Αφηρημένο

μικροκυστινών είναι ισχυροί αναστολείς φωσφατάσης και των κυτταρικών τοξινών. Απαιτούν την ενεργό μεταφορά από OATP1B1 και OATP1B3 μεταφορείς για πρόσληψη σε ανθρώπινα κύτταρα, και η υψηλή έκφραση αυτών των μεταφορέων στο ήπαρ αντιπροσωπεύει εκλεκτική ηπατική τοξικότητα τους. Αρκετές ανθρώπινους όγκους έχει αποδειχθεί ότι έχει υψηλά επίπεδα έκφρασης του OATP1B3 αλλά όχι OATP1B1, ο κύριος μεταφορέας στα κύτταρα του ήπατος. Υποθέσαμε ότι οι παραλλαγές μικροκυστίνης θα μπορούσαν να απομονωθούν που μεταφέρονται κατά προτίμηση από OATP1B3 σε σχέση με OATP1B1 να προχωρήσει ως αντικαρκινικών παραγόντων με κλινικά ανεκτή ηπατική τοξικότητα. Οι παραλλαγές μικροκυστίνη απομονωθεί και δοκιμάσθηκαν για κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με OATP1B1 και OATP1B3 μεταφορείς. Μικροκυστίνης παραλλαγές με κυτταροτοξική OATP1B1 /OATP1B3 IC

50 αναλογίες που κυμαίνονταν μεταξύ 0,2 και 32 βρέθηκαν, που αντιπροσωπεύουν 150-πλάσια περιοχή στο μεταφορέα επιλεκτικότητα. Όπως δομή μικροκυστίνης έχει σημαντικό αντίκτυπο στις μεταφορέα επιλεκτικότητα, είναι πιθανώς δυνατό να αναπτυχθούν ανάλογα με ακόμη πιο έντονη OATP1B3 επιλεκτικότητα και έτσι επιτρέπουν την ανάπτυξή τους ως αντικαρκινικά φάρμακα

Παράθεση:. Niedermeyer THJ, Καθημερινή Α, Swiatecka-Hagenbruch Μ, Μόσχα JA (2014) επιλεκτικότητα και τη δραστικότητα της μικροκυστίνης πτητικά συστατικά κατά OATP1B1 και OATP1B3 Εκφράζοντας καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 9 (3): e91476. doi: 10.1371 /journal.pone.0091476

Επιμέλεια: Matias Α Avila, Πανεπιστήμιο της Ναβάρα Ιατρική Σχολή και το Κέντρο Εφαρμοσμένης Ιατρικής Έρευνας (CIMA), Ισπανία

Ελήφθη: 19 Δεκεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 13 του Φλεβάρη 2014? Δημοσιεύθηκε: 10 Μάρτη 2014

Copyright: © 2014 Niedermeyer et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από DanceBlue, ένας φοιτητής επιχείρηση προσπάθεια που υποστηρίζει κλινικής φροντίδας και της έρευνας στην παιδιατρική ογκολογία στο Πανεπιστήμιο του Kentucy, και εν μέρει από το γερμανικό Ομοσπονδιακό Υπουργείο Οικονομικών και Τεχνολογίας (KF2766301SB0). Ανοικτή Πρόσβαση εκδόσεις υποστηρίζεται από την Deutsche Forschungsgemeinschaft και Ανοικτή Πρόσβαση Publishing Ταμείο του Πανεπιστημίου Tuebingen. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Timo Niedermeyer και Monika Swiatecka-Hagenbruch είναι υπάλληλοι της κυανο Biotech GmbH. Δεν υπάρχουν στο εμπόριο προϊόντα να δηλώσει. Κυανό Biotech GmbH έχει δοθεί η άδεια να δημοσιεύσει το χειρόγραφο. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

μικροκυστινών (MCs) είναι κυκλικά επταπεπτίδια παράγονται από διάφορους κυανοβακτηρίων γένη όπως

