Αφηρημένο

Η εξαρτώμενη από κυκλίνη αναστολέα κινάσης 1Β (p27kip1) είναι μια βασική πρωτεΐνη στην απόφαση μεταξύ πολλαπλασιασμού και της εξόδου του κυτταρικού κύκλου . Αδρανή κύτταρα δείχνουν πυρηνική p27kip1, αλλά αυτή η πρωτεΐνη εξάγεται στο κυτταρόπλασμα σε απάντηση πολλαπλασιαστικά σήματα. Πρόσφατα αναφέρθηκε ότι η θεραπεία καταλάση αυξάνει τα επίπεδα του p27kip1

in vitro

και

in vivo

σε ένα μοντέλο ποντικού. Για να χαρακτηριστεί και να διευρύνει τα ευρήματα αυτά, αξιολογήσαμε τη ρύθμιση της p27kip1 με υπεροξείδιο του υδρογόνου (H

2O

2) στα ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος και μελανοκύτταρα. Παρατηρήσαμε ένα υψηλό ποσοστό p27kip1 θετικών πυρήνων σε κύτταρα μελανώματος υπερεκφράζουν ή κατεργασμένα με εξωγενή καταλάση, ενώ οι μη-θεραπευμένοι μάρτυρες έδειξαν μια κυτταροπλασματική εντόπιση της p27kip1. Στη συνέχεια μελετήσαμε τα επίπεδα p27kip1 φωσφορυλιωμένη (p27p) σε σερίνη 10 (S10) και θρεονίνη 198 (T198), επειδή η φωσφορυλίωση σε αυτές τις θέσεις επιτρέπει την πυρηνική εξαγωγή αυτής της πρωτεΐνης, που οδηγεί σε συσσώρευση και τη σταθεροποίηση της p27pT198 στο κυτταρόπλασμα. Εμείς αποδεικνύεται με κηλίδα western μια μείωση στα επίπεδα p27pS10 και p27pT198 σε απάντηση H

2O

2 απομάκρυνσης σε κύτταρα μελανώματος, που συνδέονται με την πυρηνική p27kip1. Τα μελανοκύτταρα εκτίθενται επίσης τα πυρηνικά p27kip1 και χαμηλότερα επίπεδα p27pS10 και p27pT198 από τα κύτταρα του μελανώματος, η οποία έδειξε κυτταροπλασματική p27kip1. Δείξαμε επίσης ότι η προσθήκη H

2O

2 (0.1 μΜ) σε κύτταρα μελανώματος που συνελήφθησαν στο G1 με ασιτία ορού επάγει πολλαπλασιασμό και αυξάνει τα επίπεδα του p27pS10 και p27pT198 οδηγεί σε κυτταροπλασματική εντόπιση της p27kip1. Πυρηνική εντοπισμός και μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του p27kip1 επίσης καταδείχθηκε από τη καταλάσης του ορθοκολικού καρκινώματος και κύτταρα νευροβλαστώματος, επεκτείνοντας τα ευρήματά μας σε αυτούς τους άλλους ανθρώπινους τύπους καρκίνου. Συμπερασματικά, δείξαμε στην παρούσα εργασία που H

2O

2 σάρωσης αποτρέπει την πυρηνική εξαγωγή p27kip1, επιτρέποντας τη σύλληψη του κυτταρικού κύκλου, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα καρκινικά κύτταρα να επωφεληθούν από την εγγενή προ-οξειδωτικές τους κατάσταση να ευνοούν κυτταροπλασματική εντόπιση της p27kip1 .

Παράθεση: Ibañez IL, Bracalente C, Notcovich C, Tropper Ι, Molinari, BL, Policastro LL, et al. (2012) Η φωσφορυλίωση και υποκυτταρικός εντοπισμός της p27kip1 Εποπτεύεται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου Modulation σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (9): e44502. doi: 10.1371 /journal.pone.0044502

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 26η Ιανουαρίου 2012? Αποδεκτές: 8 του Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 6η Σεπτεμβρίου του 2012

Copyright: © Ibañez et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από τον Εθνικό Οργανισμό Επιστημονικής και Τεχνολογικής Προώθηση (ANPCyT), Αργεντινή (εικ 2007 – 01628 και PICT 05-14330) και η μη κερδοσκοπική οργάνωση Fundación Florencio Fiorini. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μονοπάτια εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου είναι το τελικό σημείο της Cascades εμπλέκονται στην κυτταρική ανάπτυξη και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σηματοδότησης. κυτταρικού κύκλου είναι σφιχτά συντονίζεται με διαδοχική συναρμολόγηση και την ενεργοποίηση των συμπλοκών πρωτεΐνης κινάσης φάση ειδικό [1], [2], που σχηματίζεται από κυκλίνες και εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάσες (CDKs), τα οποία επίσης ρυθμίζεται από τις πρωτεΐνες ΙΝΚ4 και των αναστολέων της CDK ( CDKIs). Οι κυκλίνες τύπου D που εκφράζεται σε όλη τη διάρκεια του κύκλου σε απόκριση σε μιτογόνο διέγερση [2]. Οι Κυκλίνη D-CDK4 και κυκλίνη Ε-CDΚ2 συμπλοκών που απαιτείται για το πέρασμα από G1 προς S φάση. Η CDKI 1Β (CDKN1B), επίσης γνωστή ως p27kip1, αναγνωρίστηκε για πρώτη φορά ως ένα κρίσιμο αρνητικός ρυθμιστής της CDK2 και G1 /S εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [2], [3]. Τα επίπεδα αυτής της CDKI έχουν υψηλή περιεκτικότητα σε αδρανή κύτταρα, πτώση σε απόκριση σε μιτογόνο διέγερση, παραμένουν σε οριακά επίπεδα στα πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα, και να αυξήσει και πάλι όταν τα μιτογόνα αποσύρονται [2].

