδομητρικό καρκίνωμα [12], του καρκίνου του ορθού [13], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [14] και γαστρικού καρκίνου [15] . Λόγω αυτής της σύνδεσης, μπορεί να είναι σε θέση να λειτουργήσει ως ανεξάρτητος προγνωστικός δείκτης. Έτσι CXCR2 ποντίκια knockout έχουν ένα σημαντικά μειωμένο φορτίο όγκου στον καρκίνο του προστάτη [16], ο καρκίνος του πνεύμονα ποντικού Lewis [17] και τα μοντέλα νεφρικού όγκου [18], σε σύγκριση με CXCR2 ποντικούς άγριου-τύπου. Επιπλέον, η έλλειψη CXCR2 βαθιά κατέστειλε φλεγμονή καθοδηγείται ογκογένεση στο δέρμα και στο έντερο [19]. Η απουσία του CXCR2 στο μικροπεριβάλλον του όγκου εμπόδισε επίσης την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου [20]. Τέλος, CXCL1, ένας συνδετήρας CXCR2, σχετίστηκε αντίστροφα με την ελεύθερη υποτροπής επιβίωση σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου [21].

Αυτά τα γεγονότα δείχνουν ότι ένα σηματοδοτικό μονοπάτι CXCR2 μεσολάβηση συνδέεται στενά με την εξέλιξη του καρκίνου. Αν και οι πολλαπλές οδούς όπως απόπτωση, την ενεργοποίηση του EGFR και την αγγειογένεση εμπλέκονται σε CXCR2 μεσολάβηση σηματοδότηση [9], [16] – [20], εξακολουθεί να υπάρχει ένα μεγάλο κενό επί μοριακών μηχανισμών που συνδέουν μεταξύ CXCR2 και πολλαπλά μονοπάτια της. Σε προηγούμενη μελέτη μας, κυτταρικές σειρές καρκίνου ωοθήκης εκφράζεται έντονα CXCL1-3 και CXCL8 [5] – [6], η οποία όλα έχουν μια υψηλή συγγένεια για CXCR2 [22]. Ακόμη και αν αυτοί οι συνδετήρες CXCR2 είναι στενά ρυθμίζονται από ΝΡ-κΒ σηματοδότηση [5], [23], δεν είναι σαφές πώς CXCR2 και NF-κΒ μηχανικώς εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου των ωοθηκών. Εδώ χρησιμοποιήσαμε γονικές κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών και δημιουργούνται σταθερές CXCR2 επιμολυσμένα κύτταρα καθώς και κύτταρα ελέγχου επιμολυσμένα με άδειο φορέα. Στη συνέχεια ορίζεται η επίπτωση του NF-κΒ σηματοδότηση, ένα κύριο προφλεγμονωδών οδού, σχετικά με την πιθανή συμβολή του CXCR2 να εξέλιξης του καρκίνου των ωοθηκών.

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινο TNF, CXCL1 και ένα ειδικό αντίσωμα CXCL1 /2/3 τηγάνι για εξουδετέρωση ελήφθησαν από την Κ & amp? D Systems (Minneapolis, ΜΝ). Ένα ανθρώπινο CXCL1 /2 κιτ ELISA αγοράστηκε από την PeproTech (Rocky Hill, NJ). PD98059 αγοράστηκε από την EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ), AG-1478 ήταν από Enzo Life Sciences International, Inc., (Plymouth Meeting, ΡΑ) και Bay11-7082 και LY294002 από την Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Αντισώματα αγοράστηκαν ως εξής: CXCR2 (Ε-2, sc-7304) και β-ακτίνη ήταν από τη Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) και ΙκΒ, ΙΚΚ, EGFR, Erk1 /2, Akt και φωσφορυλιωμένες μορφές τους, όπως ΙκΒ (Ser32 /36), EGFR (Tyr1173), Erk1 /2 (Thr202 /Tyr204), ΙΚΚ (Ser176 /180) και Akt (Ser473), ήταν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Lipofectamine 2000, G418 και όλα τα μέσα μαζικής ενημέρωσης υγρό καλλιέργειας αποκτήθηκαν από την Invitrogen (Grand Island, Νέα Υόρκη). Μια προσαρμοσμένη συστοιχία PCR για το δίκτυο χημειοκινών, σειρά PCR θέτει για τα γονίδια που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο, ένα SYBR® Πράσινη Master Mix, και Τα siRNAs για τον έλεγχο και CXCR2 προήλθε από SABiosciences σε Qiagen (Frederick, MD). Χημειοφωταύγειας κιτ ανίχνευσης ήταν από την GE Healthcare (Piscataway, NJ). Αντινόημα και την αίσθηση ολιγονουκλεοτίδια ελήφθησαν από Eurofins MWG Operon (Huntsville, AL). φορέας έκφρασης CXCR2 ήταν πολύ ευγενώς από το Δρ Ann Richmond (Πανεπιστήμιο Vanderbilt, Nashville, ΤΝ), ενώ ο φορέας λουσιφεράσης ΝΡ-κΒ προήλθε από BD Biosciences (Palo Alto, CA). Τα siRNAs για τον έλεγχο και Akt1 αγοράσθηκαν από τη Cell Signaling Technology (Beverly, ΜΑ). Τέλος, το σύστημα λουσιφεράσης Assay,

Renilla

-Glo ™ Σύστημα Προσδιορισμού Λουσιφεράσης και φορέα ρΡΙ_-ΤΚ ελήφθησαν από την Promega (Madison, WI).