Microcystis

,

Oscillatoria

,

Planktothrix

,

Nostoc

, και

Anabaena

. Μπορούν να θεωρούνται από τα καλύτερα μελετημένα κυανοβακτηρίων δευτερογενείς μεταβολίτες [1] – [4]. Το κοινό δομικό χαρακτηριστικό μικροκυστινών είναι ένα συνθάσης πολυκετιδίου που προέρχεται αμινοξέος με το ακρωνύμιο «Adda», (2S, 3S, 8S, 9S) -3-αμινο-9-μεθοξυ-2,6,8-τριμεθυλ-10-phenyldeca- 4,6-διενοϊκό οξύ, το οποίο είναι επίσης ένα από τα δύο υποχρεωτικά υποδομές για τη φωσφατάση ισχυρός πρωτεΐνη σερίνη /θρεονίνη (ΡΡ) 1 και η αναστολή ΡΡ2Α που παρατηρήθηκαν για τις μικροκυστινών [5] – [9]. Δεν είναι μόνο η βιοσύνθεση των ενώσεων αυτών από συνθάσες πολυκετιδίου και μη ριβοσωμικό συνθετάσες πεπτιδίου εξαιρετικά καλά κατανοητή [10] – [12], αλλά, επίσης, έχουν περισσότερο από το 90 μεμονωμένα μέλη αυτής της χημικά πολυποίκιλες ένωση της οικογένειας έχουν περιγραφεί στην επιστημονική βιβλιογραφία για να ημερομηνία (Εικ. 1) [13] – [56]. Ιδιαίτερα επιρρεπή σε παραλλαγή είναι τα Ε-αμινοξέα που βρίσκονται στις θέσεις 2 και 4 του σκελετού του MC. Σχετικές ενώσεις είναι τα nodularins, βρέθηκαν σε

Nodularia

sp, τα οποία περιέχουν επίσης Adda, αλλά είναι κυκλικά πενταπεπτίδια αντί επταπεπτίδια (Εικ. 1) [57] -.. [60]

Επικράτηση υπολείμματα που βρίσκονται εντός μικροκυστινών (αριστερά) και nodularins (δεξιά) είναι ανάλογη με το μέγεθος της γραμματοσειράς του αντίστοιχου υπολείμματος. Τα δεδομένα που χρησιμοποιούνται για να δημιουργήσουν αυτό το ποσό έχει κατατεθεί σε https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880756.

Η

Το να είσαι ισχυρός πρωτεΐνη σερίνη /θρεονίνη φωσφατάση αναστολείς, μικροκυστινών και nodularins έχουν βαθιά επίδραση στην κυτταρική σηματοδότηση και τη συντήρηση κυτταροσκελετού, οδηγώντας στον θάνατο των προσβεβλημένων κυττάρων [61], [62]. Ωστόσο, οι σχετικά μεγάλες και αμφιφιλικές MCs δεν είναι σε θέση να διασχίσουν κυτταρικές μεμβράνες με παθητική διάχυση. Αντ ‘αυτού, βασίζονται στην ενεργό πρόσληψη από τα κύτταρα. Τρία μέλη της μεταφοράς οργανικών ανιόντων πολυπεπτίδια (OATP) της οικογένειας είναι σε θέση να μεσολαβήσει αυτή η πρόσληψη των MCs, δηλαδή OATP1B1, 1Β3 και 1Α2 [63], [64]. OATP1B1 και OATP1B3 είναι οι πιο αποδοτικές μεταφορείς μικροκυστίνη, και όπως σε υγιείς ανθρώπους και οι δύο μεταφορείς βρίσκονται αποκλειστικά να εκφράζεται σε ιστό ήπατος [64], [65], μικροκυστινών και nodularins είναι γνωστό ότι προκαλούν εκτεταμένες βλάβη του ήπατος [66] – [68 ]. Έτσι μικροκυστινών έγινε διαβόητη ως ηπατοτοξίνες προκαλούν βλάβη στους ανθρώπους και τα βοοειδή, όταν αυτές οι ενώσεις έχουν συγκεντρωθεί από πηγές πόσιμου νερού κατά τη διάρκεια των φυκών φορές άνθιση του νερού [69], [70]. Αναστολείς αυτών των μεταφορέων OATP βελτιώσει την ηπατοτοξικότητα μικροκυστινών και nodularins [68], [71], [72]. Σε αντίθεση με την OATP1B1, η οποία εκφράζεται σε ηπατοκύτταρα σε όλο το συκώτι λοβού, OATP1B3 εντοπισμός περιορίζεται γύρω από την κεντρική φλέβα [64]