Τα τελευταία χρόνια, διαπιστώθηκε ότι p27kip1 εμπλέκεται στη ρύθμιση άλλων διαδικασιών όπως η κυτταρική μετανάστευση [4], μαζί με τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [5]. Είναι ενδιαφέρον, αυτή η πρωτεΐνη μπορεί να ασκήσει τόσο θετικά όσο και αρνητικά τις λειτουργίες στις εν λόγω διεργασίες [5]. Οι δραστηριότητες του p27kip1 ελέγχονται από το καθεστώς συγκέντρωσης, υποκυτταρικό εντοπισμό και τη φωσφορυλίωση της [5]. Για παράδειγμα, η φωσφορυλίωση της p27kip1 στη σερίνη 10 (S10) μεσολαβεί p27kip1 εξαγωγή στο κυτταρόπλασμα [6] – [9], η φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 198 (T198) σταθεροποιεί την πρωτεΐνη στο κυτταρόπλασμα και αυξάνει p27kip1 εξαρτώμενη κυτταρική κινητικότητα [4 ] και το φωσφορυλίωση στη θρεονίνη 187 (T187) τα σημεία p27kip1 ως στόχος για πρωτεόλυση από polyubiquitination [9] – [11]. Η φωσφορυλίωση των άλλων περιοχών της πρωτεΐνης μειώνει την πυρηνική εισαγωγή του p27kip1 και ενισχύει την συναρμολόγηση της κυκλίνης D1-CDK4 συμπλόκου [9], [12] – [15] ή εκκινεί τη μετάβαση του p27kip1 από αναστολέα της κυκλίνης E-CDK2 προς υπόστρωμα για πρωτεόλυση [16], [17]. Μεταβολές στη φωσφορυλίωση p27kip1 μπορούσε να οδηγήσει σε απώλεια της σταθερότητας, παρεκκλίνουσα λειτουργία ή ο εσφαλμένος εντοπισμός της πρωτεΐνης η οποία, με τη σειρά του, θα μπορούσε να συμβάλει στην ογκογένεση [5], [9]. Με αυτή την έννοια, τόσο η απώλεια των πυρηνικών p27kip1 και κυτταροπλασματική εντόπιση της έχουν προταθεί ως προγνωστικός δείκτης για την εξέλιξη του μελανώματος και χειρότερα κλινική έκβαση [18].

εξωκυττάριο περιβάλλον μπορεί να ξεκινήσει τμήματος του κυτταρικού κύκλου ή σύλληψης με την ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση της κυκλίνης -CDK Συγκροτήματα μέσω διαφορετικών οδών

Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) είναι ικανά να ασκούν διαφορετικές επιδράσεις επί των κυττάρων σύμφωνα με τη φύση, εντοπισμός και τα επίπεδά τους [19]. Ιδιαίτερα, πολλοί τύποι κυττάρων θηλαστικών μπορούν να αυξήσουν την ανάπτυξή τους όταν εκτίθενται σε μέτρια επίπεδα του υπεροξειδίου του υδρογόνου (Η

2O

2), και μπορεί να διεγείρει απόπτωση [20], τελική διαφοροποίηση [21] ή κυτταροτοξικότητα [20], αν εκτεθεί σε υψηλά επίπεδα H

2O

2. Παγίδευσης H

2O

2 σε καρκινικά κύτταρα είτε έλαβαν θεραπεία με εξωγενή καταλάση ή έκφραση επιμολυσμένα καταλάση αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [22] – [25]. Είναι καλά τεκμηριωμένο ότι H

2O

2 εμπλέκεται σε μονοπάτια μεταγωγής σήματος [26], [27], π.χ. αυξημένα επίπεδα H

2O

2 προκαλέσουν μιτογόνο σήματα, όπως αυτά που σχετίζονται με κινάσες σήματος ρυθμίζεται Ras /εξωκυττάριο 1 και 2 (ERK1 /2) μονοπάτι, και το άγχος που ανταποκρίνεται σήματα, όπως αυτά που σχετίζονται με γ -Jun Ν-τερματικές κινάσες (JNKs) και p38 που ενεργοποιείται από μιτογόνο κινάσης πρωτεΐνης (ΜΑΡΚ) οδών [26] – [28]. Επιπλέον, ROS, και ιδίως H

2O

2, ήταν επίσης υπονοείται στην διαμόρφωση των κινασών τυροσίνης υποδοχέα (RTK) [29] και φωσφατιδυλινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /ΑΚΤ [30] οδούς.

έχει αναφερθεί ότι οι διακυμάνσεις που παρατηρούνται στην ενδοκυτταρική οξειδοαναγωγική κατάσταση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του κυτταρικού κύκλου θα μπορούσαν να συνδέουν οξειδωτικές μεταβολικές διεργασίες για ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου [31], [32]. H

2O

2 διακυμάνσεις κατά μήκος του κυτταρικού κύκλου συνδέθηκαν με τη ρύθμιση της έκφρασης κυκλίνης D1 [33]. Σε αντίθεση, η απομάκρυνση των ενδογενών H

2O

2 από υπερέκφραση καταλάσης και υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης επάγει G0 /G1 σύλληψης [25] και μειώνει τη σύνθεση του DNA των κυττάρων [34]. Μια πρόσφατη μελέτη από το εργαστήριο μας έδειξαν αυξημένα επίπεδα p27kip1 σε απόκριση σε θεραπεία καταλάσης σε ένα μοντέλο ποντικού της πλακώδους καρκινώματος

in vitro

και

in vivo

[35]. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που εμπλέκονται σε αυτόν τον κανονισμό της πρωτεΐνης του κυτταρικού κύκλου από H

2O

2 δεν έχουν κατανοηθεί πλήρως. Λαμβάνοντας υπόψη ότι p27kip1 προτάθηκε ως προγνωστικό βιοδείκτη για ανθρώπινη μελάνωμα [18], και ότι αυτοί οι όγκοι εμφάνισαν προ-οξειδωτικό συμπεριφορά λόγω της ανισορροπίας στο αντιοξειδωτικό σύστημα [36], [37] και με την απελευθέρωση της μελανίνης [38], τα ανθρώπινα κύτταρα μελανώματος γίνει ένα ενδιαφέρον μοντέλο, προκειμένου να διευρύνουν τα προηγούμενα αποτελέσματα μας H

2O

2 ρύθμιση των p27kip1.