Σταθερό CXCR2 Εκφράζοντας γραμμής κυττάρου και κυττάρου Cultures

Η ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών SKOV-3 αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (Manassas, VA). CXCR2 κυτταρικές σειρές που εκφράζουν παρήχθησαν με σταθερώς επιμόλυνση CXCR2 ή κενούς φορείς σε γονική SKOV-3 καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών και επιλέγοντας G418-ανθεκτικών κλώνων. Εν συντομία, συρρέοντα κύτταρα επιμολύνθηκαν με CXCR2 ή κενούς φορείς χρησιμοποιώντας λιποφεκταμίνη 2000 και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με G418 για την επιλογή των ανθεκτικών στα φάρμακα κλώνων. Τα κατεργασμένα κύτταρα άλλαξαν με τα νέα μέσα κάθε 3 ημέρες έως ότου εμφανίστηκαν G418-ανθεκτικών κλώνων. Η έκφραση της πρωτεΐνης CXCR2 στους επιλεγμένους κλώνους επιβεβαιώθηκε με κηλίδα Western και ανάλυση συνεστιακή απεικόνιση. Επειδή έκφραση του CXCR2 σε SKOV-3 κύτταρα είναι αμφιλεγόμενη (5, 9), εμείς επιβεβαίωσε την απουσία ή το πολύ ίχνη έκφραση του CXCR2 σε επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης σε γονικά κύτταρα χρησιμοποιώντας συστοιχία PCR, qRT-PCR, στύπωμα Western και ανάλυση συνεστιακή απεικόνιση . Η θετική κυτταρική σειρά CXCR2 ονομάστηκε SKCXCR2, και η κυτταρική γραμμή αρνητικού ελέγχου CXCR2, SKA. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα (περίπου 5 × 10

4 κύτταρα /ml) καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε νερό-κορεσμένη ατμόσφαιρα 95% αέρα και 5% CO

2 σε 24- ή 6-φρεατίων με RPMI μέσο με πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη και 10% FBS. Μετά μια ολονύκτια καλλιέργεια για να επιτρέψει την κυτταρική προσκόλληση προς τις πλάκες, το μέσο απομακρύνθηκε και προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο χωρίς FBS για να απομακρυνθούν οποιεσδήποτε επιδράσεις των συστατικών που περιέχονται σε ορούς. Οι θεραπείες με τα διάφορα μέσα που περιγράφονται λεπτομερώς σε αποτελέσματα.

Western Blots

Τα κυτταρολύματα παρασκευάστηκαν, κλασματοποιημένο σε πηκτές SDS-πολυακρυλαμιδίου και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [6]. Δέσμευση μη ειδικών πρωτεϊνών διεξήχθη με επώαση των μεμβρανών με 5% άπαχο ξηρό γάλα σε ρυθμισμένο με Tris αλατούχο διάλυμα Tween-20 (TBST) επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Οι κηλίδες επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε αραίωση 1:1,000 εντός διαλύματος αποκλεισμού επί μία νύκτα στους 4 ° C. Οι μεμβράνες πλύθηκαν 3 φορές με TBST για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από επώαση για 1 ώρα με ραφανιδική υπεροξειδάση συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (1:2,500 αραίωση) σε 5% γάλα /TBST. Οι μεμβράνες στη συνέχεια ξεπλύθηκαν 3 φορές με TBST για 10 λεπτά και τις ζώνες οπτικοποιούνται με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια. Μετά την απογύμνωση για 10 λεπτά με μεθανόλη που περιέχει μεμβράνη 3% Η

2O

2, β-ακτίνη ανιχνεύθηκε προκειμένου να χρησιμεύσει ως ένας εσωτερικός έλεγχος φόρτωσης των προϊόντων λύσης κυττάρου.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Δοκιμασίες

δοκιμασίες πολλαπλασιασμού κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση της αποκοπής του 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2,5-διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ) σε ένα έγχρωμο προϊόν. Μετά από επώαση σε 24 φρεατίων πλάκα, το κάθε φρεάτιο πλύθηκε δύο φορές με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και στη συνέχεια ένα διάλυμα ΜΤΤ (1 mg /ml φαινόλης κόκκινου-ελεύθερα μέσα ενημέρωσης: PBS = 4:01) προστέθηκε. Οι πλάκες επωάστηκαν για 3 ώρες με προστασία από το φως. Το διάλυμα ΜΤΤ απομακρύνθηκε και προστέθηκαν 500 μΐ ισοπροπανόλης. Οι πλάκες τοποθετήθηκαν σε συσκευή ανακίνησης για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου για να διαλυθεί καλά το προϊόν χρώμα ΜΤΤ. Η οπτική πυκνότητα μετρήθηκε στα 595 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλάκας (Bio-Rad, Hercules, CA). Οι τιμές ομαλοποιήθηκαν με μη κατεργασμένους ελέγχους.

Κυτταρομετρίας Ροής

Τα καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε ίσες πυκνότητες και διατηρήθηκαν σε καλλιέργεια για 24 ώρες. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή εις τριπλούν με TNF (10 ng /ml) ή μέσο μόνο ως έλεγχο επί 48 ώρες. Προσκολλητικά και μη προσκολλημένα κύτταρα συλλέχθηκαν με ψυχρό PBS και χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο [50 mg /ml σε 0,1% (w /v) κιτρικό νάτριο, 0,1% (ν /ν) Triton Χ-100] όλη τη νύκτα. Μετά από ολονύκτια επώαση, τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας FACScan κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences) και το ποσοστό των κυττάρων σε G0 /G1, G2 /M και S φάσεις προσδιορίζεται ποσοτικά χρησιμοποιώντας το λογισμικό FloJo (Tree αστεριών Inc., Ashland, OR).