OATPs βρίσκονται επί του παρόντος υπό συζήτηση ως στόχοι για τη θεραπεία του καρκίνου [73] – [76]. . Πιο ενδιαφέροντα, OATP1B3, αλλά δεν OATP1B1, έχει βρεθεί ότι εκφράζεται λειτουργικά σε έναν αριθμό ιστών καρκίνου, ιδιαίτερα όγκων του παχέος εντέρου, αλλά επίσης και όγκους του μαστού, όγκους του πνεύμονα, του παγκρέατος και ηπατοκυτταρικό όγκους [75], [77] – [79] . Ως διαφορική τοξικότητα των φυσικών μικροκυστίνης παραλλαγές σε κυτταρικές σειρές που εκφράζουν είτε OATP1B1 ή OATP1B3 έχει παρατηρηθεί [78], [80], τα ευρήματα αυτά έθεσε το ερώτημα κατά πόσον μικροκυστινών μπορεί να είναι κατάλληλο ως οδηγεί για φαρμακευτικές ουσίες εναντίον αυτών των τύπων καρκίνου, και εάν υπάρχουν μικροκυστινών μεταξύ των περισσότερο από 90 γνωστές παραλλαγές που μεταφέρονται επιλεκτικά από OATP1B3 σχέση με OATP1B1. Επιλεκτικότητα που ευνοεί OATP1B3 πάνω OATP1B1 πρέπει να οδηγήσει σε μειωμένη ηπατική κάθαρση και αυξημένη πρόσληψη των MCs σε όγκους OATP1B3 εκφράζουν, δημιουργώντας ένα θεραπευτικό παράθυρο της αντίστοιχης ένωσης με μείωση της ηπατικής ρυθμό κάθαρσης και της τοξικότητας. MCs είναι ενδιαφέρουσες ως νέες δομές μολύβδου επειδή έχουν ένα τρόπο δράσης δεν έχουν ακόμη χρησιμοποιηθεί, αλλά συζητείται επί του παρόντος για τη θεραπεία του καρκίνου (αναστολή φωσφατάση) [81] – [83], και σε αντίθεση με την πλειοψηφία των διαθέσιμων αντικαρκινικών φαρμάκων, χρειάζονται δραστικές μεταφορά στα κύτταρα και έτσι να διαθέσει όλους τους ιστούς που δεν εκφράζουν τα αναφερόμενα OATPs.

Έχουμε απομονωθεί διάφορα μικροκυστίνης ομοειδών από κυανοβακτήρια των γενών

Microcystis

,

Planktothrix

, και

Nodularia

για να ελεγχθεί η υπόθεση κατά πόσον διαφορετικές εκλεκτικότητες μεταφορέα θα μπορούσε να είναι εφικτός. Ως εργαλεία για τη δοκιμή επιλεκτικότητα, τον καρκίνο του τραχήλου HeLa κύτταρα και κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου RKO σταθερά επιμολυσμένα με φορείς έκφρασης για OATP1B1 και 1Β3 έχουν χρησιμοποιηθεί. Στην παρούσα χειρόγραφο, τα αποτελέσματα των δοκιμών των απομονωμένων MCs επί αυτών των κυτταρικών γραμμών που περιγράφονται. Οι καθοριζόμενες IC

50 τιμές καθώς και οι παρατηρούμενες διαφορές επιλεκτικότητα δείχνουν σαφώς ότι οι μικρές δομικές διαφορές του υπό δοκιμή MCs έχουν πράγματι σημαντικό αντίκτυπο στις μεταφορέα επιλεκτικότητα και κυτταροτοξική δραστικότητα.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Οι συνθέσεις αμινοξέων (ΑΑ) των δοκιμαζόμενων MCs συνοψίζονται στον πίνακα 1

Η

Οι δομές των ομοειδών μικροκυστίνης έχουν προσδιοριστεί με βάση συνδυασμό HRMS [51], [52], [84 ], που υποστηρίζεται από

1 Η- και COSY-NMR φασματοσκοπία. Όλα MCs περιέχουν τη χαρακτηριστική ήμισυ Adda στη θέση 5 και D-Ala στη θέση 1 του μορίου. Μόνο ένα από τα απομονωμένα ομοειδών διαθέτει ένα

O

-μεθυλιωμένη d-ισο-Glu αντί του ά-ισο-Glu στη θέση 6 (22). d-ισο-β-MeAsp και d-ισο-Asp στη θέση 3 είναι σχεδόν ισομερώς κατανεμημένα, όπως είναι Mdha και Dhb στη θέση 7. Οι l αμινοξέα στη θέση 2 περιλαμβάνουν Leu, Tyr, Arg, ΝΜΑ, Hil (φθίνουσα σειρά της μετράνε), στη θέση 4 Arg, Tyr, Trp, Phe, ΝΜΑ, και Har βρίσκονται. Εκτός από τις 22 παραλλαγές MC, nodularin (23) ως ένα κυκλικό πενταπεπτίδιο Adda που περιέχουν, καθώς και το οκαδαϊκό οξύ (24) ως δομικά δεν MC που σχετίζονται με αναστολέα PP έχουν δοκιμαστεί.

Οι τιμές IC50 όλων των απομονωμένων οι MCs κατά OATP1B1- και OATP1B3-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν HeLa ή RKO προσδιορισθεί. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται στον Πίνακα 2.