Ο σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν να αξιολογήσει τις επιπτώσεις της διαφοροποίησης των H

2O

2 επίπεδα στην G1 /S μετάβασης και, ειδικότερα, για τη ρύθμιση της πρωτεΐνης CDKI, p27kip1, σε ανθρώπινο μελάνωμα και κυτταρικές σειρές μελανοκυττάρων. Δείξαμε την ενδοκυτταρική επανατοπικοποίηση της p27kip1 μετά την καταλάση ή H

2O

2 θεραπείες. Αυτό συσχετίστηκε με παραλλαγές στα επίπεδα φωσφορυλιώνεται p27kip1 στο S10 (p27pS10) και T198 (p27pT198), οι οποίες παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του υποκυτταρικού εντοπισμού της πρωτεΐνης αυτής. Αποτελέσματα για τη διαφοροποίηση p27kip1 είχαν επεκταθεί σε άλλους τύπους ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών, ορθοκολικό καρκίνωμα και κύτταρα νευροβλαστώματος. Τα ευρήματά μας μπορεί να παρέχει μια ένδειξη για να κατανοήσουν την επίδραση του H

2O

2 για τη διαμόρφωση ενός κλειδιού ρυθμιστικής πρωτεΐνης του G1 /S μετάβαση με την επακόλουθη επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του κυτταρικού κύκλου και.

αποτελέσματα

η καταλάση Θεραπεία Αναστέλλει μελάνωμα κυτταρικού πολλαπλασιασμού από G1 Σύλληψη

έχει προταθεί ότι τα κύτταρα με μόνιμη οξειδωτική μετατόπιση της κατάστασης οξειδοαναγωγής μπορεί να υποβάλλονται σε συνεχή πολλαπλασιασμό που θα μπορούσε, με τη σειρά του, είναι ένα κρίσιμο εκδήλωση στην εμφάνιση του κακοήθους φαινοτύπου [23], [39]. Με αυτή την έννοια, η παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων των ROS και, ειδικότερα, H

2O

2, αναφέρθηκε σε κυτταρικές γραμμές όγκου [23], [40]. Η καταλάση είναι ένα αντιοξειδωτικό ένζυμο που αποσυνθέτει H

2O

2 σε νερό και οξυγόνο. Λαμβάνοντας υπόψη ότι η H

2O

2 μπορούν να διαχυθούν κατά μήκος των μεμβρανών, η προσθήκη καταλάσης στο μέσο καλλιέργειας θα μπορούσε να παράγει μια μείωση στο ενδοκυτταρικό επίπεδο H

2O

2 φθάνοντας ένα αντίστοιχο μικρότερη σταθερή κατάσταση συγκέντρωση εντός και εκτός του κυττάρου [26], [33], [35]. Εμείς επικυρωμένο μοντέλο μας των κυττάρων μελανώματος σε επεξεργασία με καταλάση προστίθεται στο μέσο καλλιέργειας με μέτρηση της μείωσης των επιπέδων του ROS έως 2 ‘, 7’-δοκιμασία dichlorodihydro-διοξεική φλουορεσκεϊνη (DCFH-DA) (Σχήματα 1Α και 1Β). Αυτή η μείωση στα επίπεδα ROS που προκαλείται από την καταλάση οδήγησε σε σημαντική αναστολή (ρ & lt? 0,01) από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα 2Α). Επιπλέον, τα κύτταρα Α375 που υπερεκφράζουν καταλάση (Α375-CAT-Ε9) εμφανίζεται χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 2Β). Αυτός ο κλώνος, Α375-CAT-Ε9, έδειξαν τα χαμηλότερα επίπεδα ενδοκυτταρικών ROS των σταθερών γενετικίνη κλώνοι ανθεκτικοί δημιουργείται (Σχήμα S1A) και μία σημαντική μείωση σε αυτά τα επίπεδα σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με ένα άδειο πλασμίδιο (Α375-pcDNA3) ή μη επιμολυσμένα (έλεγχος Α375) (Σχήματα 1C και 1D). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με τα υψηλότερα επίπεδα έκφρασης καταλάσης και δραστικότητα παρατηρείται σε Α375-CAT-E9 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα S1B και S1c).

(Α-Δ) τα επίπεδα Ενδοκυτταρική ROS μειώθηκαν σε κύτταρα μελανώματος είτε όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με καταλάση ή όταν υπερεκφράζουν. (Α) Αντιπροσωπευτική ιστογράμματα DCF φθορισμού των κυττάρων μελανώματος σε επεξεργασία με 500 (μπλε γραμμή) και 1000 (πορτοκαλί γραμμή) U /ml καταλάση ή αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία (πράσινη γραμμή) για 24 ώρες. κύτταρα ελέγχου που δεν εκτέθηκαν σε DCFH-DA (μαύρη γραμμή) και τα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με καταλάση λίγο πριν DCFH-DA επώασης (κόκκινη γραμμή). (Β) DCF σημαίνει φθορισμού (αυθαίρετες μονάδες) έναντι καταλάση (CAT) δόση. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. ** Ρ & lt? 0,01 έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα (0 U /ml καταλάση). (C) Εκπρόσωπος ιστογράμματα DCF φθορισμού των κυττάρων μελανώματος υπερεκφράζουν καταλάση (A375-CAT-Ε9) και τους ελέγχους της (Α375-pcDNA3 και μη επεξεργασμένα κύτταρα Α375). κύτταρα ελέγχου που δεν εκτέθηκαν σε DCFH-DA (μαύρη γραμμή), κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με καταλάση λίγο πριν από την επώαση DCFH-DA (κόκκινη γραμμή) και τα κύτταρα επωάζονται με DCFH-DA (πράσινη γραμμή). (D) DCF μέση φθορισμού (αυθαίρετες μονάδες) του Α375-CAT-Ε9, Α375-pcDNA3 και ελέγχου Α375 κυττάρων. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. ** P & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου A375. (Ε-ΣΤ) κύτταρα μελανώματος (Α375) εμφάνισαν υψηλότερα επίπεδα των ενδοκυττάριων ROS από τον ομόλογό μη-όγκου τους (PIG-1 μελανοκύτταρα). (Ε) Εκπρόσωπος ιστογράμματα DCF φθορισμού PIG-1 και Α375 κύτταρα: κύτταρα ελέγχου που δεν εκτέθηκαν σε DCFH-DA (μαύρες γραμμές), κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με καταλάση λίγο πριν από την επώαση DCFH-DA (κόκκινη γραμμή) και τα κύτταρα επωάζονται με DCFH- DA (πράσινη γραμμή). (F) DCF σημαίνει φθορισμού (αυθαίρετες μονάδες) PIG-1 μελανοκύτταρα και κύτταρα μελανώματος Α375. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. ** Ρ & lt? 0,01 vs. PIG-1