παροδικές επιμολύνσεις και λουσιφεράσης Δοκιμασίες

δραστικότητα CXCL1 προαγωγού πραγματοποιήθηκε με δημιουργήθηκε διάνυσμα KC701LUC και μεταλλάξεις του όπως περιγράφηκε προηγουμένως [23]. Ο καρκίνος των ωοθηκών κύτταρα σε περίπου 50% συρροή σε πλάκες 24-φρεατίων πλύθηκαν μια φορά με φρέσκα μέσα χωρίς πρόσθετα και, στη συνέχεια, παροδικά επιμολυσμένα με φορείς στόχο ή Akt1 siRNA (τελική συγκέντρωση: 10 ηΜ) για 24 ώρες στους 37 ° C χρησιμοποιώντας διάλυμα Lipofectamine. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφεται στο Αποτελέσματα και επωάστηκαν για 6 ώρες. Μετά από ξέπλυμα των κυττάρων με ψυχρό PBS και προσθήκη ρυθμιστικού λύσης (Promega, Madison, WI), λύματα κυττάρων χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας της λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας ένα φωτόμετρο μικροπλάκας. Η δραστικότητα λουσιφεράσης, που εκφράζεται ως σχετικές μονάδες φωτός, ομαλοποιήθηκε να μετρώνται τα επίπεδα της πρωτεΐνης ή τη δραστηριότητα του κάθε εσωτερικού ελέγχου.

Ομοεστιακή Ανάλυση Απεικόνισης

Τα κύτταρα (5000 κύτταρα /250 μΙ μέσου) σπάρθηκαν σε 8 θαλάμων διαφανειών και κυτταρικής προσκόλλησης αφέθηκε όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στα πλακίδια θαλάμου πλύθηκαν 3 φορές σε PBS και μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και αποκλείστηκαν με 1% BSA σε PBS για 30 λεπτά. Το πρωτογενές αντίσωμα εφαρμόστηκε για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου, και στη συνέχεια πλένονται με PBS για 30 λεπτά. Τα πλακίδια πλύθηκαν 3 φορές με PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με το δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με Alexa Fluor 594 ή Alexa Fluor 488 (LI-COR Biotechnology, Lincoln, ΝΕ) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, τα πλακίδια πλύθηκαν 3 φορές με PBS, τοποθετείται με μέσο που περιέχει DAPI (Vector Laboratories, Burlingame CA) στερέωσης και παρατηρήθηκαν με ένα μικροσκόπιο φθορισμού (Nikon A1R λέιζερ συνεστιακή σάρωσης απεικόνισης).

PCR Array και qRT- PCR

Μετά την απομόνωση ολικού RNA και την εξάλειψη των γενωμικού DNA, η αντίδραση RT πραγματοποιήθηκε στους 42 ° C για 15 λεπτά που ακολουθείται από 94 ° C για 5 λεπτά. Μία αντίδραση PCR σε πραγματικό χρόνο για τα γονίδια ή χημειοκινών που συνδέονται κυτταρικού κύκλου διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας ένα Bio-Rad CFX96 (Hercules, CA) και τα ακόλουθα δύο στάδια κυκλικό πρόγραμμα: 1 κύκλος στους 95 ° C για 10 λεπτά, και 40 κύκλους στους 95 ° C για 15 sec και στους 60 ° C για 1 λεπτό. Η ανάλυση των δεδομένων έγινε με βάση μια web-based PCR Array Ανάλυση Δεδομένων (https://pcrdataanalysis.sabiosciences.com/pcr/arrayanalysis.php) που παρέχονται από SABiosciences σε Qiagen (Frederick, MD). Εκκινητές που χρησιμοποιούνται στην qRT-PCR είχαν ως εξής: 5-TGC ΑΓΓ GAA TTC ACC CCA AG-3 (προς τα εμπρός) και 5-GGA TGC ΑΟΟ ΑΤΤ GAG GCA AG-3 (πίσω) για CXCL1 και 5-GCA GGG ΑΑΤ TCA ΚΔ ΥΠΑ G-3 (προς τα εμπρός) και 5-GGG Γ.Ο.Σ. GAG ACA AGC ΤΤΤ C-3 (πίσω) για CXCL2.

Δοκιμασία ανοσοαπορρόφησης με ένζυμο (ELISA)

δραστηριότητας Ανθρωπίνων CXCL1 /2 ήταν μετράται με ένα ανθρώπινο CXCL1 /2 κιτ ELISA (PeproTech, Rocky Hill, NJ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η οπτική πυκνότητα εκάστου φρεατίου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας οριστεί σε 450 nm με διόρθωση μήκους κύματος στα 570 nm.