Η

Είναι ενδιαφέρον, σημαντικές διαφορές τόσο για την δραστικότητα και εκλεκτικότητα του ατόμου θα μπορούσε να παρατηρηθεί MC ομοειδών.

Η επιλεκτικότητα

Αν και η υποκατάσταση του d-ισο-β-MeAsp

3 για d-ισο-Asp

3 (π.χ. ενώσεις 1/2 και 13/14), δεν φαίνεται να έχει σημαντική επίδραση στην ικανότητα ούτε ούτε επιλεκτικότητα, η επιρροή της παρουσία είτε Mdha

7 ή (

E

)-Dhb

7 (π.χ. 3/4, 5/6, 8/9 και 14/15) είναι διφορούμενη: Ενώ στην περίπτωση 3/4 και 5/6 υποκατάσταση Mdha

7 για (

E

)-Dhb

7 οδηγούν σε μια έντονη αύξηση στην εκλεκτικότητα για OATP1B3 πάνω OATP1B1, αυτή η επίδραση δεν παρατηρήθηκε για 8 /9 και 14/15. Δεδομένου ότι οι έξι τουλάχιστον επιλεκτικές ενώσεις OATP1B3 (1, 2, 3, 5, 7, 23) όλα διαθέτουν Mdha

7 ή Mdhb

7, ενώ (

E

)-Dhb

7 βρέθηκε σε 3 από τις 6 πιο επιλεκτικές ενώσεις OATP1B3 (4, 10, 12, 15, 16, 18), είναι πιθανό ότι (

E

)-Dhb

7 έχει επίδραση στην εκλεκτικότητα, αλλά είναι δεν είναι το μόνο χαρακτηριστικό που προσδίδει δομική εκλεκτικότητα.

Πράγματι, ειδικά τα υπολείμματα αμινοξέων στις θέσεις 2 και 4 της δομής του πυρήνα MC φαίνεται να είναι σημαντική τόσο για την δραστικότητα και την εκλεκτικότητα. Ενώ το 80% των πιο επιλεκτικές ενώσεις OATP1B1 διαθέτουν Leu στη θέση 2, αυτό το αμινοξύ είναι εντελώς απούσα στις πιο επιλεκτικές ενώσεις OATP1B3. Ωστόσο, Leu βρίσκεται επίσης στη θέση 2 των αρκετών ομοειδών που είναι ασθενώς OATP1B3 επιλεκτικές (6, 8, 9), έτσι Leu μόνο δεν κάνει μια ένωση OATP1B1 επιλεκτική. Arg στη θέση 2, φαίνεται να επάγουν OATP1B3 επιλεκτικότητα, ενώ Arg στη θέση 4 δεν έχει καμία επίδραση στην επιλεκτικότητα. Αυτό είναι προφανές με ενώσεις 13 και 16, όπου η ανταλλαγή των αμινοξέων στις θέσεις 2 και 4 έχει τεράστια επίδραση στην επιλεκτικότητα. Arg σε συνδυασμό με τα αρωματικά αμινοξέα Phe, Tyr, και ΝΜΑ είναι εμφανή μονομερή που βρίσκονται σε επιλεκτικές ενώσεις OATP1B3. Ειδικά συνδυασμούς Arg

2 και Phe

4 (12) ή Arg

2 και Tyr

4 (16) φαίνεται να προσδίδουν OATP1B3 επιλεκτικότητα. Αλλά και πάλι, η παρουσία της Arg στη θέση 2 δεν φαίνεται να είναι υποχρεωτικό για OATP1B3 εκλεκτικότητα (4).

Είναι ενδιαφέρον ότι το πενταπεπτίδιο Nodularin (23) είναι η πιο OATP1B1 επιλεκτική μεταξύ των ενώσεων που περιέχουν Adda εξετάστηκαν.

Ισχύς

η ισχύς της MC θανάτου που προκαλείται από κύτταρο στο σύστημα δοκιμής που χρησιμοποιείται για τη μελέτη αυτή έχει δύο όψεις. Από τη μια πλευρά, η τοξικότητα του MC ομοειδών εξαρτάται από την έκταση της αναστολής ΡΡ τους [85]. Από την άλλη πλευρά, η ισχύς είναι ανάλογα με τη μεταφορά ικανότητα του αντίστοιχου OATP. Αυτά τα δύο αποτελέσματα δεν έχουν διακριθεί στην παρούσα μελέτη. Ενώ μερικές προηγούμενες μελέτες δείχνουν ότι

in vitro

και

in vivo

τοξικότητα σχετίζονται με ενζυμική αναστολή και όχι τις μεταφορές [78], [85], άλλες εκθέσεις δείχνουν συγκρίσιμη αναστολή PP των διαφόρων ομοειδών μικροκυστίνης , πράγμα που σημαίνει ότι οι διαφορές στον τομέα των μεταφορών συμβάλλουν στην

in vivo

τοξικότητα [80], [86].