Η

ρυθμό πολλαπλασιασμού (Α) Cell κυττάρων μελανώματος σε επεξεργασία με καταλάση για 24 ώρες, σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, αξιολογείται με την δοκιμασία ΜΤΤ.. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. ** P & lt? 0,01 ελέγχου εναντίον. ρυθμός διάδοσης (Β) Α375-CAT-Ε9, Α375-pcDNA3 και ελέγχου Α375 κυττάρων. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. * P & lt? 0,05 έναντι του ελέγχου A375. (C) ρυθμό πολλαπλασιασμού των μη-όγκου (PIG-1) και καρκινικών κυττάρων (Α375). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. ** P & lt? 0,01 έναντι A375. Ανάλυση (D-I) του κυτταρικού κύκλου αξιολογήθηκαν με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. (D) Αντιπροσωπευτική ιστογράμματα περιεχόμενο DNA των κυττάρων Α375 μελανώματος σε επεξεργασία με 1.000 U /ml καταλάση (CAT) κατά τη διάρκεια 24 h και τα κύτταρα ελέγχου Α375. (Ε) Ποσοστό κυττάρων μελανώματος στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου σε απόκριση σε θεραπεία CAT. FBS πέθαναν από κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του G1 σύλληψης. (□) μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, () 500 U /ml και (■) 1000 U /ml CAT και () FBS πεινασμένο κύτταρα. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01 vs. μάρτυρα. (F) Εκπρόσωπος ιστογράμματα του περιεχομένου του DNA των A375-CAT-Ε9, Α375-pcDNA3 και ελέγχου Α375 κυττάρων. (G) Ποσοστό Α375-CAT-Ε9 (■), Α375-pcDNA3 () και κύτταρα ελέγχου Α375 (□) στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. ** P & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου A375. (H) Εκπρόσωπος ιστογράμματα του περιεχομένου του DNA των χοίρων 1 μελανοκύτταρα και κύτταρα μελανώματος Α375. (Ι) Ποσοστό (■) μη-όγκου (PIG-1) και (□) όγκου (Α375) κυττάρων σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. ** P & lt?. 0,01 έναντι κυττάρων PIG-1

Η

Για να αξιολογηθεί μη όγκου και καρκινικών κυττάρων σε συνδυασμό με τα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS τους, αναλύσαμε τα μελανοκύτταρα εναντίον κυττάρων μελανώματος. Σχήμα 2C δείχνει το ρυθμό πολλαπλασιασμού των PIG-1 μελανοκύτταρα σε σύγκριση με Α375 κύτταρα μελανώματος. Επιβεβαιώσαμε ότι τα καρκινικά κύτταρα παρουσίασαν υψηλότερα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS από ομολόγου μη-όγκου τους σε αυτό το μελάνωμα /μοντέλο μελανοκυττάρων (Σχήματα 1Ε και 1Ρ). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα των ROS και στην τιμή του πολλαπλασιασμού (Σχήμα S2) μεταξύ αγωγή μη και θερμο-απενεργοποιημένο καταλάσης κατεργασμένων κυττάρων στο μοντέλο μελανώματος. Έτσι, θερμοαπενεργοποιημένο καταλάση χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Μια σημαντική σύλληψη G1 του κυτταρικού κύκλου βρέθηκε σχετίζονται με την αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα μελανώματος σε επεξεργασία με καταλάση για 24 ώρες (Σχήματα 2D και 2Ε). Ανάλογα αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για Α375-CAT-E9 vs. Α375-pcDNA3 ή κύτταρα ελέγχου Α375 (Σχήματα 2F και 2G). Τα μελανοκύτταρα έδειξε υψηλότερο ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 και μικρότερο ποσοστό σε φάση S από κύτταρα μελανώματος (Σχήματα 2Η και 2I).

Όσον αφορά τα επίπεδα των κυκλινών και των CDKs εμπλέκονται στην G1 /S μετάβαση, η κυκλίνη D1, κυκλίνη Ε, CDK4 και CDK2, αξιολογούνται από κηλίδα western, μια σημαντική μείωση στην κυκλίνης επίπεδα D1 παρατηρήθηκε μετά H

2O

2 αφαίρεση από επεξεργασία καταλάση ή καταλάση υπερέκφραση (Σχήμα S3), σε συμφωνία με τα προηγούμενα ευρήματα [35 ], [41].