Μετανάστευση και εισβολή Δοκιμασίες

Καρκινικά κύτταρα (2×10

5 κύτταρα /ml σε RPMI-1640 χωρίς ορό με 1% BSA) που πρόκειται να χρησιμοποιηθούν για μια δοκιμασία μετανάστευσης ή εισβολή σπάρθηκαν στο ένθετο 24 φρεάτων καλλιέργειας κυττάρων Transwell (Greiner Bio-όνη) ή σε Matrigel (BD Biosciences, 1:03 αραιωμένο με PBS) επικαλυμμένα Transwell συστήματος, αντίστοιχα. Το κάτω θάλαμος περιείχε 0,5 ml RPMI συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοοειδών ως χημειοελκτικό. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται στο Αποτελέσματα και στη συνέχεια επωάστηκαν για 24 ώρες. Τα κύτταρα που παρέμειναν στο εσωτερικό του ενθέτου απομακρύνθηκαν με μια μπατονέτα? μεταναστεύει ή εισβάλλοντα κύτταρα επί του φίλτρου μονιμοποιήθηκαν με 3,7% φορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με 0,1% ιώδες κρύσταλλο που ακολουθείται από πλύση των κυττάρων με PBS. Ο αριθμός των μεταναστεύει ή εισβάλλοντα κύτταρα μετρήθηκε κάτω από το μικροσκόπιο (X400) χρησιμοποιώντας 5 τυχαία επιλεγμένα πεδία.

Σχηματισμού Αποικίας

Τα κύτταρα αιωρήθηκαν σε μέσο RPMI που περιείχε 0,4% αγαρόζη σε συγκεντρώσεις 2 × 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός έξι-φρεατίων. Τα αιωρούμενα κύτταρα επιστρώνονται επάνω σε ένα κάτω στρώμα από στερεοποιήθηκε 0,8% αγαρόζη σε μέσο RPMI με 5% FBS και επωάστηκαν για 14 ημέρες. Οι αποικίες βάφτηκαν με 0.05% κρυσταλλικό ιώδες, φωτογραφήθηκαν, και ποσοτικοποιούνται.

εξόντωση CXCR2 με CXCR2 shRNA

ωοθηκών καρκινικά κύτταρα σε περίπου 50% συρροή σε πλάκες 24- ή 6-φρεατίων πλύθηκαν μία φορά με 1% FBS φρέσκα μέσα χωρίς πρόσθετα και, στη συνέχεια, παροδικά επιμολυσμένα με Control ή CXCR2 shRNA (τελική συγκέντρωση: 1 μg /ml) για 72 ώρες στους 37 ° C χρησιμοποιώντας διάλυμα Lipofectamine. Επιμολυσμένα κύτταρα επιβεβαιώθηκε νοκ ντάουν του CXCR2 πρωτεΐνης και να αντιμετωπίζονται όπως περιγράφεται στα αποτελέσματα σύμφωνα με διάφορα πειράματα.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα αναλύθηκαν από το αντιστοιχισμένο Φοιτητών

t-test

και μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ανάλογα με την περίπτωση. Αν μια στατιστική σημαντικότητα (p ≤ 0,05) προσδιορίστηκε με ANOVA, τα δεδομένα αναλύθηκαν περαιτέρω με την κατά ζεύγη συγκρίσεων Tukey να εντοπίζει συγκεκριμένες διαφορές μεταξύ των θεραπειών.

Αποτελέσματα

CXCR2 Θετική κύτταρα έχουν μια ταχύτερη ανάπτυξη ποσοστό και ανταποκρίνονται περισσότερο σε TNF-διεγείρονται κυτταρικού πολλαπλασιασμού σύγκριση με CXCR2 αρνητικά κύτταρα

Εμείς παράγεται CXCR2 θετικό (SKCXCR2) και αρνητικό (SKA) κυτταρικές σειρές από σταθερά την επιμόλυνση του CXCR2 ή κενούς φορείς σε γονική SKOV-3 καρκίνου των ωοθηκών κύτταρα (Σχήματα 1Α και 1Β). Οι ρυθμοί ανάπτυξης στα κύτταρα SKCXCR2 και SKA ήταν παρόμοια για τις πρώτες 24 ώρες της καλλιέργειας, αλλά από 48 και 72 ώρες, SKCXCR2 ρυθμοί ανάπτυξης των κυττάρων ήταν σχεδόν διπλάσια σε σύγκριση με τα κύτταρα SKA (Σχήμα 1C). Δεδομένου ότι ο TNF είναι καλά γνωστό ότι είναι μια προφλεγμονώδης κυτοκίνη εκφράζεται σε αφθονία στον καρκίνο των ωοθηκών [2] – [4], εξετάσαμε τις επιδράσεις του TNF στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα ΣΚΑ και SKCXCR2. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ο TNF αυξήθηκε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα SKCXCR2, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ΣΚΑ (Εικόνα 1D). Με βάση την ανάλυση FACS, τα κύτταρα SKCXCR2 εμφάνισαν μειωμένη G0-G1 φάση και μία αυξημένη φάση S (με μια μικρή αύξηση στη φάση G2-M) σε σύγκριση με κύτταρα ΣΚΑ (Σχήμα 1 Ε). TNF per se, ωστόσο, μειώθηκαν σαφώς SKCXCR2 G0-G1 φάσης (με μια μικρή αύξηση στις φάσεις S και G2-M), ενώ δεν είχε καμία επίδραση στα κύτταρα SKA (Σχήμα 1 Ε).