Δεν αποτελεί έκπληξη, 22, χαρακτηρίζει

O

-μεθυλιωμένη d-ισο Glu

6, είναι μία από τις λιγότερο ισχυρές ενώσεις. Τροποποιήσεις του ελεύθερου καρβοξυλικού οξέος του Glu είναι πιθανόν να οδηγήσουν σε απώλεια της αποτελεσματικότητας λόγω της απώλειας της αλληλεπίδρασης με ένα θετικά φορτισμένο αργινίνης στο ενεργό κέντρο των πρωτεϊνικών φωσφατασών [7], και Glu (OMe) έχουν περιέχει ομοειδών βρεθεί ότι αναστέλλουν ΡΡ1 σε πολύ μικρότερο βαθμό από ό, τι ανάλογες MCs που περιέχει Glu [87], και έχουν χαμηλότερα

in vivo

τοξικότητα [26]. Είναι ενδιαφέρον ότι, επίσης 10, 11 και 21 εμφανίζονται ασθενέστερες τοξικότητα από τα περισσότερα των άλλων ομοειδών. Ενώ το 10 αναστέλλει ΡΡ2Α περίπου είκοσι φορές ασθενέστερη σε σύγκριση με 1 [78], [80], [85], [86], η τοξικότητά του στην παρούσα ανάλυση είναι περίπου 500 φορές μικρότερη. Αυτό δείχνει ότι στην περίπτωση του 10 (και επίσης ανάλογο του 11), είναι πιθανόν ότι η τοξικότητα δεν είναι μόνο θέμα PP αποτελεσματικότητας αναστολής, αλλά επίσης από την ικανότητα μεταφοράς OATP, όπως MC-RR είναι ένα δικατιόν υπό φυσιολογικές συνθήκες και ως εκ τούτου λιγότερο πιθανό να μεταφερθούν κατά μήκος των κυτταρικών μεμβρανών από τους μεταφορείς ανιόν. Σε γενικές γραμμές, η κυτταροτοξικότητα στον προσδιορισμό μας δεν συσχετίζεται με την πρωτεϊνική φωσφατάση δραστικότητα αναστολής όπως περιγράφεται στη βιβλιογραφία για τις ενώσεις 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 18, 19, 20, 23 [56], [ ,,,0],78], [80], [85], [86]. Έτσι, τα στοιχεία μας δείχνουν ότι οι διαφορετικές αποδοτικότητες μεταφοράς έχουν μεγαλύτερο αντίκτυπο στην

in vivo

τοξικότητα από διαφορετικές ισχύς της αναστολής της πρωτεΐνης φωσφατάση.

Είναι ενδιαφέρον, το πιο ισχυρό MCs, με IC

50 τιμές σε το εύρος υπο-nanomolar (5, 6, 7, 8, 17, 18, 19), όλοι οι συνδυασμοί χαρακτηριστικό είτε Leu

2 και Tyr /Phe /Trp

4 ή Tyr /ΝΜΑ

2 και Tyr /ΝΜΑ

4. Arg είναι απούσα από τα πιο ισχυρά ομοειδών. Οι λιγότερο ισχυροί ομοειδείς με IC

50 τιμές & gt? 100 nM (10, 11, 21, 22) όλα διαθέτουν είτε Tyr

2 και Arg /Har

4 ή Arg

2 και Arg

4. Παρουσία του Arg γενικά μειώνει τη δραστικότητα, υποστηρίζοντας και πάλι την υπόθεση ότι το θετικά φορτισμένο υπολείμματα Arg παρεμποδίζουν την αποτελεσματικότητα των μεταφορών παράλληλα με τη μείωση της αναστολής ΡΡ2Α, και επομένως χαμηλότερο

in vivo

τοξικότητα.