Επιπλέον, το σήμα για την κυκλίνη D1 ανιχνεύεται με ανοσοφθορισμό ήταν εξαιρετικά χαμηλό στον πυρήνα των κυττάρων σε επεξεργασία με καταλάση και μια σημαντική μείωση του ποσοστού των θετικών πυρήνων βρέθηκε σε αυτά τα κύτταρα σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχήμα S4). κύτταρα μελανώματος επέδειξαν υψηλότερη ποσότητα και των δύο επιπέδων κυκλίνης D1 και το ποσοστό των θετικών πυρήνων για κυκλίνη D1, η οποία αξιολογείται με κηλίδα western και ανοσοφθορισμό από αντισυμβαλλόμενος μη όγκου τους PIG-1 (Σχήμα S3 και S4), η οποία θα πρέπει να σχετίζονται με τα αυξημένα επίπεδα των ROS και το ποσοστό των κυττάρων Α375 σε φάση S. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην κυκλίνη Ε, τα επίπεδα CDK2 και CDK4 παρατηρήθηκαν μεταξύ καταλάσης αγωγή και κύτταρα ελέγχου και μεταξύ μη όγκου και καρκινικών κυττάρων (Σχήμα S3). Έτσι, η μείωση της κυκλίνης D1 επίπεδα που παρατηρήθηκαν θα συμμετάσχει στην G1 /S σύλληψης που προκαλείται από την καταλάση στα κύτταρα Α375.

Η καταλάση θεραπεία οδήγησε πυρηνικό εντοπισμό p27kip1

Λαμβάνοντας υπόψη τη σύλληψη G1 που προκαλείται από την καταλάση και η σημασία της υποκυτταρικού εντοπισμού της ανασταλτικής πρωτεΐνης p27kip1 για τη ρυθμιστική δράση του, η επίδραση του H

2O

2 παγίδευσης για την εντόπιση της πρωτεΐνης αυτής μελετήθηκε με ανοσοφθορισμό. Αξιοσημείωτα, p27kip1 εντοπίστηκε κυρίως εντός του πυρήνα σε κύτταρα μελανώματος σε επεξεργασία με ή υπερεκφράζουν καταλάση ως σύγκριση με τους μάρτυρες, στους οποίους διανομή p27kip1 ήταν κυρίως κυτταροπλασματική (Σχήματα 3Α-3Δ). Επιπλέον, μελανοκύτταρα παρουσίασαν υψηλότερο ποσοστό θετικών κυττάρων p27kip1 από εκείνη του Α375 κύτταρα μελανώματος (Σχήματα 3Ε και 3F). Αυτή η πρωτεΐνη εντοπίζεται κυρίως στον πυρήνα σε μη καρκινικά κύτταρα και στο κυτταρόπλασμα σε κύτταρα όγκου (Σχήματα 3Ε και 3F).

(Α-Ρ) υποκυτταρικός εντοπισμός της p27kip1 αξιολογούνται από immunocytofluorescence. (Α-Β) κύτταρα μελανώματος που έλαβαν θεραπεία με 500 και 1000 U /ml καταλάση (CAT) για περιόδους 6 ή 24 ώρες ή αφεθεί χωρίς θεραπεία. FBS πέθαναν από κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του G1 σύλληψης. (C-D) μοντέλο υπερέκφραση καταλάσης (κύτταρα Α375-CAT-Ε9) έναντι των ελέγχων (Α375-pcDNA3 και κύτταρα ελέγχου Α375). (Ε-ΣΤ) Μη-όγκου (PIG-1) έναντι καρκινικών κυττάρων (Α375). (A, C και Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του p27kip1 immunocytofluorescence δείχνει την υποκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης. ΫΑΡΙ: χρώση του πυρηνικού DNA? p27kip1: χρώση FITC των p27kip1 πρωτεΐνης. (B, D και F) Ποσοστό θετικών (□) κυτταροπλάσματα και θετική (■) πυρήνες για p27kip1 σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των καταμετρηθέντων κυττάρων. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. (Β) ** p & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου. (D) * p & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου A375. (F) * ρ & lt? 0.05 και ** ρ & lt? 0,01 έναντι μη νεοπλασματικά κύτταρα. (G-Η) Αυξημένη έκφραση της πυρηνικής p27kip1 σε κύτταρα Α375 μετά από 1000 U /ml καταλάση (CAT) θεραπεία σε σύγκριση με τα κύτταρα Α375 ελέγχου (που έλαβαν θεραπεία με 1000 U /ml θερμο-απενεργοποιημένο καταλάση, IN-CAT) για 24 ώρες, ανιχνεύθηκε με western blot των εκχυλίσματα πυρήνων και κυτταρολυμάτων (βλέπε Μέθοδοι). (ζ) Εκπρόσωπος εικόνες ανοσοαποτύπωμα που φαίνεται. C: Κυτταροπλασματικά εκχυλίσματα? Ν: Πυρηνική εκχυλίσματα. Ακτίνης και Ku-70 πυκνομετρική τιμές χρησιμοποιήθηκαν για την τυποποίηση για κυτταροπλασματική και πυρηνική πρωτεΐνη φόρτωση, αντίστοιχα. (H) Σχετική πυκνομετρικές τιμές (□) κυτταροπλασματική και (■) επιπέδων πυρηνικής p27kip1. Τα αποτελέσματα που αναφέρονται για τον έλεγχο των κυττάρων. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. * P & lt?. 0.05 ενάντια στον έλεγχο

Η

Για να επιβεβαιώσει τα αποτελέσματα της H

2O

2 σάρωσης για p27kip1 εντοπισμό παρατηρείται με ανοσοφθορισμό, τα επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης σε πυρηνικά και κυτοσολικά εκχυλίσματα κυττάρων μελανώματος σε επεξεργασία με καταλάση αξιολογήθηκαν από western blot. Εμείς έδειξαν σημαντική αύξηση των επιπέδων p27kip1 σε πυρηνικά εκχυλίσματα από κύτταρα που κατεργάζονται με καταλάση, σε σύγκριση με τον έλεγχο (Σχήμα 3G και 3Η).

Αυτά τα αποτελέσματα αποδεικνύουν τη διαμόρφωση της ενδοκυτταρικής εντόπισης του p27kip1 στη ρύθμιση του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από την καταλάση και να επιβεβαιώσει προηγούμενα ευρήματα μας [35], την επέκταση των εν λόγω αποτελεσμάτων σε ανθρώπινα κύτταρα Α375. Η εμμονή της p27kip1 στον πυρήνα προκαλείται από H

2O

2 αφαίρεσης θα ευνοούν την απόφραξη του κυτταρικού κύκλου στην G1 /S μετάβαση.

