Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι ασθενείς με

KRAS

μεταλλάξεις δεν ανταποκρίνονται στον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (αναστολείς EGFR) και αδυνατούν να επωφεληθούν από επικουρική χημειοθεραπεία. ανάλυση μετάλλαξη του

KRAS

είναι απαραίτητη πριν από την έναρξη της θεραπείας με μονοκλωνικά αντι-EGFR αντισώματα σε ασθενείς με μεταστατικό καρκίνο του παχέος εντέρου (mCRC). Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να αναπτυχθεί μια δοκιμασία πολλαπλής αλληλόμορφο-ειδική PCR (MAS-PCR) για την ανίχνευση

KRAS

μεταλλάξεις.

Μέθοδοι

Έχουμε αναπτύξει ένα ενιαίο σωλήνα δοκιμασία MAS-PCR για την ανίχνευση των επτά

KRAS

μεταλλάξεις (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, και G13D). Πραγματοποιήσαμε ανάλυση προσδιορισμού MAS-PCR για

KRAS

στο DNA που απομονώθηκε από 270 φορμόλη-σταθερής εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) του παχέος καρκινικούς ιστούς. Ακολουθίες όλων των 270 δειγμάτων προσδιορίστηκαν με Pyrosequencing. Επτά γνωστά δείγματα DNA από σημείο μετάλλαξης αραιώνεται με άγριου τύπου DNA αναλύθηκαν για να προσδιοριστεί ο περιορισμός του εντοπισμού και της αναπαραγωγιμότητας της δοκιμασίας MAS-PCR.

Αποτελέσματα

Συνολικά, τα αποτελέσματα της ομάδας κύριων δοκιμασία PCR ήταν σε καλή συμφωνία με Pyrosequencing, και μόνο επτά ασύμφωνα δείγματα βρέθηκαν. Η δοκιμασία MAS-PCR ανιχνεύεται αναπαραγώγιμα 1 έως 2% μεταλλαγμένα αλληλόμορφα. Οι πιο κοινές μεταλλάξεις ήταν G13D στο κωδικόνιο 13 (49.17%), G12D (25,83%) και G12V (12,50%) στο κωδικόνιο 12.

Συμπέρασμα

Ο προσδιορισμός MAS-PCR παρέχει μια γρήγορη , οικονομικά αποδοτική και αξιόπιστη διαγνωστικό εργαλείο για την ακριβή ανίχνευση της

KRAS

μεταλλάξεις στη ρουτίνα FFPE ιστούς καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Seekhuntod S, Thavarungkul P, Chaichanawongsaroj Ν (2016) Επικύρωση ένα multiplex αλληλο-ειδικό Polymerase Chain Δοκιμασία Αντίδραση για την ανίχνευση του

KRAS

γονιδιακών μεταλλάξεων σε φορμόλη-Σταθερή, ιστούς παραφίνης από καρκίνο του παχέος εντέρου ασθενείς. PLoS ONE 11 (1): e0147672. doi: 10.1371 /journal.pone.0147672

Επιμέλεια: Hiromu Suzuki, Σαπόρο Ιατρικό Πανεπιστήμιο, ΙΑΠΩΝΙΑ

Ελήφθη: 31 του Οκτωβρίου 2015? Αποδεκτές: 6 Ιαν του 2016? Δημοσιεύθηκε: 26η Ιανουαρίου 2016

Copyright: © 2016 Seekhuntod et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. SS υποστηρίχθηκε από την 90η επέτειο του ταμείου Πανεπιστημίου Chulalongkorn (Ratchadaphiseksomphot Endowment Ταμείου, GCUGR1125572134) και NC υποστηρίχθηκε από τη Σχολή της Allied Ταμείο Επιστημών Υγείας το 2014 (AHS-CU 58004). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο ορθοκολικός καρκίνος (CRC) είναι η πιο κοινή μορφή καρκίνου και η τρίτη κύρια αιτία θανάτου από καρκίνο στον κόσμο [1]. Στην Ταϊλάνδη, CRC είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου μεταξύ των ανδρών και η πέμπτη πιο κοινή μεταξύ των γυναικών [2, 3]. Ένα από τα σημαντικότερα μοριακών οδών στην ανάπτυξη του CRC είναι η διέγερση μιας μετάλλαξης ενεργοποίησης στο

KRAS

(Kirsten σάρκωμα αρουραίου ιικό ογκογονίδιο) πρωτο-ογκογονιδίου [4, 5]. Η

KRAS

γονίδιο είναι μέλος του

RAS

οικογένεια γονιδίων και κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη RAS 21-kDa, που είναι μεταγενέστερος σήμα GTP-δεσμευτική πρωτεΐνη στον υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGFR) μεταγωγή οδό. Οι ογκογόνες μορφές του

KRAS

μεταλλάξεις εκφράζουν συστατικώς την δραστική πρωτεΐνη RAS οδηγούν σε αυξημένη κυτταρική διαίρεση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την πρόληψη της διαδικασίας απόπτωσης, διέγερση αγγειογένεσης και αυξημένη μετάσταση [6]. Πρόσφατα, θεραπείες του καρκίνου έχουν αναπτυχθεί με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων, συμπεριλαμβανομένων cetuximab και panitumumab, να στοχεύσουν το EGFR [7, 8]. Αυτοί οι παράγοντες έχουν σχεδιαστεί για να εμποδίσει την ενεργοποίηση της τυροσίνης κινάσης του EGFR που επάγεται με συνδέτη και, έτσι, αναστέλλουν κατάντη σηματοδότησης [9]. Ωστόσο, μόνο το CRC με άγριου τύπου

KRAS

πρωτο-ογκογονίδιο ανταποκρίνεται στη θεραπεία αντι-EGFR αντισώματα, ενώ δεν συμβαίνει θεραπευτική ανταπόκριση στο CRC με

KRAS

μεταλλάξεις [9-11]. Η Ευρωπαϊκή Εταιρεία Ιατρικής Ογκολογίας και η Αμερικανική Εταιρεία Κλινικής Ογκολογίας έχουν δημιουργήσει μεγάλες κατευθυντήριες γραμμές της ογκολογίας που τα αντισώματα αυτά να περιορίζεται σε ασθενείς με

KRAS

άγριου τύπου του παχέος εντέρου [12, 13]. Ως εκ τούτου, η ανίχνευση του

KRAS

γονιδιακών μεταλλάξεων έχει κρίσιμη κλινική σημασία για την ανάπτυξη εξατομικευμένων ασθενή θεραπευτικές στρατηγικές [7].