(Α) CXCR2 έκφραση της πρωτεΐνης σε SKA έναντι κύτταρα SKCXCR2. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και κηλίδες Western εκτελείται χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά προς CXCR2 και β-ακτίνης ως ένας έλεγχος φόρτωσης. (Β) Εκπρόσωπος χρώση ανοσοφθορισμού των SKA έναντι κυττάρων SKCXCR2, υποδεικνύοντας τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης CXCR2 (με πράσινο χρώμα). (Γ) σύγκριση των ρυθμών ανάπτυξης στην SKA έναντι κύτταρα SKCXCR2. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 0, 24, 48 και 72 ώρες και οι ρυθμοί ανάπτυξης κανονικοποιημένη σε 0 h πυκνότητες σε κάθε κυτταρική σειρά. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E. * Και ** (p ≤ 0,05) σε κάθε ομάδα με κατά ζεύγη συγκρίσεις ANOVA και κατά Tukey. # (P ≤ 0,05) μεταξύ των κυττάρων SKA και SKCXCR2 από την αντιστοίχιση του Student

t-test

. (D) Επίδραση TNF επί του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε ΣΚΑ έναντι κυττάρων SKCXCR2. Τα κύτταρα επωάστηκαν με όχημα (έλεγχος) ή TNF (10 ng /ml) για 48 ώρες. Μία δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ΜΤΤ και αξίες ομαλοποιήθηκαν με μη κατεργασθέντες ελέγχους. Τα πειράματα διεξήχθησαν εις τριπλούν και όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E. * (P ≤ 0,05) από Φοιτητών

t-test

. (Ε) οι συνέπειες του TNF σε κυτταρικό κύκλο στάδια G0-G1, S και G2-M στο SKA έναντι κύτταρα SKCXCR2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με όχημα (έλεγχος) ή TNF (10 ng /ml) για 48 ώρες. Η κυτταρομετρία ροής προσδιορισμοί πραγματοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η% των κυττάρων σε κάθε φάση. Τα αντιπροσωπευτικά ιστογράμματα φαίνονται. Διεξήχθησαν πειράματα 5 ανεξάρτητες φορές και τα δεδομένα σε κάθε ένθετο δείχνονται ως μέση τιμή ± S.E. Μπλε και κόκκινα γράμματα δείχνουν σημαντικότητα (p ≤ 0,05) σε σύγκριση με τον έλεγχο SKA και τη θεραπεία του TNF, αντίστοιχα, από Μαθητή

t-test

.

Η

Επιπλέον, ελέγξαμε τα αποτελέσματα του TNF επί του κυτταρικού κύκλου που σχετίζονται γονιδίων σε ΣΚΑ έναντι κυττάρων SKCXCR2. κύτταρα SKCXCR2 είχαν πάνω από 50% μείωση στην κυκλίνη Β1 (0.49), κυκλίνη F (0,38), κυκλίνη G2 (0,47) και ρ21 (0,25) σε σύγκριση με τα κύτταρα ΣΚΑ. TNF δεν είχε σημαντική επίδραση επί των γονιδίων που σχετίζονται με τον κύκλο του κυττάρου σε κύτταρα ελέγχου ΣΚΑ, αλλά οδήγησε σε & gt? 2 φορές αύξηση του GADD45α σε κύτταρα SKCXCR2 (Πίνακας S1). GADD45α έχει δειχθεί ότι είναι ένας μεσολαβητής του συνθετικού ρητινοειδούς απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα καρκινώματος ωοθήκης [24]. Έτσι διάσπαση του GADD45α έχει δειχθεί ότι προάγουν το σχηματισμό σωλήνα και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών κυττάρων [25]. μετανάστευση των κυττάρων και επεμβατικές ικανότητες ήταν πράγματι πολύ υψηλότερες σε εμβρυϊκούς ινοβλάστες GADD45α ανεπάρκεια ποντικού [26]. Με βάση αυτά τα λειτουργικά χαρακτηριστικά του GADD45α, μία επαγόμενη από τον TNF αύξηση GADD45α είναι απίθανο να σχετίζεται με την αυξημένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα SKCXCR2.

CXCR2 θετικά κύτταρα Ενίσχυση ΝΡ-κΒ ενεργοποίηση ακολουθείται από μια αύξηση του CXCR2 προσδεμάτων (CXCL1 και 2), σε σύγκριση με CXCR2 αρνητικά κύτταρα

όπως ΝΡ-κΒ είναι το κύριο μονοπάτι σηματοδότησης για τις λειτουργίες του TNF, μπορούμε επομένως ερευνήθηκε εάν ο TNF-επαγόμενο πολλαπλασιασμό κυττάρων σε κύτταρα που εμπλέκονται SKCXCR2 ΝΡ-κΒ σηματοδότηση. Και τα βασικά και επαγόμενη από τον TNF επίπεδα δραστικότητας προαγωγέα ΝΡ-κΒ ήταν υψηλότερα στα κύτταρα SKCXCR2 (Σχήμα 2Α). Χρώση ανοσοφθορισμού έδειξε ότι τα κύτταρα είχαν περισσότερο SKCXCR2 φωσφορυλιωμένη ΙκΒ σε σύγκριση με κύτταρα ΣΚΑ (Σχήμα 2Β). Από την άλλη πλευρά, η έκφραση ΙκΒ ήταν υψηλότερη σε κύτταρα ΣΚΑ σε σύγκριση με κύτταρα SKCXCR2 (Σχήμα 2Β). Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε ότι τα κύτταρα που εκφράζουν CXCR2 είχαν περισσότερο φωσφορυλιωμένη ΙΚΚ και ΙκΒ (ως άμεσο αποτέλεσμα κατάντη του ΙΚΚ) σε τόσο τη βασική όσο μέλη τους, καθώς και σε απόκριση σε TNF πάροδο του χρόνου (Σχήμα 2C). CXCR2-μεσολαβητική ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ μπορεί να περιλαμβάνει χημειοκίνη συνδετήρες, οι οποίοι περιέχουν θέσεις κΒ σε υποκινητές τους [5] – [6], [23]. Γι ‘αυτό σε σύγκριση με τα προφίλ δικτύου χημειοκινών στα κύτταρα SKA και SKCXCR2 χρησιμοποιώντας μια σειρά PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα κύτταρα SKCXCR2 είχε ένα & gt?. Αύξηση κατά 2 φορές σε προφλεγμονώδεις χημειοκινών CXCL1 και CXCL2 σε σύγκριση με τα κύτταρα SKA (Σχήμα 2D)

(Α) Επίδραση του TNF για τις δραστηριότητες της λουσιφεράσης NF-κΒ σε ΣΚΑ και κύτταρα SKCXCR2. Μετά την επιμόλυνση με χρήση φορέα λουσιφεράσης ΝΡ-κΒ τη διάρκεια της νύχτας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με TNF (10 ng /ml) για 4 ώρες. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση ± S.E. * Και # (p ≤ 0,05) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου και SKA, αντίστοιχα, από το αντιστοιχισμένο Φοιτητών

t-test

. (Β) Αντιπροσωπευτική χρώση ανοσοφθορισμού των κυττάρων ΣΚΑ και SKCXCR2 υποδεικνύοντας ενεργοποίηση ΙκΒ και τα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης CXCR2 (σε πράσινο). (C) Επίδραση TNF (10 ng /ml) συναρτήσει του χρόνου (0-120 λεπτά) για την ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΣΚΑ και SKCXCR2. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και κηλίδες Western εκτελείται χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για ΙκΒ και ΙΚΚ, καθώς και φωσφορυλιωμένες μορφές τους (pIκB και Pikk). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. συγκρίσεις προφίλ (D) χημειοκινών στην SKCXCR2 σε σχέση με τα κύτταρα SKA. Μετά την απομόνωση ολικού RNA, ένα ανθρώπινο χημειοκίνης συστοιχία PCR πραγματοποιήθηκε. Η διακεκομμένη γραμμή υποδεικνύει μία αύξηση κατά 2-φορές? εκείνοι με ένα & gt? 2πλάσια αύξηση και όρια μέσης κύκλο & lt? 30 αναγνωρίζονται ως επάγονται χημειοκίνες, και σε αυτή την περίπτωση αντιπροσωπεύει CXCL1 και 2 (*)

Η

CXCR2 θετικά Κύτταρα Αύξηση CXCL1 /2. , και εμπλέκονται στην κυτταρικού πολλαπλασιασμού και της αύξησης της μετανάστευσης, εισβολή και αποικία Σχηματισμός σύγκριση με CXCR2 αρνητικά κύτταρα

Εμείς επιβεβαίωσε ότι τα κύτταρα SKCXCR2 παράγονται περισσότερα CXCL1 και CXCL2 από τα κύτταρα SKA από qRT-PCR και δοκιμασία ELISA (Σχήματα 3Α και 3Β). Αν και τα κύτταρα SKCXCR2 είχε μια μεγαλύτερη αύξηση στην CXCL2 από CXCL1 στο επίπεδο του mRNA (Σχήμα 3Α), όσο συνολικής πρωτεΐνης, υπήρχε περισσότερο συνολικής πρωτεΐνης CXCL1 (Σχήμα 3Β) από CXCL2, πιθανώς προκύπτουν από μεγαλύτερη ποσότητα CXCL1 mRNA (Εικόνα 2D ). Με βάση την υποτιθέμενη CXCR2-NF-κΒ-CXCL1 σύνδεση /2, ελέγξαμε αν CXCL1 ή αντισώματος επηρεάζεται πολλαπλασιασμό των κυττάρων του με διαφορετικό τρόπο στα κύτταρα SKA και SKCXCR2. Η προσθήκη CXCL1 δεν είχε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα ΣΚΑ αλλά αύξησε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων SKCXCR2 (Σχήμα 3C). Επίσης, ενώ μια αντίσωμα τηγάνι για CXCL1 /2/3 δεν είχε επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα ΣΚΑ μειώθηκε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό σε κύτταρα SKCXCR2 (Σχήμα 3D). Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε ότι το τηγάνι αντίσωμα μείωσε CXCL1 και mRNA CXCL2 στα κύτταρα SKCXCR2 (Σχήμα 3Ε). Επειδή ο άξονας CXCL1-CXCR2 βρέθηκε για την προώθηση του γαστρικού εισβολή του όγκου [15], συγκρίναμε τις μετανάστευση και την εισβολή των δυνατοτήτων των κυττάρων SKA και SKCXCR2. κύτταρα SKCXCR2 είχαν αυξημένη μετανάστευση και την εισβολή ιδιότητες σε σύγκριση με τα κύτταρα SKA (Εικόνες 3F και 3G). Με βάση την αυξημένη μετανάστευση και την εισβολή στα κύτταρα SKCXCR2, ελέγξαμε περαιτέρω ένα μαλακό σχηματισμό άγαρ αποικία για να εντοπίσει αν υπήρχε ένα υψηλότερο κακοήθη μετασχηματισμό στα κύτταρα SKCXCR2, και διαπίστωσε ότι τα κύτταρα SKCXCR2 παράγονται περισσότερες αποικίες από τα κύτταρα SKA (Σχήμα 3Η).

(Α) Επιβεβαίωση της CXCL1 και της έκφρασης CXCL2 στα κύτταρα SKA και SKCXCR2 από qRT-PCR. Μετά την απομόνωση ολικού RNA, qRT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές για CXCL1 και CXCL2. συγκεντρώσεις (Β) Κυτταρική CXCL1 και CXCL2 σε κύτταρα ΣΚΑ και SKCXCR2 επί μία περίοδο 24 h. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και ELISA διεξάγεται χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για CXCL1 και CXCL2 και οι τιμές ομαλοποιήθηκαν προς συνολική πρωτεΐνη. (C) Επίδραση της CXCL1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε ΣΚΑ και SKCXCR2 κυττάρων για 48 ώρες επώασης. (D) Επίδραση τηγάνι αντισώματος για CXCL1 /2/3 σχετικά με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα SKA και SKCXCR2. Τα κύτταρα επωάστηκαν με κανονικό IgG (έλεγχος) και τηγάνι αντίσωμα (1:100 αραίωση) επί 48 ώρες. Η δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ΜΤΤ και οι τιμές ομαλοποιήθηκαν προς μη κατεργασμένους ελέγχους. (Ε) Επίδραση του τηγανιού αντισώματος για CXCL1 /2/3 για CXCL1 και έκφραση CXCL2 στα κύτταρα SKCXCR2 από qRT-PCR. Μετά από επεξεργασία με τηγάνι αντίσωμα για 24 ώρες και στη συνέχεια απομόνωση ολικού RNA, qRT-PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές για CXCL1 και CXCL2. (F) τα χαρακτηριστικά της μετανάστευσης μεταξύ των κυττάρων SKA και SKCXCR2. χαρακτηριστικά (G) Εισβολή μεταξύ των κυττάρων SKA και SKCXCR2. (H) Σύγκριση του σχηματισμού αποικιών μεταξύ των κυττάρων SKA και SKCXCR2. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E. * Και # (p ≤ 0,05), όπως υπολογίζεται από Φοιτητών

t-test

.

Η

CXCR2 θετικά κύτταρα μετενεργοποιήσει EGFR σε μεγαλύτερο βαθμό, με αποτέλεσμα Akt ενεργοποίησης που συμβάλλει στην ΝΡ κΒ Σηματοδοσίας

Δεδομένου ότι εδείχθη ότι CXCL1 μπορεί να διεγείρει τον πολλαπλασιασμό σε επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα ωοθηκών από διενεργοποίησης του EGFR [27], συγκρίναμε μετενεργοποίηση EGFR σε κύτταρα ΣΚΑ και SKCXCR2. κύτταρα SKCXCR2 είχε ένα μεγαλύτερο επίπεδο της φωσφορυλιωμένης EGFR, με αποτέλεσμα σε μεγαλύτερη ενεργοποίηση Akt, αλλά υπήρξε μικρή επίδραση στα επίπεδα Perk (Εικόνα 4Α). Ομοεστιακή απεικόνιση αποκάλυψε ότι τα κύτταρα είχαν περισσότερο SKCXCR2 φωσφορυλιωμένη Akt σε σύγκριση με κύτταρα ΣΚΑ (Σχήμα 4Β). Από Akt και ERK μονοπάτια αφορούν την κυτταρική επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό, ελέγξαμε τα συγκριτικά αποτελέσματα των αναστολέων ΡΙ3Κ /Akt ή Erk επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα ΣΚΑ και SKCXCR2. Παρά το γεγονός ότι AG-1478, LY294002 και PD98059 εξασθενημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων και στα δύο κύτταρα SKA και SKCXCR2, τα αποτελέσματά τους στον πολλαπλασιασμό ήταν πολύ μεγαλύτερη στα κύτταρα SKCXCR2 (Σχήμα 4C). Στη συνέχεια προσδιορίζεται αν κατάντη αναστολείς του EGFR που επηρεάζονται δράση προαγωγού NF-κΒ στα κύτταρα SKA και SKCXCR2. AG-1478, ένας ειδικός αναστολέας της κινάσης EGFR, δεν είχε σημαντική επίδραση επί της δραστικότητας προαγωγού του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΣΚΑ, αλλά εξασθένησε την δραστηριότητα σε CXCR2 θετικά κύτταρα σε έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 4D). Παρά το γεγονός ότι LY294002, ένας εξαιρετικά εκλεκτικός ΡΙ3Κ αναστολέα που εμποδίζει την ενεργοποίηση Akt, εξασθενημένη δραστικότητα προαγωγέα ΝΡ-κΒ και στους δύο τύπους κυττάρων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, είχε μια μεγαλύτερη ανασταλτική επίδραση σε αυτή την δραστηριότητα σε κύτταρα SKCXCR2. Είναι ενδιαφέρον, PD98059, ένας ειδικός αναστολέας Erk, δεν είχε σημαντική επίδραση επί της δραστικότητας προαγωγού ΝΡ-κΒ σε είτε τον κυτταρικό τύπο (Εικόνα 4D). Εμείς επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα των ειδικών αναστολέων για EGFR, Akt και ενεργοποίηση Erk (Σχήμα 4Ε).

(Α) Σύγκριση της ενεργοποίησης EGFR σε κύτταρα SKA και SKCXCR2. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και κηλίδες Western διεξάγεται χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για EGFR, Akt, ΕΚΚ και τις φωσφορυλιωμένες μορφές (pEGFR, pAkt και Perk). Τα μη-φωσφορυλιωμένες μορφές χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχοι φόρτωσης. (Β) Εκπρόσωπος χρώσης ανοσοφθορισμού δείχνει την ενεργοποίηση Akt και τα επίπεδα έκφρασης της πρωτεΐνης CXCR2 σε κύτταρα SKA και SKCXCR2. (C) Συγκριτική επιδράσεις των AG-1478, LY294002 και PD98059 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα ΣΚΑ και SKCXCR2. Τα κύτταρα επωάστηκαν με όχημα (έλεγχος), AG-1478 (AG, 2 μΜ), LY294002 (LY, 2 μΜ) ή PD98059 (PD, 20 μΜ) για 48 ώρες. Η δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση ΜΤΤ και οι τιμές ομαλοποιήθηκαν προς μη κατεργασμένους ελέγχους. * Και # (p ≤ 0,05) σε σύγκριση με τους μάρτυρες (C) και τα κύτταρα SKA, αντίστοιχα, από Μαθητή

t-test

. (D) Δόση εξαρτώμενη επιδράσεις των αναστολέων EGFR κατάντη σχετικά με τις δραστηριότητες της λουσιφεράσης ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΣΚΑ και SKCXCR2. Μετά την επιμόλυνση με τον φορέα λουσιφεράσης ΝΡ-κΒ τη διάρκεια της νύχτας, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AG-1478 (αναστολέας του EGFR, 0, 0,5, 1 και 2 μΜ), LY294002 (αναστολέας Akt, 0, 0,5, 1 και 2 μΜ) ή ΡΟ98059 (αναστολέας Erk , 0, 5, 10 και 20 μΜ) για 4 ώρες. * Και # (p ≤ 0,05) σε σύγκριση με τους μάρτυρες (0 ώρες) και τα κύτταρα SKA, αντίστοιχα, από το Φοιτητικό

t-test

. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν τουλάχιστον εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± S.E. (Ε) Επιβεβαίωση των ειδικών αναστολέων για EGFR, Akt και ενεργοποίηση Erk στα κύτταρα SKA και SKCXCR2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με AG-1478 (2 μΜ), LY294002 (2 μΜ) και PD98059 (20 μΜ) για 4 ώρες. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και μια κηλίδα western πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για EGFR, Akt, ΕΚΚ και φωσφορυλιωμένες μορφές τους (pEGFR, pAkt και Perk). Μη φωσφορυλιωμένη μορφές χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες φόρτωσης.

Η

CXCL1 Ενισχύει NF-κΒ ενεργοποίησης σε CXCR2 Εκφράζοντας κύτταρα η οποία αυξάνει CXCL1 υποστηρικτής Δραστηριότητα μέσω NF-κΒ ιστοσελίδας

Για να διευκρινιστεί η συμμετοχή της ΝΡ-κΒ σηματοδότηση στον άξονα CXCL1-CXCR2, ελέγξαμε τα συγκριτικά αποτελέσματα του προστιθέμενου CXCL1 στην ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΣΚΑ και SKCXCR2. CXCL1 παρήγαγε περισσότερο φωσφορυλιωμένη ΙκΒ σε κύτταρα SKCXCR2 συγκριτικά με κύτταρα ΣΚΑ (Σχήμα 5Α). Επιπλέον, ένα αντίσωμα CXCL1 /2/3 δεν είχε κανένα αποτέλεσμα επί της δραστικότητας προαγωγού του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΣΚΑ αλλά μειώθηκαν σημαντικά αυτή τη δραστηριότητα στα κύτταρα SKCXCR2 (Σχήμα 5Β). Με βάση την εμπλοκή του ΝΡ-κΒ στον άξονα CXCL1-CXCR2, συγκρίναμε επιδράσεις των Bay11-7082, ένας ειδικός αναστολέας του ΝΡ-κΒ, στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα ΣΚΑ και SKCXCR2. Bay11-7082 δεν είχε καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε κύτταρα ΣΚΑ αλλά μειώθηκαν σημαντικά τον πολλαπλασιασμό σε κύτταρα SKCXCR2 (Σχήμα 5C). Η αναστολή ήταν μέγιστη στα κύτταρα SKCXCR2, πιθανώς λόγω της υψηλότερης ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ στα κύτταρα αυτά (Σχήματα 2Α-C). Επιπλέον, συγκρίναμε τις επιδράσεις της Bay11-7082 σε ένα κύτταρο εισβολή CXCL1 επαγόμενη. Παρά το γεγονός ότι CXCL1 είχε μικρή επίδραση στην κυτταρική εισβολή στα κύτταρα SKA, οι διαφορές δεν ήταν σημαντικές (Σχήμα 5D). Από την άλλη πλευρά, τα κύτταρα SKCXCR2 είχε τουλάχιστον διπλασιασμό του αριθμού των κυττάρων εισβολής σε απόκριση CXCL1 σύγκριση με τους μάρτυρες (Εικόνα 5D). Bay11-7082 μπλοκάρει επίσης την κυτταρική εισβολή CXCL1-επάγεται σε κύτταρα SKCXCR2 (Σχήμα 5D), που υποδεικνύουν την εμπλοκή του ΝΡ-κΒ σηματοδότηση.

(Α) Συγκριτική επιδράσεις της CXCL1 στην ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε κύτταρα ΣΚΑ και SKCXCR2 . Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CXCL1 (100 ng /ml) και τα αποτελέσματα εξετάζονται σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Λύματα ολόκληρων κυττάρων παρασκευάστηκαν και κηλίδες Western εκτελείται χρησιμοποιώντας αντισώματα ειδικά για ΙκΒ, φωσφορυλιωμένη ΙκΒ (pIκB) και CXCR2. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Επίδραση των CXCL1 /02.03 αντισώματος για τις δραστηριότητες της λουσιφεράσης NF-κΒ στα κύτταρα SKA και SKCXCR2. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.