H

2O

2 Διαμόρφωση οδηγεί σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις του p27kip1

έδειξαν επίσης μία σημαντική αύξηση των συνολικών επιπέδων p27kip1 σε απόκριση σε θεραπεία καταλάση ή υπερέκφραση αξιολογείται με κηλίδα western (Σχήμα 4). Αυτό θα μπορούσε να σχετίζεται με τα υψηλά επίπεδα που παρατηρήθηκαν p27kip1 στον πυρήνα καταλάσης κατεργασμένων κυττάρων (Σχήμα 3Ε). Επιπλέον κύτταρα μελανώματος εμφάνισαν χαμηλότερα επίπεδα αυτής της ανασταλτικής πρωτεΐνης σε σύγκριση με μελανοκύτταρα (Σχήμα 4). Αναφορικά με Western Blot (Σχήμα 4) και ανοσοφθορισμό (Σχήμα 3) τα αποτελέσματα και λαμβάνοντας υπόψη ότι p27kip1 επίπεδα, η λειτουργία και εντοπισμό ρυθμίζονται από φωσφορυλιώσεις, τα επίπεδα p27kip1 φωσφορυλιωμένο στο S10 (p27pS10), T198 (p27pT198) και T187 (p27pT187) σε απόκριση με H

2O

2 σάρωσης αξιολογήθηκαν από western blot. Η φωσφορυλίωση του p27kip1 στο S10 και T198 είναι ένα γεγονός κλειδί για την πυρηνική εξαγωγή αυτής της πρωτεΐνης και την πρόοδο του κυτταρικού κύκλου και έδειξε μια σημαντική μείωση στα επίπεδα του p27pS10 και p27pT198 σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ή σε επεξεργασία με καταλάση, σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Σχήμα 4 ). Επιπλέον, PIG-1 μελανοκύτταρα αποκάλυψε χαμηλότερα επίπεδα p27pS10 και p27pT198 από τον ομόλογό του όγκου τους (Σχήμα 4).

Η έκφραση της p27kip1 και p27kip1 φωσφορυλιωμένο στο S10 (p27pS10) και T198 (p27pT198) αναλύθηκε με western blot . (Α-Β) Α375 κύτταρα μελανώματος σε επεξεργασία με καταλάση (CAT) για 6 και 24 ώρες. FBS πέθαναν από κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του G1 σύλληψης. (C-D) μοντέλο υπερέκφραση καταλάσης (κύτταρα Α375-CAT-Ε9) έναντι των ελέγχων (Α375-pcDNA3 και κύτταρα ελέγχου Α375). (Ε-ΣΤ) Μη-όγκου (PIG-1) έναντι καρκινικών κυττάρων (Α375). (A, C και Ε) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ανοσοστυπώματος. (B, D και F) Σχετική πυκνομετρικής τιμές του () επιπέδων p27kip1, (□) p27pS10 και (■) p27pT198. Actin πυκνομετρική τιμές χρησιμοποιήθηκαν για την τυποποίηση για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Τα αποτελέσματα που αναφέρονται για τον έλεγχο χωρίς θεραπεία (σε Β και D) και σε μη-όγκου (PIG-1) κύτταρα (σε F). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. (Β) * p & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01 vs. μάρτυρα. (D) ** p & lt? 0,01 έναντι του ελέγχου A375. (F) ** p & lt?. 0.01 έναντι μη καρκινικά κύτταρα

Η

Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η μείωση των επιπέδων του H

2O

2 από καταλάση εμποδίζει τη φωσφορυλίωση συγκεκριμένων χώρων του p27kip1 Ως εκ τούτου, αποφεύγοντας την πυρηνική εξαγωγή της πρωτεΐνης και οδηγεί σε διακοπή του κυτταρικού κύκλου μέσω της συσσώρευσης p27kip1 στον πυρήνα. Επιπλέον, η φωσφορυλίωση της p27kip1 στο T187, το οποίο εμπλέκεται στην ενεργοποίηση πρωτεόλυση της πρωτεΐνης αυτής, αξιολογήθηκε σε καταλάσης-αγωγή μελανώματος κύτταρα και δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές έναντι μη επεξεργασμένους μάρτυρες (Σχήμα S5).

Θεωρώντας ότι οι αυξητικοί παράγοντες ενεργοποιούν H

2O

2 παραγωγής που οδηγεί στην ενεργοποίηση των μονοπατιών που διέπουν κυτταρικού πολλαπλασιασμού [27] σηματοδότησης, αξιολογήσαμε πόσο H

2O

2 εμπλέκεται στη ρύθμιση της p27kip1 στην G1- συνελήφθη Α375 κύτταρα με FBS πείνα επωάζονται με διαφορετικά επίπεδα h

2O

2 για 24 ώρες. Το Σχήμα 5Α δείχνει αυξημένα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε κύτταρα κατεργασμένα με 0,1-10 μΜ H

2O

2 σε σύγκριση με FBS πεινασμένο κύτταρα. Έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι η εφαρμογή των 0,1-7 μΜ H

2O

2 σε καλλιεργημένα κύτταρα οδηγεί σε ενδοκυτταρική H

2O

2 επίπεδα περίπου 0,01-0,07 μΜ και άμεσα διεγείρει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. Από την άλλη πλευρά, αυξανόμενες ποσότητες κυτταρικού θανάτου συμβεί με την εφαρμοσμένη συγκεντρώσεις H

2O

2≥10 μΜ [ανασκόπηση στην 26]. Στο κυτταρικό μοντέλο μας, η επώαση του FBS πεινασμένο κυττάρων με 0,1 μΜ H