έχουν αναπτυχθεί για την ανίχνευση

Διάφορες μοριακές μεθόδους KRAS

μεταλλάξεις. Αυτές οι μέθοδοι περιλαμβάνουν άμεση αλληλούχιση [10], σε πραγματικό χρόνο PCR [11], υψηλής ανάλυσης λιώσιμο (HRM) [14], η ενίσχυση αλύσου πολυμεράσης σύστημα μετάλλαξη αντίδραση πυρίμαχου [15, 16], Pyrosequencing [17, 18], συν-ενίσχυσης σε χαμηλότερη θερμοκρασία αποδιάταξης PCR [19], μεταλλαγμένη εμπλουτισμένο PCR [20], και για την ψηφιακή PCR [21]. Επιπλέον, αρκετές εμπορικές μοριακό κιτ είναι συνήθως διαθέσιμα για

KRAS

ανίχνευσης μετάλλαξης, συμπεριλαμβανομένων των Cobas

® KRAS Mutation Test [22], 3D-Gene

® KRAS κιτ προσδιορισμού μετάλλαξη, TheraScreen

® KRAS RGQ PCR Kit [23], KRAS μεταλλάξεων Ανάλυση Kit EntroGen για Real-Time PCR [23], και Kit V2.0 KRAS PyroMark Q96 [24]. Ωστόσο, όλες αυτές οι μέθοδοι απαιτούν τεχνογνωσία και εξειδικευμένο εξοπλισμό και μέσα, και είναι πάρα πολύ ακριβό, όπως προγνωστικά και διαγνωστικά εργαλεία για τους ασθενείς με καρκίνο στις αναπτυσσόμενες χώρες. Αντίθετα, Multiplex αλληλόμορφο-ειδική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (MAS-PCR) είναι μια απλή, αξιόπιστη και φθηνή μέθοδο για την ανίχνευση των γνωστών μεταλλάξεων και μονού νουκλεοτιδίου πολυμορφισμός [25, 26]. MAS-PCR χαρακτηρίζεται από εκκινητές με ένα αλληλόμορφο-ειδική 3 ‘άκρο που αναδιατάσσεται ειδικά μεταλλαγμένων ή μήτρα DNA άγριου τύπου μόνο [26, 27]. Άγριου-τύπου και αλληλόμορφο-ειδικών εκκινητών παράγουν διαφορετικού μεγέθους PCR προϊόντα που επιτρέπουν την εύκολη ανίχνευση μιας γνωστής μετάλλαξης γονιδίου.

Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αναπτύξει μια δοκιμασία MAS-PCR για την ανάλυση της κατάστασης μεταλλάξεων του

KRAS

κωδικόνια 12 και 13. μεταλλάξεις ενός σημείου νουκλεοτιδίων στο

KRAS

γονιδίου συμβαίνουν πιο συχνά στα κωδικόνια 12 και 13 αντιπροσωπεύουν το 80 έως 82% και 15 έως 17% των μεταλλάξεων, αντίστοιχα [28-31 ]. Μεταλλάξεις σε άλλες θέσεις, όπως κωδικόνια 61, 117, 146 και 154, είναι πολύ λιγότερο συχνή ύψους περίπου 1% του συνόλου των

KRAS

γονιδιακές μεταλλάξεις [17, 32]. Σε αυτή τη μελέτη, η παρουσία από τις πιο κοινές μεταλλάξεις σημείου στα κωδικόνια 12 και 13, οι οποίες είναι G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, και G13D [18, 30, 32, 33], αξιολογήθηκε σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, δείγματα ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη από 270 ασθενείς CRC. Pyrosequencing, μια ισχυρή και ευαίσθητη μέθοδος, χρησιμοποιήθηκε ως μέθοδος αναφοράς για τη σύγκριση της ευαισθησίας της δοκιμασίας MAS-PCR για την ανίχνευση των

KRAS

μεταλλαγμένα αλληλόμορφα.

Υλικά και Μέθοδοι

Προετοιμασία κλινικά δείγματα

φορμόλη-σταθερό, παραφίνη-ενσωματωμένες αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου από 270 ασθενείς με CRC συλλέχθηκαν από το Ινστιτούτο Παθολογίας, Υπουργείο Δημόσιας Υγείας, Μπανγκόκ, Ταϊλάνδη. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Ινστιτούτου Παθολογίας (ΕΟΠ-KM-R57-007). Η επιτροπή δεοντολογίας παραιτηθεί από την ανάγκη για συναίνεση, διότι τα δεδομένα των δειγμάτων ιστού αναλύθηκαν ανώνυμα και να αναφέρεται. Ένας έμπειρος παθολόγος αναθεωρηθεί και επισημαίνονται οι τομείς αδενοκαρκίνωμα των αιματοξυλίνη και ηωσίνη βάφονται διαφάνειες. Οι όγκοι χειροκίνητα μικρο-ανατομή από μπλοκ εγκλεισμένο σε παραφίνη, και 10 μm πάχους τομές συλλέχθηκαν σε ένα σωλήνα 1.5 ml. Παραφίνη απομακρύνθηκε από τα κομμάτια ιστού με ξυλόλιο, και τα δείγματα ξηραίνονται στον αέρα. DNA εκχυλίστηκε από τα δείγματα και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας ένα QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ποσότητα DNA προσδιορίστηκε με NanoDrop φασματοφωτομετρία (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE).