Σύνοψη και συμπεράσματα

στην προβολή μας 23 φυσικές παραλλαγές MC, έχουμε βρεθεί πολλές MCs με IC

50 στη χαμηλή νανομοριακή περιοχή και με μεταφορέα επιλεκτικότητα που ευνοεί OATP1B3 πάνω OATP1B1 με συντελεστή έως τριάντα. Ενώ η παρουσία του Arg γενικά μειώνει την ισχύ του MC κυτταροτοξικότητας, η παρουσία του στη θέση 2 της δομής του πυρήνα MC φαίνεται επίσης να είναι σημαντική για την OATP1B3 επιλεκτικότητα, πράγμα που σημαίνει ότι αυτή η μεταφορέας μπορεί να είναι πιο ανεκτική στην κατιονική φύση του Arg υπό φυσιολογικές συνθήκες από OATP1B1. Περαιτέρω, η παρουσία των ελαφρώς όξινο αρωματικά αμινοξέα Tyr ή ΝΜΑ στη θέση 4 επιπροσθέτως Arg στη θέση 2 φαίνεται επωφελής για OATP1B3 επιλεκτικότητα. Οι

περαιτέρω μελέτες για να διακρίνουν αν οι παρατηρούμενες διαφορές στη δραστικότητα οφείλονται σε διαφορετικές αναστολή PP ή διαφορετικές δυνατότητες μεταφοράς του OATP. Ωστόσο, νωρίτερα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι

in vivo

τοξικότητα κυρίως ανάλογα με την κινητική της μεταφοράς ΟΑΤΡ από ό, τι για τις διαφορές στην αναστολή PP [80], [86].

Αν και οι συναγόμενη σχέσεις δομής-δραστικότητας είναι διφορούμενα σε τμήματα, τα δομικά χαρακτηριστικά που παρατηρήθηκαν για OATP1B3 επιλεκτικότητα μπορεί να συμπυκνωθεί στο παρόν πιο πιθανό επιλεκτικό γενική δομή κυκλο (D-Ala

1-L-Arg

2-D (Me) Asp

3-L-αρωματικών αμινοξέων

4-Adda

5-d-Glu

6 – (

E

)-Dhb

7). Αυτή η γενική δομή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως σημείο εκκίνησης για την παραγωγή νέων ενώσεων π.χ. από πρόδρομα διατροφή ή biocombinatorial στρατηγικές

Μια πρόκληση να χρησιμοποιήσει MCs ως φάρμακο οδηγεί παραμένει:. Ακόμα και με επιλεκτικές παραλλαγές MC, ηπατική τοξικότητα εξακολουθεί να είναι μια σημαντική πρόκληση, γεγονός που καθιστά αναγκαίο να δημιουργηθούν MC παραλλαγές που θα μπορούσαν να είναι μεταβολικά αποτοξινωθεί από τα υγιή κύτταρα του ήπατος ή /και αποτελεσματικά effluxed στη χολή, και έτσι να επωφεληθούν από ηπατική μηχανισμούς αποτοξίνωσης και η κάθαρση που δεν θα βρεθεί σε όγκους.

Υλικά και Μέθοδοι

κυανοβακτήρια Υλικό

Πολλά

Microcystis aeruginosa

και

Planktothrix rubescens

στελέχη, καθώς και ένα

Nodularia

στέλεχος έχουν χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή των μελετηθεί ομοειδών μικροκυστίνης: 2 και 3,

Microcystis aeruginosa

CBT 265? 4 και 15,

Planktothrix rubescens

CBT 310? 5, 16, και 17,

Microcystis aeruginosa

CBT 850, 6, 9, 18, 19, και 20,

Planktothrix rubescens

CBT 862, 11,

Planktothrix rubescens

CBT 329, 12,

Microcystis aeruginosa

CBT 861, 14, 21, και 22,

Microcystis aeruginosa

CBT 480, 23,

Nodularia

sp. CBT 786. Τα στελέχη ταξινομήθηκαν με βάση την ανάλυση PCR και αλληλούχιση των διαφόρων γονιδίων σήμανσης, καθώς και τη μορφολογία τους, και έχουν κατατεθεί στη συλλογή κυανο Biotech (CBT) πολιτισμός υπό τους αριθμούς που αναφέρονται παραπάνω (Κυανό Biotech, Βερολίνο, Γερμανία). Τα στελέχη καλλιεργήθηκαν σε μέσο BG11 [88] στους 20 ° C υπό συνεχές φως (60-80 μmol m

-2 s

-1) σε photobioreactors κλίμακα 20 L και συγκομίζονται ημι-συνεχώς επί μία περίοδο αρκετών

Απομόνωση μικροκυστινών

στελεχών κυανοβακτηρίων σαρώθηκαν με HPLC-DAD /IT-TOF-MS (Kinetex C εβδομάδες.

18, 2.6 μm, 100 × 3 mm στήλη, Phenomenex, Torrance, USA) χρησιμοποιώντας μια γραμμική προσκοπισμό κλίση υδατικού CH

3CN (5 έως 80% μέσα σε 25 λεπτά σε 0.6 ml /min? 0.025% ν /ν ΤΡΑ) για να επιβεβαιωθεί MC παρουσία με χαρακτηριστικό φάσμα υν τους, καθώς και η χαρακτηριστικό tandem MS θραύσματος ιόντων σε

m /z

375 [52], [89]. Τα επιλεγμένα θετικά στελέχη έχουν καλλιεργηθεί σε μέσο BG11 [88] στους 20 ° C υπό συνεχές φως (60-80 μmol m

-2 s

-1) σε 20 L βιοαντιδραστήρες κλίμακα φωτογραφία. Μετά τη συγκομιδή της βιομάζας και ξήρανσης με κατάψυξη, οι βιομάζες επαναιωρήθηκαν σε 50% MeOH (ν /ν), κατεργασία με ένα ράβδο υπερήχους (Bandelin, Βερολίνο, Γερμανία) και εκχυλίζεται σε έναν αναδευτήρα για 30 λεπτά. Μετά τη φυγοκέντρηση τα βιομάζες στη συνέχεια εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας 80% MeOH (ν /ν). Τα 50% MeOH και 80% MeOH εκχυλίσματα των αντίστοιχων βιομάζες συνδυάστηκαν και ξηράνθηκαν

σε κενό

. Τα ακατέργαστα εκχυλίσματα κλασματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας βαθμίδα μεθανόλης-ύδωρ κλίσεις επί C

18 φυσίγγια σε ένα σύστημα VersaFlash (Supelco, Bellefonte, USA), και τα κλάσματα που περιέχουν MCs (παρακολουθήθηκε με HPLC) ξηράνθηκαν

σε κενό

. Μετά την ανασύσταση, τα εν λόγω κλάσματα υποβλήθηκαν σε ημι-παρασκευαστική HPLC. Για μια λεπτομερή περιγραφή των διαδικασιών απομόνωσης βλέπε S1 αρχείου. Μικροκυστινών RR, LW, και LF και το οκαδαϊκό οξύ ελήφθησαν από Axxora, LLC (San Diego, CA), και μικροκυστινών LR και YR ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ).

Δομή διαλεύκανση

Οι δομές των απομονωμένων MCs έχουν καθοριστεί από υψηλής ανάλυσης διαδοχικής φασματομετρίας μάζας [51], [52], [84], και επιβεβαιώθηκε από το ένα και φασματοσκοπία δύο διαστάσεων NMR. Δείγματα για φασματοσκοπία NMR διαλύθηκαν σε 600 μι δ

6-DMSO. Τα φάσματα NMR καταγράφηκαν στα 600 ΜΗz (

συχνότητα 1Η) σε ένα φασματόμετρο Bruker AV-III χρησιμοποιώντας κρυογονικά ψυχόμενο TCI-τριπλός ανιχνευτές συντονισμού 5 mm εξοπλισμένη με έναν άξονα με δυνατότητα θωρακισμένο κλίσεις. DQF-COSY φάσματα [90] καταγράφηκαν με τη χρήση 2048 × 512 συγκρότημα σημεία δεδομένων χρησιμοποιώντας 8 σαρώσεις. Φάσματα αναφέρονται έμμεσα με το τετραμεθυλσιλάνιο μέσω των υπολειμματικών σήματα της δ

6-DMSO (2,5 ppm για

1). έχουν τα δεδομένα Tandem MS αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας HPLC σε συνδυασμό με φασματόμετρο μάζας IT-TOF (Shimadzu Europe GmbH, Duisburg, Γερμανία) με ιονισμό ηλεκτροψεκασμού σε θετικό τρόπο και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας LCMSSolution έκδοση του λογισμικού του πωλητή 3.60.361 με την Formula Predictor έκδοση 1.13. Για τον υπολογισμό των τύπων αθροίσματος, η μονοϊσοτοπική μάζα κατά μέσο όρο από τουλάχιστον τρεις σαρώσεις έχει χρησιμοποιηθεί. Οι ενώσεις διαχωρίστηκαν σε μία Kinetex C

18 στήλη (2.6 μm, 100 χ 3 mm, Phenomenex, Torrance, ΗΠΑ) χρησιμοποιώντας μία βαθμίδωση που κυμαίνεται από 5 έως 80% CH

3CN σε νερό πάνω από 25 λεπτά (0,1% μυρμηκικό οξύ προστίθεται ως τροποποιητής). ιόντα προδρόμου που αντιστοιχεί σε [Μ + Η]

+ απομονώθηκαν στην παγίδα ιόντων, διαμελισμένο από επαγόμενη σύγκρουση διάστασης (CID) χρησιμοποιώντας αργό ως αέριο σύγκρουσης (ενέργεια σύγκρουσης καθορίζεται σε 150%, αέριο σύγκρουσης στο 100%, και q ( Συχνότητα) έως 45,0 kHz), και διαχωρίζεται στον αναλυτή TOF. MS /MS σαρώσεις ήταν μέσες τιμές και μετατρέπεται σε μορφή mzXML χρησιμοποιώντας το λογισμικό του πωλητή και αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την mMass λογισμικού (υπολογισμένο ιόντα θραύσμα: M, a, b, c, και το ζ? Τροποποιήσεις: -Η

2O, -ΝΗ

3, + CO, ορίζεται, συνδυασμούς? ταιριάζουν με ανοχή 0.01 Da) [91]. Σχολιασμένη HRMS παράλληλα και

φάσματα 1H-NMR όλων των απομονωμένων ενώσεων μπορεί να βρεθεί στο S2 αρχείου.

Οι κυτταρικές σειρές και οι δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας

πρωτογενή ηπατοκύτταρα δεν είναι κατάλληλοι για τη μελέτη τοξικότητας μικροκυστίνης και τις μεταφορές , καθώς οι μεταφορείς ΟΑΤΡ μειωτικά μέσα σε λίγες ώρες μετά την τοποθέτηση κυττάρων σε καλλιέργεια [92]. Έτσι κυτταρικές σειρές HeLa και RKO ελήφθησαν από την ATCC και επιμολύνθηκαν με φορείς έκφρασης για OATP1B1 και OATP1B3. Ξεχωριστοί κλώνοι απομονώθηκαν με περιοριστική αραίωση, και απομονωμένους κλώνους που δείχνουν υψηλά επίπεδα έκφρασης με PCR χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω όπως περιγράφηκε προηγουμένως [72], [93]. Ατομική HeLa και RKO κλώνοι επιλέχθηκαν για περαιτέρω μελέτη με επίδειξη της αυξημένης πρόσληψης [

3Η] -BQ123, ένα υπόστρωμα για τις δύο μεταφορείς. Περαιτέρω, οι κλώνοι OATP1B3 κατέδειξε αυξημένη πρόσληψη του [

3Η] -CCK-8, ένα ειδικό υπόστρωμα για OATP1B3, αλλά δεν OATP1B1, ενώ οι κλώνοι OATP1B1 δεν έδειξε πρόσληψη του [

3Η] -CCK-8. Επιπλέον, RKO και HeLa κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με ένα άδειο φορέα έκφρασης χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Για προσδιορισμούς κυτταροτοξικότητας, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν εις τριπλούν σε πλάκες μικροτίτλου 96-φρεατίων σε μέσο που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου σε πυκνότητες 1,000 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 24 ώρες, μέσο που περιέχει MC δομικές παραλλαγές προστέθηκε στα κύτταρα. Μετά από άλλες 3 ημέρες, η επιβίωση των κυττάρων προσδιορίστηκε με μία δοκιμασία σουλφοροδαμίνης-based όπως έχουμε περιγράψει προηγουμένως [93] – [95]. Καθώς οι καμπύλες δόσης-απόκρισης για την απόπτωση που προκαλεί μικροκυστινών είναι απότομες και να πέσει στο μηδέν μέσα σε 72 ώρες, η δοκιμασία σουλφοροδαμίνης είναι ενδεικτική κυτταρικού θανάτου [72], [93]. Το IC

50 υπολογίστηκε από την καμπύλη απόκρισης δόσης ως η συγκέντρωση του φαρμάκου που παρήγαγε μια μείωση 50% στην μέση απορροφητικότητα σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα φρεάτια και αναφέρθηκαν ως ο μέσος όρος τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων προσδιορισμών που εκτελούνται εις τριπλούν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Prism .

Υποστήριξη Πληροφορίες

αρχείου S1.

Λεπτομέρειες για την απομόνωση του μικροκυστίνης πτητικά συστατικά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0091476.s001

(PDF)

αρχείου S2.

σχολιασμένη παράλληλα HRMS και

φάσματα 1H-NMR όλων των απομονωμένων ενώσεων. Πρώτες NMR και MS δεδομένα αυτών των ενώσεων είναι διαθέσιμα δωρεάν μέσω του Διαδικτύου σε https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880755.

doi:10.1371/journal.pone.0091476.s002

(PDF)

Acknowledgments

TN και MSH ευχαριστήσω κυανο Biotech GmbH για την υποστήριξη και την άδεια να δημοσιεύσει αυτό το χειρόγραφο. Ευχαριστούμε R. Lethaus-Weiß για τη βοήθειά της στην καλλιέργεια των στελεχών κυανοβακτηρίων και την εξαγωγή της βιομάζας, και Π Schmieder και Β Schlegel (FMP Berlin-Buch) για την καταγραφή των φασμάτων NMR.