2O

2 προκάλεσε μια αύξηση στον ρυθμό πολλαπλασιασμού σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα FBS πεινασμένο κύτταρα. Από την άλλη πλευρά, καμία επίδραση στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων παρατηρήθηκε με τα άλλα δόσεις H

2O

2 χρησιμοποιείται (Εικόνα 5Β). Τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 0,1 μΜ H

2O

2 παρουσίασαν κυρίως κυτταροπλασματική κατανομή p27kip1? παρόμοιο με κύτταρα που επωάστηκαν με 10% FBS ενώ p27kip1 βρέθηκε κυρίως στον πυρήνα σε μη επεξεργασμένα FBS πεινασμένα κύτταρα (Σχήματα 5C και 5D). Η υποκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης αυτής σε κύτταρα επεξεργασμένα με 0,01 μΜ H

2O

2 ήταν συγκρίσιμο με το πρότυπο που παρατηρείται σε FBS πεινασμένα κύτταρα και την προσθήκη 1-10 μΜ H

2O

2 να Α375 FBS πεινασμένο κύτταρα οδήγησε σε παρόμοιο ποσοστό των πυρηνικών και κυτταροπλασματικών p27kip1 (Σχήματα 5C και 5D). Western blots έδειξαν μειωμένα επίπεδα p27kip1 σε κύτταρα επεξεργασμένα με 0,01 μΜ H

2O

2 σε σύγκριση με FBS πεινασμένο κύτταρα και σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 0,1-10 μΜ H

2O

2 (Εικόνες 5Ε και 5F). Τα επίπεδα του p27pS10 και p27pT198 σε κύτταρα επεξεργασμένα με 0.1 μΜ H

2O

2 αυξήθηκαν σε κύτταρα επωάστηκαν με 10% FBS, ενώ FBS πέθαναν από κύτταρα έδειξαν χαμηλά επίπεδα p27pS10 και p27pT198 (Σχήματα 5Ε και 5F). Αντίθετα, δεν βρέθηκαν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα των p27pT187 σε κύτταρα κατεργασμένα με εξωγενή H

2O

2 (0,1 και 10 μΜ) σε σύγκριση με τις δύο FBS πεινασμένα και 10% FBS επωάστηκαν κύτταρα ελέγχου (Σχήμα S5 ). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η H

2O

2 σε μιτογόνο επίπεδο των 0,1 μΜ για κυτταρικό μοντέλο μας ρυθμίζει φωσφορυλίωση p27kip1 οδηγεί σε κυτταροπλασματικό εντοπισμό αυτής της πρωτεΐνης και ευνοώντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων.

Κύτταρα μελανώματος

(Α375) αναπτύχθηκαν σε πλήρες μέσο με 10% FBS συνελήφθησαν από FBS ασιτία (0% FBS) για μια περίοδο 24 h και στη συνέχεια τα κύτταρα επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις h

2O

2 (0,01-10 μΜ) ή να 10% FBS. επίπεδα (Α) Η ενδοκυτταρική ROS μετράται με τη δοκιμασία DCFH-DA. (Β) ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων αξιολογήθηκε με την δοκιμασία ΜΤΤ. (Γ) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του p27kip1 immunocytofluorescence δείχνει την υποκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης. ΫΑΡΙ: χρώση του πυρηνικού DNA? p27kip1: χρώση FITC των p27kip1 πρωτεΐνης. (D) Ποσοστό θετικών (□) κυτταροπλάσματα και θετική (■) πυρήνες για p27kip1 σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των καταμετρηθέντων κυττάρων. (Ε) Η έκφραση της p27kip1, p27pS10 και p27pT198 αναλύθηκαν με western blot. (F) Σχετική πυκνομετρικές τιμές της () επίπεδα p27kip1, (□) p27pS10 και (■) p27pT198. Actin πυκνομετρική τιμές χρησιμοποιήθηκαν για την τυποποίηση για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Τα αποτελέσματα αναφέρονται ελέγχου επωάζονται με 10% FBS. (Α, Β, D και F) Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. * Ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01 και *** ρ & lt? 0.001 vs. κύτταρα επωάζονται με 10% FBS?

# p & lt? 0,05,

## ρ & lt? 0,01 και

### p & lt? 0.001 έναντι FBS-πεινασμένο κύτταρα όχι εκτεθειμένα σε H

2O

2

Έτσι, αποδείξαμε ότι H

2O

2 θα συνεπάγεται στη διαμόρφωση των βασικών ρυθμιστικών μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις των p27kip1 πρωτεΐνης στα κύτταρα μελανώματος.

η καταλάση Διαμορφώνει επίσης Πολλαπλασιασμός κυττάρων και υποκυτταρικός εντοπισμός της p27kip1 στο ορθοκολικού καρκινώματος και νευροβλαστώματος κύτταρα

για να επεκτείνει τα αποτελέσματα που παρατηρήθηκαν για τα κύτταρα μελανώματος που έλαβαν θεραπεία με καταλάση με άλλους τύπους ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων, αξιολογήσαμε πολλαπλασιασμό των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου και p27kip1 ενδοκυτταρική κατανομή σε ορθοκολικό καρκίνωμα (LoVo) και κύτταρα νευροβλαστώματος (Paju). Ο χαρακτηρισμός των κυτταρικών μοντέλων μας σε επίπεδο ROS έδειξε ότι τα κύτταρα LoVo εμφάνισαν χαμηλότερα ενδοκυτταρικά επίπεδα ROS από Πατζού και τα κύτταρα Α375 (Εικόνα S6). Είναι ενδιαφέρον, παρατηρήσαμε ένα χαμηλό ρυθμό πολλαπλασιασμού (ρ & lt? 0,01) για τις δύο LoVo και τα κύτταρα Πατζού (Εικόνα 6) ως απάντηση στα μειωμένα επίπεδα των ROS που προκαλείται από την προσθήκη καταλάσης σε κυτταρικές καλλιέργειες (Σχήμα 6). LoVo και Paju κύτταρα επεξεργασμένα με καταλάση για 24 ώρες παρουσίασαν σημαντική σύλληψη G1 του κυτταρικού κύκλου (σχήμα 6) συνδέεται με μια μείωση των επιπέδων D1 κυκλίνης (Σχήμα S7). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα αυτά, το σήμα για κυκλίνη D1 ανιχνεύεται με ανοσοφθορισμό ήταν εξαιρετικά χαμηλό στον πυρήνα των κυττάρων σε επεξεργασία με καταλάση και μια σημαντική μείωση του ποσοστού των θετικών πυρήνων βρέθηκε σε αυτά τα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα S8). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στην κυκλίνη Ε, τα επίπεδα CDK2 και CDK4 παρατηρήθηκαν μεταξύ καταλάσης-κατεργασμένα και μη-κατεργασμένα κύτταρα (Σχήμα S7).