Ενίσχυση PCR και Pyrosequencing

Pyrosequencing για την ανάλυση ενός

KRAS

γονίδιο τεμάχιο που εκτείνεται κωδικόνια 12 και 13 διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως με ορισμένες τροποποιήσεις [18]. Ακολουθίες των εκκινητών είχαν προηγουμένως περιγραφεί [18]. Οι συνθήκες αντίδρασης με 1 μΜ πρόσθιου εκκινητή (5′-GGCCTGCTGAAAATGACTGAA-3 ‘), βιοτινυλιωμένο αντίστροφο εκκινητή (5′-βιοτίνη-TTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT-3’), και 50 έως 100 ng /μl προτύπου DNA απέδωσε ένα 82-bp προϊόν. Οι αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα PCR που περιέχει 1χ 2,5 mM ΜαΟΙ

2, 0.2 mM dNTP (BioLabs, England), και 0,625 U Amplitag Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems, USA) σε 30 μΐ συνολικού όγκου. Οι συνθήκες PCR ήταν ένα βήμα μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 λεπτά, κατόπιν 1 λεπτό στους 95 ° C, 1 λεπτό στους 55 ° C, 1 λεπτό στους 72 ° C για 35 κύκλους, που ακολουθούνται από 7 λεπτά στους 72 ° C. Τα προϊόντα της PCR επιβεβαιώθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου 8% στους 140 V για 40 λεπτά, και τα πηκτώματα χρώστηκαν με SYBR Green Ι Nucleic Acid Stain Gel (1: 400, Lonza, USA) για 30 λεπτά. Τα προϊόντα PCR αλληλουχήθηκαν με Pyrosequencing χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο PyroMark Gold Q96 (Qiagen, Germany). Τα προϊόντα της PCR σε 30 μΙ αναμίχθηκαν με 3 μΐ στρεπταβιδίνη-συζευγμένη Sepharose σφαιρίδια (Streptavidin Sepharose ΗΡ, Amersham Biosciences ΑΒ, Σουηδία), ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης 40 μΐ και 17 μΐ αποσταγμένο νερό, ακολουθούμενη από ανακίνηση σε 1400 rpm για 10 λεπτά. Τα ακινητοποιημένα βιοτινυλιωμένα προϊόντα PCR: στρεπταβιδίνη συζευγμένη με Sepharose σφαιρίδια συμπλέγματα συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα εργαλείο prep κενό. Μονόκλωνο καθαρισμού DNA επιτεύχθηκε με 1χ πλύσιμο το prep διαδοχικά εργαλείο κενού με 70% αιθανόλη για 5 s, διάλυμα μετουσίωσης για 5 s, και ρυθμιστικό διάλυμα έκπλυσης για 10 s. Βιοτινυλιωμένη μονόκλωνου DNA προστέθηκε σε πλάκα μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων που περιείχε 40 μΙ 0,4 μΜ αλληλούχιση PF1-εκκινητή (5′-TGTGGTAGTTGG AGCTG-3 ‘) για την ανάλυση στα νουκλεοτίδια 35 και 38 θέσεις, και ΡΡ2-εκκινητή (5 «-TGTGGTAGTTGGAGCT-3 ‘) για την ανάλυση στο νουκλεοτίδιο 34 θέση [18]. Η πλάκα επωάστηκε στους 80 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενη από ψύξη σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά, και φορτώθηκε στο σύστημα PyroMark Q96 ID (Qiagen, Germany).

DNA Cloning

γονιδιακού DNA από οκτώ κλινικών δειγμάτων που φιλοξενούν

KRAS

άγριου τύπου DNA και επτά σημειακές μεταλλάξεις στο

KRAS

κωδικόνια 12 και 13 (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, και G13D) υποβλήθηκαν σε ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας καθολική

KRAS

εκκινητές (K-

ras

-codon 12/13-F 5′-CTG GTG GAG ΤΑΤ TTG ΑΤΑ ΟΤΟ ΤΑΤ Τ-3 ‘και K-

ras

-codon 12/13-R 5′-ATC TGT ATC ΑΑΑ GAA TGG TCC TG-3 ‘). Όλα τα 259-bp PCR προϊόντα κλωνοποιήθηκαν σε PSC-Α-amp /kan φορέα και μετασχηματίστηκε σε ικανά

Escherichia coli

κύτταρα χρησιμοποιώντας ένα κιτ κλωνοποίησης Strataclone PCR (Agilent Technologies? Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Τα μετασχηματισμένα βακτήρια απλώθηκαν σε εκλεκτικών πλακών LB-άγαρ (Oxoid, USA) με αμπικιλλίνη και Χ-Gal (Promega, USA). Μετά από ολονύκτια επώαση στους 37 ° C, επελέγησαν λευκές αποικίες τυχαία και καλλιεργήθηκαν σε μέσο LB, όλη τη νύκτα. Πλασμίδια εξήχθησαν χρησιμοποιώντας Οδηγό

® γονιδιωματικής κιτ καθαρισμού DNA (Geneaid, Ταϊπέι, Ταϊβάν) και στη συνέχεια ελέγχονται για το θραύσμα ένθετο με PCR. προϊόντα Θετικά PCR αλληλουχήθηκαν από το Bioneer Corporation, Daejeon, Δημοκρατία της Κορέας.

Primer Σχεδιασμός

Αλληλόμορφο-ειδική (AS) εκκινητές σχεδιάστηκαν για κάθε μία από επτά μεταλλάξεις, και μια μετάλλαξη μη εξειδικευμένη περιοχή χρησιμοποιήθηκε ως αμπλικονίου αναφοράς. τερματικό βάσης της 3 ‘του καθενός ως αστάρι εκδόθηκε σύμφωνα με την αντίστοιχη μετάλλαξη του. αντιδράσεις ενίσχυσης πραγματοποιήθηκαν με το κύριο

KRAS

προς τα εμπρός εκκινητή και πέντε ως εκκινητές (G12R-F, G12C-F, G12D-F, G12A-F, και G13D-F) που μοιράζονται με ένα κοινό αντίθετης φοράς

KRAS

αντίστροφο εκκινητή, και οι αντιδράσεις με δύο AS-εκκινητές (G12S-R και G12V-R) ανταλλαγή με μία κοινή λογική

KRAS

προς τα εμπρός εκκινητή (Σχήμα 1). Οι αλληλουχίες των εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή παρατίθενται στον Πίνακα 1. Όλα τα εναύσματα συντέθηκαν και παρέχονται από BioDesign Co., Ltd. (BioDesign, Pathumthani, Ταϊλάνδη).

Οι θέσεις των εκκινητών που απεικονίζεται. Ως εναύσματα μοιράζονται την ίδια προς τα εμπρός εκκινητή ή αντίστροφο εκκινητή. Στερεά βέλη υποδεικνύουν την προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές. τελική βάση 3 ‘εκάστου ως εκκινητές προσαρμόστηκε σύμφωνα με αντίστοιχη μετάλλαξη της και είναι έντονα και υπογραμμισμένα. Τα κωδικόνια και μεταλλαγμένες βάσεις έχουν υπογραμμισθεί.

Η

Multiplex αλληλο-ειδικό PCR (MAS-PCR) Δοκιμασία

Μια ενιαία αντίδραση είχε δύο κύριους

KRAS

εκκινητών και επτά ως εναύσματα που στοχεύουν σε επτά μεταλλαγμένα νουκλεοτίδια εντός του

KRAS

γονίδιο. Η αντίδραση MAS-PCR σε 50 μΙ συνολικός όγκος περιείχε ρυθμιστικό 1χ PCR, 2.5 mM MgCl

2, 0.2 mM dNTP (BioLabs, England), 0.625 U Amplitag Gold DNA Polymerase (Applied Biosystems, USA), 50 έως 100 ng /μl προτύπου DNA. Οι βελτιστοποιημένες συγκεντρώσεις από κάθε εκκινητή φαίνονται στον Πίνακα 1. Η αντίδραση ενισχύθηκε υπό τις ακόλουθες συνθήκες: ένα αρχικό στάδιο μετουσίωσης στους 95 ° C για 10 λεπτά, ακολουθούμενη από 10 κύκλους στους 95 ° C για 30 s, 60 ° C για 45 s, 72 ° C για 60 s, ένα δεύτερο βήμα από 20 κύκλους στους 95 ° C για 30 s, 64 ° C για 45 s, 72 ° C για 60 s, και ένα τρίτο βήμα 20 κύκλους στους 95 ° C για 30 s, 55 ° C για 45 s, 72 ° C για 60 s, και τέλος 10 λεπτά στους 72 ° C. Μετά την ενίσχυση, τα αμπλικόνια με όγκο φόρτωσης 20 μΙ αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση πηκτώματος πολυακρυλαμιδίου 8% στους 140 V για 60 λεπτά, και τα πηκτώματα χρώστηκαν με SYBR Green Ι Nucleic Acid Gel Stain (1: 400, Lonza, USA) για 30 min. Λόγω του 3 ‘άκρου του καθένα όπως ζεύγη εκκινητών με την αντίστοιχη βάση νουκλεοτιδίου στην μεταλλαγμένη αλληλουχία του

KRAS

γονιδίου, το αλληλόμορφο-ειδικό θραύσμα ενισχύθηκε δώσουν μια από 97-bp, 91-bp, 89- bp, 85-bp, 83-bp, 68 bp και 64 bp προϊόντα (εκπρόσωποι των G12C, G12D, G13D, G12R, G12A, G12V, και G12S μεταλλάξεις, αντίστοιχα), μαζί με το θετικό 113-bp μπάντα ως εσωτερική έλεγχος. Ενώ άγριου τύπου DNA σε οποιαδήποτε από τις επτά θέσεις αποτρέπει αλληλόμορφο-ειδική ενίσχυση με αποτέλεσμα μια αντίστοιχη λείπει ζώνη (Σχήμα 2).

Δοκιμασία διακρίνεται άγριου τύπου

KRAS

γονίδιο κωδικόνια 12 και 13 από διαφορετικές μεταλλάξεις χρησιμοποιώντας ως εκκινητές. Λωρίδα Μ: Χαμηλό βάρος DNA σκάλα μοριακού? Διαδρομή 1: αρνητικό έλεγχο? Λωρίδα 2: άγριου-τύπου? Διαδρομή 3: G12S μεταλλαγμένα? Διαδρομή 4: G12R μεταλλαγμένα? Διαδρομή 5: G12C μεταλλαγμένα? Λωρίδα 6: G12D μεταλλαγμένα? Διαδρομή 7: G12A μεταλλαγμένα? Λωρίδα 8: G12V μεταλλαγμένα? Λωρίδα 9:. G13D μεταλλαγμένο

Η

Ευαισθησία του MAS-PCR Δοκιμασία

Οκτώ πλασμίδιο κλώνοι του

KRAS

άγριου τύπου και επτά

KRAS

μεταλλάξεις (G12D, G12A, G12R, G12C, G12S, G12V, ή G13D) εξήχθησαν. Κάθε μεταλλαγμένο πλασμιδιακό DNA αναμίχθηκε με ένα πλασμίδιο DNA άγριου τύπου σε σύνολο 100 ng. Η αναλογία του μεταλλαγμένου DNA πλασμιδίου μειώθηκε σταδιακά για να ληφθεί μειώνοντας αναλογίες μεταλλαγμένων προς άγριου-τύπου DNA σε 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2%, 1% και 0,1%. Η ακρίβεια και η επαναληψιμότητα προσδιορίστηκαν σε τέσσερα επαναλαμβανόμενη τρέχει με την ανάλυση των μειγμάτων στο φάσμα χαμηλότερο όριο ανίχνευσης τα οποία αποδεικνύεται από MAS-PCR.

Δεδομένα ανάλυσης

Τα αποτελέσματα που προκύπτουν από το MAS-PCR και Pyrosequencing συγκρίθηκαν για τις 270 σταθεροποιημένο με φορμαλίνη, τα δείγματα εγκλεισμένα σε παραφίνη και αξιολογήθηκαν για σημαντικότητα με τη χρήση των στατιστικών Kappa. Η τιμή k & gt? 0.81 θεωρήθηκε σημαντική και για να δείξει ότι και οι δύο μέθοδοι παρέχουν σχεδόν τέλεια αποτελέσματα. Θετικές και αρνητικές Συμφωνώ με αυτοπεποίθηση διαστήματα καθορίστηκαν για τα αποτελέσματα MAS-PCR. Οι διαφορές στις κατηγορικές μεταβλητές, όπως η ηλικία, το φύλο, την ιστολογική βαθμό και θέση του όγκου μεταξύ των ασθενών και με το

KRAS

μεταλλάξεις αξιολογήθηκαν για σημασίας με τεστ chi-square. Στατιστικές δοκιμασίες ήταν δύο όψεων, και η P & lt? 0.05 θεωρήθηκε σημαντική. Στατιστικά πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS (έκδοση 11.5).

Αποτελέσματα

Pyrosequencing ανάλυση των

KRAS

μεταλλάξεις γονιδίων σε δείγματα CRC

Διακόσια εβδομήντα κλινικά δείγματα πρώτα αναλύθηκαν με Pyrosequencing για 6 διαφορετικές σημειακές μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 12 (G12S, G12R, G12C, G12D, G12A, και G12V) και μία μετάλλαξη σημείου στο κωδικόνιο 13 (G13D) του

KRAS

γονίδιο. Οι μεταλλάξεις που επιλέγονται για αυτή τη μελέτη είναι από τα πιο συχνά βρέθηκαν σε ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο. Από τα δείγματα 270 του ιστού, τα αποτελέσματα αλληλούχισης αποκάλυψε ότι 120 περιπτώσεις (44,44%) είχαν μετάλλαξη στο κωδικόνιο είτε 12 ή 13 στην

KRAS

γονίδιο, ενώ 150 περιπτώσεις (55,55%) ορίστηκαν ως

KRAS

άγριου τύπου (Πίνακας 2). Από τις 120 περιπτώσεις με ένα

KRAS

μετάλλαξη, 61 (50,83%) ασθενείς είχαν ένα κωδικόνιο 12 μετάλλαξη. Η πιο συχνή κωδικόνιο 12 μετάλλαξη ήταν G12D σε 25,83%, ακολουθούμενη από G12V σε 12,50%. Η συχνότητα εμφάνισης των G12A, G12S και G12C μεταλλάξεις κυμάνθηκε 6-3%, ενώ εκείνη του G12R ήταν η χαμηλότερη σε & lt? 1%. Το κωδικόνιο 13 μετάλλαξη G13D βρεθεί στο 49.17% ήταν πιο διαδεδομένη από ό, τι οποιοδήποτε από τα κωδικόνιο 12 μεταλλάξεις. Οι ασθενείς είχαν μία ή καμία ανιχνεύσιμη μετάλλαξη.

Η

MAS-PCR ανάλυση των

KRAS

μεταλλάξεις γονιδίων σε CRC κλινικά δείγματα

Η δοκιμασία MAS-PCR, που διεξήχθη σε τα 270 δείγματα ιστών CRC για την ανίχνευση του

KRAS

κωδικόνιο 12 και το κωδικόνιο 13 μεταλλάξεις, αποκάλυψε τα αποτελέσματα που έχουν συμφωνηθεί στενά με εκείνες του Pyrosequencing. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, 113 (41.85%) περιπτώσεις

KRAS

μετάλλαξη στα κωδικόνια 12 και 13 και 157 περιπτώσεις (58,15%) του

KRAS

άγριου τύπου προσδιορίστηκαν με τη δοκιμασία MAS-PCR . Μεταξύ των 113 μεταλλαγμένες περιπτώσεις, 47.79% είχαν μετάλλαξη στο κωδικόνιο 12. Επιπλέον με αναφορά στο Pyrosequencing αποτελέσματα, επτά μεταλλαγμένο περιπτώσεις (τρία G12D, ένας G12R, και τρία G12A) δεν ανιχνεύθηκαν με δοκιμασία MAS-PCR. Ωστόσο, όλα τα κωδικόνια 13 μεταλλάξεις έχουν αναγνωριστεί σωστά, όπως συμβαίνει με τα αποτελέσματα Pyrosequencing.

Συσχέτιση των χαρακτηριστικών των ασθενών με

KRAS

κωδικόνιο 12 και 13 μεταλλάξεις

Η μέση ηλικία των ασθενών ήταν 62 χρόνια που κυμαίνονται 27 έως 90 ετών. Πλειοψηφία των ασθενών ήταν μεταξύ 60 και 79 ετών (55,19%). Αναλογία ανδρών-γυναικών ήταν 1,55: 1. Η κυρίαρχη ιστολογικό τύπο σε 64.81% (175/270) ήταν μέτρια διαφοροποιημένες, και 88,52% των περιπτώσεων (239/270) ήταν παχέος πρωτογενείς όγκους (Πίνακας 3). Μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ των δημογραφικών χαρακτηριστικών και των ασθενών ανιχνεύονται

KRAS

μεταλλάξεις εξετάστηκε όπως φαίνεται στον Πίνακα 3. Από τα μελετηθεί ασθενείς που εμφανίζουν

KRAS

μεταλλαχθεί καρκίνωμα, δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές σε σχέση με την ηλικία , το φύλο, την ιστολογική βαθμό και θέση του όγκου. Μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13 δίκαια και ομοιόμορφα κατανεμημένα μέσα οι ομάδες να είναι κοντά στο 1:. Αναλογία 1 ανεξάρτητα από το χαρακτηριστικό

Η

Σύγκριση της MAS-PCR και Pyrosequencing

Αποτελέσματα για τα δείγματα 270 FFPE υποβλήθηκαν σε αναλύσεις συμφωνία, και οι MAS-PCR ευρήματα συγκρίθηκαν με εκείνα της μεθόδου Pyrosequencing (Πίνακας 4). Συγκλίνουσες αποτελέσματα των 263 έξω από 270 δείγματα έδειξε ότι και οι δύο μέθοδοι που παρέχονται τέλεια αποτελέσματα (ρ & lt? 0,05) χωρίς στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δοκιμασιών (k = 0,947, 95% CI = 0,909 να 0,986). Για 7 περιπτώσεις, ελήφθησαν αντικρουόμενα αποτελέσματα, κυρίως όσον αφορά κωδικόνιο 12 μεταλλάξεις οι οποίες ήταν ανιχνεύσιμες με Pyrosequencing και άμεση αλληλούχιση Sanger αλλά όχι με δοκιμασία MAS-PCR. Η θετική συμφωνία και αρνητικών συμφωνίας ήταν 94% και 100%, αντίστοιχα.

Η

Ευαισθησία, ακρίβεια και επαναληψιμότητα της MAS-PCR για

KRAS

μετάλλαξη

Για να αξιολογηθεί η ευαισθησία της δοκιμασίας MAS-PCR, πλασμιδιακό DNA από κάθε επτά

KRAS

μεταλλαγμένων κλώνων αραιώθηκε σε ξεχωριστές αντιδράσεις ενίσχυσης με πλασμιδιακό DNA ενός άγριου τύπου

KRAS

κλώνο. Η αναλογία του μεταλλαγμένου DNA μειώθηκε σταδιακά για να ληφθεί μειώνοντας αναλογίες μεταλλαγμένων προς άγριου-τύπου DNA. Ο προσδιορισμός MAS-PCR ανιχνεύεται μεταλλαγμένα αλληλόμορφα στο 1% για το G12S μεταλλαγμένα, και 2% για τις μεταλλάξεις G12R, G12C, G12D, G12A, G12V, και G13D. Το αντιπροσωπευτικό παράδειγμα του προσδιορισμού MAS-PCR για χαμηλότερο όριο ανίχνευσης παρουσιάζεται στο Σχ 3. Για τον έλεγχο της ακρίβειας και επαναληψιμότητα της δοκιμασίας MAS-PCR μας, έχουμε ποσοτικοποιηθεί

KRAS

μεταλλάξεις στα μίγματα που περιέχουν DNA καθένα από τα επτά μεταλλαγμένο

KRAS

DNA και αγρίου τύπου DNA σε ποικίλες αναλογίες (10%, 5%, 2%, 1%, 0,1% και 0,01%) σε τέσσερις επαναλαμβανόμενες σειρές. Τα αποτελέσματα ήταν ακριβής και επαναλήψιμη, εκ των οποίων το ίδιο χαμηλότερο ποσό των

KRAS

μεταλλαγμένα αλληλόμορφα ανιχνεύτηκαν σε όλες τις επαναλαμβανόμενες διαδρομές.

Ένας εκπρόσωπος gel εμφανίζεται. Αραιώσεις G12R μεταλλαγμένου πλασμιδίου και το πλασμίδιο DNA άγριου τύπου (από 100%, 50%, 25%, 10%, 5%, 2%, 1% και 0,1% μεταλλαγμένα αλληλόμορφα) Λωρίδα Μ: Χαμηλό βάρος DNA Ladder μοριακού? Διαδρομή 1: αρνητικό έλεγχο? Λωρίδα 2-9: αντιστοιχούσαν σε προϊόντα PCR από 100% έως 0,1%

Η

Συζήτηση

Πολλές μελέτες έχουν εξετάσει τη σχέση του

KRAS

μεταλλάξεις με CRC [. ,,,0],8, 33-37].

KRAS

μεταλλάξεις σε ασθενείς CRC συσχετίζονται με αντοχή σε αντι-EGFR θεραπείας, όπως cetuximab ή panitumumab [7]. Ως εκ τούτου, ακριβή πρόβλεψη των θεραπευτικών απαντήσεων θα φεισθεί ασθενείς από περιττή θεραπεία, ενώ εστιάζοντας σε πιο εξατομικευμένη αποτελεσματική θεραπεία. Έχουν αναπτυχθεί μια ευρεία ποικιλία μεθόδων, και αρκετές εμπορικές μοριακό κιτ είναι συνήθως διαθέσιμα για την ανίχνευση

KRAS

μεταλλάξεων [10, 11, 14, 17, 20, 23]. Κάθε τεχνική έχει το δικό του σύνολο των προβλημάτων και των ζητημάτων. Για παράδειγμα, η άμεση αλληλούχιση είναι η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη προσέγγιση για τη διαλογή

KRAS

μεταλλάξεις, ωστόσο ευαισθησία για την ανίχνευση μεταλλαγμένου DNA είναι χαμηλή και απαιτεί τουλάχιστον 10% -30% των μεταλλαγμένα αλληλόμορφα σε ένα υπόβαθρο άγριου τύπου [ ,,,0],14, 18, 38]. HRM είναι μια γρήγορη μεθοδολογία που επιτρέπει διαλογή υψηλής απόδοσης του

KRAS

μεταλλάξεις με μια μέτρια αναλυτική ευαισθησία του 5% έως 6% [14], ωστόσο, η κύρια περιορισμός της είναι η αδυναμία να προσδιορίσει ποια κωδικόνιο είναι μεταλλαγμένο. αποτελέσματα HRM θα πρέπει να επιβεβαιωθεί, και την ταυτοποίηση των συγκεκριμένων μεταλλάξεων απαιτεί μια άλλη τεχνική, όπως η άμεση αλληλούχιση [39]. Pyrosequencing είναι ακριβείς, εφικτή και έχει ανώτερη αναλυτική ευαισθησία περίπου 5% μεταλλαγμένο αλληλόμορφο [14, 18]. Παρ ‘όλα αυτά, αυτή η δοκιμασία απαιτεί μια δαπανηρή όργανο, και ακριβά αντιδραστήρια και αναλώσιμα, καθιστώντας απαγορευτικό κόστος για χρήση στις αναπτυσσόμενες χώρες. Εμπορική μοριακό κιτ έχουν διάφορα πλεονεκτήματα, όπως υψηλή ευαισθησία (δηλαδή, όριο ανίχνευσης περίπου 1% σε & lt? 5%), την ταχύτητα, την εύκολη ερμηνεία των δεδομένων, και πολλές ανιχνεύσιμες θέσεις

KRAS

μεταλλάξεις, ωστόσο αυτή η δοκιμασία απαιτεί επίσης μια δαπανηρή όργανο, δαπανηρά αντιδραστήρια, και έχει ένα σχετικά υψηλό κόστος ανά δείγμα [40]. Ως εκ τούτου, υπάρχει μια ανάγκη να αναπτυχθεί μια ακριβή, απλή, και οικονομικά αποδοτική μέθοδο για την ανίχνευση

KRAS

μεταλλάξεις είναι γνωστό ότι σχετίζονται με CRC που μπορεί να χρησιμοποιηθεί στις αναπτυσσόμενες χώρες.

Σε αυτό μελέτη, έχουμε αναπτύξει με επιτυχία ιδιαίτερα ευαίσθητη και ειδική δοκιμασία MAS-PCR, με στόχο το επτά (δηλαδή, G12S, G12R, G12C, G12D, G12A, G12V, και G13D) πιο κοινές μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13 του

KRAS

γονίδιο. Σχεδιάσαμε ειδικά αρχικά τεμάχια για κάθε μετάλλαξη, και μια περιοχή μετάλλαξη μη ειδική χρησιμοποιήθηκε ως αμπλικονίου αναφοράς. Το 3′-τερματικό βάση κάθε AS αστάρι εκδόθηκε σύμφωνα με την αντίστοιχη μετάλλαξη του. Η δοκιμασία MAS-PCR βελτιστοποιήθηκε για κάθε εκκινητή από την άποψη του εκκινητή συγκέντρωσης και ενίσχυση παραμέτρους. Η MAS-PCR δοκιμασία που αναφέρονται στο παρόν είναι η πρώτη ανάπτυξη των multiplex αλληλόμορφο-ειδική PCR χρησιμοποιώντας την τυποποιημένη μέθοδο PCR που θα μπορούσε να ανιχνεύσει τα επτά πιο κοινά

KRAS

γονιδιακών μεταλλάξεων. Η μέθοδος θα μπορούσε απλά να εκτελούνται σε εργαστήρια χαμηλής πόρων. Περαιτέρω έρευνα είναι στον τρόπο να αναπτύξει ένα απλό, ταχύ και φιλικό προς το χρήστη Nucleic Acid πλευρικής ροής (NALF) ανοσοδοκιμασία [41] με τη χρήση βιοτινυλιωμένων εκκινητών βασίζεται σε εκκινητές αναπτύχθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Επιπλέον probe-based PCR πραγματικού χρόνου θα μπορούσε να δημιουργηθεί με τη χρήση MAS-εκκινητή PCR μας που να ανιχνεύει

KRAS

μεταλλάξεις. Και οι δύο μέθοδοι θα μπορούσαν να είναι επωφελής από την άποψη της πρόληψης στιχομυθία μεταξύ των δειγμάτων ή /και περιβαλλοντικές μολύνσεις κατά τη διάρκεια της διεξαγωγής πειραματισμούς.

Στην παρούσα μελέτη, παρατηρήσαμε ότι η συχνότητα των

KRAS

ογκογονίδιο μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13 σε 270 δείγματα ασθενών Thai ορθοκολικό καρκίνο ήταν 44,44%. Παρόμοιες συχνότητες, που κυμαίνονται από 20 έως 50%, έχουν περιγραφεί προηγουμένως [28, 30, 33]. Βρήκαμε των ποσοστών των μεταλλάξεων στο κωδικόνιο 12 και τα κωδικόνια 13 ήταν κατά 50,83% και 49,17%, αντίστοιχα, οι οποίες ήταν υψηλότερες από εκείνες που αναφέρθηκαν σε άλλες μελέτες (κωδικόνιο 12: 70-90%, κωδικόνιο 13: 10-30%) [28 , 30, 31, 33]. Ωστόσο, τα αποτελέσματά μας έδωσε παρόμοιες συχνότητες (κωδικόνιο 12: 52.62% (10/19), κωδικόνιο 13: 42.12% (8/19)), όπως αναφέρθηκε από Poehlmann et al [17]. Η συναντάται συχνά G13D, G12D, και οι μεταλλάξεις G12V που προσδιορίζονται στην παρούσα μελέτη ήταν μεταξύ των πιο συχνή

KRAS

μεταλλάξεις, σε συμφωνία με άλλες μελέτες [17, 28, 33]. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι δεν υπάρχει σημαντική συσχέτιση μεταξύ της

KRAS

μεταλλάξεις και την ηλικία, το φύλο, την ιστολογική βαθμίδα ή την περιοχή του όγκου. Ωστόσο, ορισμένες προηγούμενες εκθέσεις διαπίστωσε ότι το ποσοστό των

KRAS

μεταλλάξεις ήταν υψηλότερη στις γυναίκες από τους άνδρες [10, 42], η οποία ήταν αντίθετη με τη μελέτη της Poehlmann et al [17].

μας δεδομένα έδειξαν μια ανώτερη συνοχή μεταξύ δοκιμασία MAS-PCR και Pyrosequencing (k = 0,947). Επτά ασυμφωνίες βρέθηκαν σύμφωνα με τα αποτελέσματα Pyrosequencing. Άμεση αλληλούχιση και Pyrosequencing αποκάλυψε τις ίδιες μεταλλαγμένα αλληλόμορφα, η οποία αποτελείται από 3 περιπτώσεις G12D, 3 περιπτώσεις G12A, και 1 περίπτωση G12R. Μια πιθανή έκβαση είναι ο σχηματισμός διασταυρούμενης διμερή μεταξύ εκκινητές που οδηγεί σε μεροληπτική ενίσχυση, η οποία μπορεί να μειώσει την ευαισθησία του προσδιορισμού MAS-PCR [43]. Επιπλέον, δείγματα ιστού FFPE μπορεί να έχουν υποβαθμισμένη νουκλεϊνικά οξέα λόγω της διαδικασίας στερέωσης, και η επίδραση της στερεωτικών σταυροδεσμών επί των νουκλεϊκών οξέων είναι επιζήμια προκαλώντας την αναστολή της PCR [44, 45]. Είναι ενδιαφέρον ότι, δοκιμασία MAS-PCR μας έδειξαν υψηλή αναλυτική ευαισθησία της ανίχνευσης, με ανιχνεύεται περίπου 1-2% μεταλλαγμένο αλληλόμορφο βασίζεται σε πειράματα ανάμιξης DNA χρησιμοποιώντας γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από το πλασμίδιο κλωνοποιημένο DNA. Ωστόσο, τέτοια ευαισθησία θα μπορούσε να επηρεαστεί εξετάζουν τη χρήση κλινικών δειγμάτων που συνήθως περιπλέκεται με την παρουσία PCR παρεμβαίνει συστατικών στα δείγματα. Παρ ‘όλα αυτά, οι περισσότεροι παρεμποδίσεων θα μπορούσε να εξαλειφθεί με καθαρισμό DNA με χρήση κιτ ιστό FFPE όπως χρησιμοποιείται σε αυτήν την μελέτη και όπως περιγράφηκε προηγουμένως [46, 47]. Επιπλέον, η δοκιμασία MAS-PCR που αναπτύξαμε έχει μεγαλύτερη ευαισθησία από ότι αναφέρθηκε για άμεση αλληλούχιση και HRM (δηλαδή, 5% έως 20%), και είναι ισοδύναμη με εκείνη που αναφέρθηκε για Pyrosequencing και εμπορική μοριακό κιτ (δηλαδή, 1% έως 5%) [14, 18, 38]. Επιπλέον, βρήκαμε ένα καλό ακρίβεια και η επαναληψιμότητα του ανεπτυγμένου δοκιμασίας, ως τέσσερις επαναλαμβανόμενες κίνηση απέδωσε τα ίδια αποτελέσματα. Επιπλέον, MAS-PCR είναι μία ταχεία δοκιμασία απαιτεί μόνο & lt? 4 ώρες για να ολοκληρωθεί η δοκιμασία (με εξαίρεση την απομόνωση DNA)? είναι φθηνή, κοστίζει περίπου $ 8 ανά δοκιμή. Επιπλέον, ο προσδιορισμός απασχολεί μόνο ένα όργανο PCR, και δεν απαιτούν υψηλό επίπεδο τεχνικής εμπειρογνωμοσύνης και εξειδικευμένο εξοπλισμό.

Συμπεράσματα

Εν κατακλείδι, έχουμε αναπτύξει μια δοκιμασία MAS-PCR για την ανίχνευση της οι επτά πιο κοινές μεταλλάξεις στα κωδικόνια 12 και 13 του

KRAS

γονίδιο. δοκιμασία MAS-PCR είναι ένα πρωτόκολλο με βάση το DNA που ήταν εύκολο να εκτελέσει, είναι ταχεία, οικονομικά αποδοτική, εξαιρετικά ευαίσθητο και πολύ ειδικό. Μια δοκιμασία με αυτά τα χαρακτηριστικά είναι σημαντικά για την ανάλυση των κλινικών δειγμάτων, όπως FFPE ιστούς, ιδίως για να βοηθήσει τους γιατρούς στην πρόβλεψη της κλινικής πορείας του μονοκλωνικού αντι-EGFR θεραπεία αντισωμάτων των ασθενών mCRC.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ Chupong Ittiwut και ο Δρ Rungnapa Ittiwut (Κέντρο αριστείας στην ιατρική γενετική, Πανεπιστήμιο Chulalongkorn) για τις συμβουλές τους για Pyrosequencing τεχνικές. Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Τμήμα Ιατρικών Υπηρεσιών, Ινστιτούτο Παθολογίας, Υπουργείο Δημόσιας Υγείας για την παροχή δειγμάτων ιστού CRC και το όργανο Pyrosequencing. Θα θέλαμε να εκφράσουμε την ευγνωμοσύνη μας προς τον Καθηγητή Δρ Kathleen L. McCoy (Τμήμα Μικροβιολογίας και Ανοσολογίας, Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο Virginia Commonwealth), ο οποίος υποστηρίζεται οικονομικά από την επιχορήγηση για τους ξένους ακαδημαϊκούς και ερευνητές να αυξήσουν δημοσιεύσει άρθρα σε διεθνή περιοδικών μέσω του Πανεπιστημίου Chulalongkorn Ταμείο Ratchadaphiseksomphot Κληροδότημα 2015 για την κριτική ανάγνωση της για αυτό το χειρόγραφο. Θα θέλαμε επίσης να αναγνωρίσουμε Αναπλ. Prof. Dr. Pornpimol Rongnoparut για βοήθεια διόρθωση.