LoVo και Πατζού κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0-1000 U /ml καταλάση (CAT) για 24 ώρες. (Α-Β) επίπεδα Ενδοκυτταρική ROS προσδιορίστηκε με δοκιμασία DCFH-DA. (Α) Αντιπροσωπευτική ιστογράμματα DCF φθορισμού των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με 500 (μπλε γραμμή) και 1000 (πορτοκαλί γραμμή) U /ml καταλάση ή αφέθηκαν χωρίς επεξεργασία (πράσινη γραμμή) για 24 ώρες. κύτταρα ελέγχου που δεν εκτέθηκαν σε DCFH-DA (μαύρη γραμμή) και τα κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με καταλάση λίγο πριν DCFH-DA επώασης (κόκκινη γραμμή). (Β) DCF σημαίνει φθορισμού (αυθαίρετες μονάδες) έναντι της δόσης καταλάση. ρυθμό πολλαπλασιασμού (C) Cell κυττάρων LoVo και Πατζού κατεργάζεται με καταλάση για 24 ώρες, σε σχέση με τα κύτταρα ελέγχου, αξιολογείται με την δοκιμασία ΜΤΤ. (D-Ε) Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου αξιολογείται με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο. (D) Αντιπροσωπευτική ιστογράμματα των κυττάρων που το περιεχόμενο DNA σε επεξεργασία με καταλάση (CAT). (Ε) Ποσοστό κυττάρων στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου σε απόκριση σε θεραπεία CAT. FBS πέθαναν από κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του G1 σύλληψης. (□) μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, () 500 U /ml και (■) 1000 U /ml CAT και () FBS πεινασμένο κύτταρα. (B, C και Ε) Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. * P & lt? 0,05 και ** p & lt?. 0,01 έναντι του ελέγχου

Η

(Α και Β) Η πυρηνική εντόπιση του p27kip1 με καταλάση (CAT) ανιχνεύθηκε από immunocytofluorescence. (Α) Αντιπροσωπευτικές εικόνες του p27kip1 immunocytofluorescence δείχνει την υποκυτταρική εντόπιση της πρωτεΐνης. ΫΑΡΙ: χρώση του πυρηνικού DNA? p27kip1: χρώση FITC των p27kip1 πρωτεΐνης. (Β) ποσοστό των θετικών κυτταροπλάσματα (□) και θετικών πυρήνων (■) για p27kip1 σε σχέση με τον συνολικό αριθμό των καταμετρηθέντων κυττάρων. (Γ και Δ) Αύξηση των επιπέδων p27kip1 και μείωση των p27kip1 φωσφορυλιωμένο στο S10 (p27pS10) και T198 (p27pT198) για την αντιμετώπιση H

2O

2 σάρωσης, αναλύονται με κηλίδα western. (C) Εκπρόσωπος εικόνες ανοσοαποτύπωση. (D) Σχετική πυκνομετρικές τιμές της () επίπεδα p27kip1, (□) p27pS10 και (■) p27pT198. Actin πυκνομετρική τιμές χρησιμοποιήθηκαν για την τυποποίηση για την πρωτεΐνη φόρτωσης. Τα αποτελέσματα που αναφέρονται για τον έλεγχο χωρίς θεραπεία. (Β και D) Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. * P & lt? 0,05 και ** p & lt? 0,01 vs. μάρτυρα. (Α-Δ) FBS Starved κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν ως έλεγχος του G1 συλλήψεως.

Η

κύτταρα καρκινώματος και νευροβλαστώματος παχέος κατεργάζεται με καταλάση έδειξε επίσης p27kip1 εντοπίζεται κυρίως εντός του πυρήνα σε σύγκριση με τους ελέγχους, στους οποίους διανομή p27kip1 ήταν κυρίως κυτταροπλασματική (Σχήματα 7Α και θεραπείες δείχνουν 7Β για 24 ώρες και τα σχήματα S9A και S9B θεραπείες δείχνουν για 6 ώρες). Επιπλέον, αποδεικνύεται με κηλίδα western μια σημαντική αύξηση στα επίπεδα των p27kip1 σε απόκριση σε θεραπεία καταλάσης τόσο LoVo και Πατζού κύτταρα (Σχήματα 7C και 7D θεραπείες για 24 ώρες και τα Σχήματα S9C και S9D θεραπείες για 6 h). Τέλος, αναπαράγεται μια σημαντική μείωση των επιπέδων του p27pS10 και p27pT198 σε ορθοκολικό καρκίνωμα και κύτταρα νευροβλαστώματος αντιμετωπίζονται με καταλάση ως σύγκριση με τους ελέγχους (Σχήματα 7C και 7D θεραπείες για 24 ώρες και τα Σχήματα S9C και S9D θεραπείες για 6 h).

Τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνονται και να επεκταθούν τα προηγούμενα ευρήματά μας. Προτείνουμε ότι ROS μειωθεί σε διαφορετικά ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με καταλάση ρυθμίζει την υποκυτταρική εντόπιση του p27kip1 αποφεύγοντας τη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης σε θέσεις-κλειδιά (S10 και T198) που οδηγεί στη συσσώρευση p27kip1 στον πυρήνα η οποία ευνοεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου.