Abstract

Μη συμβατικοί MHC τάξης Ι μόρια δεν MIC αλληλεπιδρούν με τον TCR, αλλά με NKG2D, μια λεκτίνη τύπου ενεργοποιητικού υποδοχέα που υπάρχει στις περισσότερες ΝΚ, γδ και CD8

+ αβ Τ κύτταρα . Ενώ αυτή η αλληλεπίδραση είναι κρίσιμη στην ενεργοποίηση /βαθμονόμηση την κυτταροτοξική δραστικότητα αυτών των κυττάρων, η πραγματική έκταση του

in vivo

εμπλοκή της, στον άνθρωπο, σε μόλυνση, του καρκίνου ή αυτοανοσία, χρειάζεται περαιτέρω αξιολόγηση. Η τελευταία έχει αποκτήσει δυναμική, μαζί με την αναφερόμενη επέκταση των περιφερικών CD4

+ CD28

-NKG2D

+ Τ κυττάρων στη ρευματοειδή αρθρίτιδα (RA). Πρέπει πρώτα άρχισε να επεκτείνει αυτή την έκθεση σε μεγαλύτερη ομάδα του όχι μόνο ασθενείς με ρευματοειδή αρθρίτιδα, αλλά και εκείνων που επηρεάζονται από συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ) και το σύνδρομο του Sjogren (SS). Στη ΡΑ και SS, η αρχική αυτή παρατήρηση εξετάστηκε περαιτέρω σε ιστούς στόχους: την από κοινού και το σιελογόνους αδένες, αντίστοιχα. Εν κατακλείδι και παρά περιστασιακή και αδιάκριτη επέκταση του προηγουμένως ενοχοποιούνται Τ κυττάρων υποπληθυσμό, καμία συσχέτιση μπορεί να παρατηρηθεί μεταξύ του CD4

+ CD28

-NKG2D

+ και αυτοανοσία. Επιπλέον,

in situ

, η παρουσία του NKG2D ίση με εκείνη των CD8

+, αλλά όχι εκείνη των CD4

+ Τ κύτταρα. Παράλληλα, η συνολική σάρωση των ιστών του σώματος και των δύο

MICA

και

MICB

μεταγραφή δείχνει σαφώς ότι, παρά την αρχική τεκμήρια, και με την εξαίρεση του κεντρικού νευρικού συστήματος, και τα δύο γονίδια μεταγράφονται ευρέως και ως εκ τούτου πιθανώς μεταφράζεται και δεσμευμένη σε μεμβράνη. Επεκτείνοντας αυτή την ανάλυση σε έναν αριθμό ανθρώπινων όγκων δεν αποκάλυψε ένα συνεκτικό σχήμα έκφρασης εναντίον φυσιολογικών ιστών. Συλλογικά αυτά τα δεδομένα αμφισβητούν τις προηγούμενες υποθέσεις, συσχετίζοντας ένα ιστο-ειδική έκφραση /επαγωγή του

MIC

σε σχέση με τις διαδικασίες αυτοάνοση ή όγκου

Παράθεση:. Schrambach S, M Ardizzone, Leymarie V, Sibilia J, Bahram S (2007)

In Vivo

πρότυπο έκφρασης των MICA και MICB και συνάφειά του με αυτοανοσία και ο καρκίνος. PLoS ONE 2 (6): e518. doi: 10.1371 /journal.pone.0000518

Ακαδημαϊκό Εκδότης: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Δημόσια-Santé, Λουξεμβούργο

Ελήφθη: 17 του Απρίλη 2007? Αποδεκτές: έβδομης Μαΐου του 2007? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου 2007

Copyright: © 2007 Schrambach et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το παρόν έργο υποστηρίχθηκε από το Université Louis Pasteur, το hôpitaux Universitaires de Strasbourg, την Association Française du Gougerot Sjögren et des σύνδρομα δευτερόλεπτα, το Λιγκ contre le τον καρκίνο, ο Σύλλογος pour la recherche sur le Καρκίνο (ARC).

οι ανταγωνιστικές ενδιαφέροντα: Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα κυτταροτοξικά CD8

+ και βοηθητικά CD4

+ αβ Τ κύτταρα αναγνωρίζουν τα συμβατικά πεπτίδιο-φορτωμένο Major σύμπλεγμα ιστοσυμβατότητας (. MHC) κατηγορίας Ι και II μορίων αντίστοιχα [1]. Ενώ η πρώτη αλληλεπίδραση οδηγεί στην εξάλειψη του ιικώς μολυσμένων ή τα tumorized κύτταρα στόχους, η τελευταία, βοηθά Amplify /ρυθμίζουν κατά κύριο λόγο την χυμική ανοσολογική απόκριση έναντι εξω ή αυτο-αντιγόνων [2], [3]. Παρά το γεγονός ότι αυτός ο ορισμός βιβλίο του προσαρμοστική ανοσολογική απάντηση είναι σαφής, η πραγματική ζωή λειτουργική /δυσλειτουργικές συνέπειες αυτών των αλληλεπιδράσεων, σε συνδυασμό με το δεύτερο, έμφυτη, παράγοντες της ασυλίας, είναι πολύ από το να είναι απλό. Αυτό είναι ίσως πιο παραδειγματικά στο αυτοάνοσες αντιδράσεις, όπου ανάλογα με την ασθένεια, τα είδη (ανθρώπου ή ποντικού στην ουσία) και το πειραματικό μοντέλο, διαφορετικά συστατικά του ανοσοποιητικού συστήματος έχουν διαδοχικά τεθεί στην πρώτη γραμμή, που οδηγεί στην λογική υπόθεση ότι σχεδόν όλοι οι φορείς του ανοσοποιητικού συστήματος που εμπλέκονται είτε στην ενεργοποίηση ή /και διαιώνιση της ασθένειας [4] – [6].

σε αντίθεση με τα παραπάνω συμβατικά μόρια MHC-I, MIC μόρια [7], [8] δεν αλληλεπιδρούν με τον TCR

per se

αλλά το κάνει με NKG2D, ένα ενεργοποιητικό υποδοχέα Ο-τύπου λεκτίνης που εκφράζεται επί ΝΚ, γδ και CD8

+ αβ Τ κύτταρα [9], [10 ]. Αυτή η αλληλεπίδραση έχει δειχθεί ότι κατισχύει της ανασταλτικής σήματος που παρέχεται από Killer ανασταλτικοί υποδοχείς (KIR) και /ή τα μόρια CD94 /NKG2A /B τα οποία αντιλαμβάνονται την παρουσία αντίστοιχα HLA-ABC και -Ε σε κύτταρα-στόχους. Ενώ σε Τ κύτταρα, NKG2D λειτουργεί ως συν-διεγερτικό μόριο [11], μπορεί να ενεργοποιήσει τα κύτταρα ΝΚ όπως επίσης και IL-15-ενεργοποιημένα ενδοεπιθηλιακών λεμφοκυττάρων Τ κατά τρόπο ανεξάρτητο TCR [12]. MIC-NKG2D εμπλοκής πιστεύεται ότι είναι κατά συνέπεια κρίσιμη για την εξάλειψη μολυσμένα κύτταρα και /ή όγκους [13], [14]. Είτε αυτή η αλληλεπίδραση είναι επίσης σχετική με αυτοανοσία είναι ένα θέμα πιο πρόσφατη έμφαση [15].

Η ρευματοειδής αρθρίτιδα (RA) είναι ένα αρχετυπικό αυτοάνοσο νόσημα και ως εκ τούτου συνεχίζει τις σημερινές γνώσεις και τις προκλήσεις μας σχετικά με την αυτοανοσία [16 ]. Ένα τεράστιο σώμα της εργασίας έχει αποδώσει σε πολλές υποθέσεις σχετικά με την έναρξη και την διαιώνιση της νόσου. Σε όλο το χρόνο, έχουν Τ κύτταρα ή Β κύτταρα έχουν αναγνωριστεί ως κύρια φορείς της ασθένειας. Η υποθετική ιστού-ειδική ή συστημική auto-αντιγόνο (α) στον άνθρωπο παραμένει ασαφής, σε αντίθεση με διάφορες φυσικές ή διαγονιδιακά /γονίδιο στοχευμένη ζωικά μοντέλα όπου πολλοί αυτο αντιγόνα έχουν αναγνωρισθεί να είναι σε θέση να κινήσει την ασθένεια [17]. Ένα από τα πρόσφατα θεωρούμενων παραγόντων ΡΑ παθογένεση έχει διαβιβαστεί ως ένα διακριτό πληθυσμό CD4

+ Τ κύτταρα τα οποία δεν έχουν το συν-διεγερτικό μόριο CD28 και έχουν αναφερθεί να επεκταθούν στην RA [18], [19]. Πιο πρόσφατες έρευνες ανέφεραν ότι αυτά τα Τ κύτταρα εκφράζουν, αντί του CD28, η ανωτέρω περιγραφείσα NKG2D [15]. Το ακόλουθο έργο ξεκίνησε την παραδοχή αυτή και με στόχο να αναπαράγουν την πρώτη αυτά τα αρχικά δεδομένα σε ένα μεγαλύτερο, καλύτερο ορίζεται, ομάδα των ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα. Είναι επεκτάθηκε περαιτέρω σε δύο άλλα αυτοάνοσα νοσήματα: συστηματικό ερυθηματώδη λύκο (ΣΕΛ) και το σύνδρομο Sjögren (SS). Σε ΑΚ και SS πλήττονται οι ασθενείς ήταν επίσης δυνατό να εξετάσουν

MIC

επίπεδο έκφρασης σε ιστούς στόχους, τόσο σε αγγελιαφόρο RNA και το επίπεδο της πρωτεΐνης. Επιπλέον στο περιφερικό αίμα εκτός μέτρηση της παρουσίας CD4

+ NKG2D

+ κύτταρα per se, θέτουμε επίσης να αναλύσει την β ρεπερτόριο TCR αυτών των κυττάρων σε ορισμένα άτομα (βλέπε

infra

). Τέλος, και για πρώτη φορά, μια ολοκληρωμένη οργάνων /ιστών σάρωση επιτρέπεται να αποκαλύψει το γεγονός ότι σε αντίθεση με ό, τι είχε αρχικά υποτεθεί και έχει εγγραφεί από εγχειρίδια [20], και με την εξαίρεση του κεντρικού νευρικού συστήματος,

MICA

και

MICB

μεταγράφηκαν σχεδόν σε κάθε ιστό /όργανο που εξετάστηκαν. Η περαιτέρω επέκταση αυτής της ανάλυσης να tumorized δείγματα βοήθησε δώσει μια καλύτερη κατανόηση του

MIC

μεταγραφή τόσο για την υγεία και την ασθένεια.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι ασθενείς και οι έλεγχοι

25 υγιείς εθελοντές καθώς και 75 ασθενείς που πάσχουν από ρευματοειδή αρθρίτιδα (n = 35? 1988 κριτήρια του αμερικανικού Κολλεγίου Ρευματολογίας) [21], σΕΛ (n = 15? 1997 αναθεωρήθηκε κριτήρια του αμερικανικού Κολλεγίου Ρευματολογίας) [22] και SS ( n = 25? 2.002 Αμερικής και της Ευρώπης κριτήρια) [23] συμπεριλήφθηκαν σε αυτή τη μελέτη (Πίνακας 1). Όλα τα δείγματα ελήφθησαν από εθελοντές που συμμετέχουν στην κλινική Ρευματολογίας του Στρασβούργου Πανεπιστημιακά Νοσοκομεία και συλλέχθηκαν κατά τη συνήθη κλινική (διαγνωστική /προγνωστική /θεραπευτικές) τις διαδικασίες που καθορίζονται από έναν από τους συν-συγγραφείς, ο Δρ J. Sibilia. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε άτομο σε συμφωνία με τη δήλωση του Ελσίνκι και τη γαλλική νομοθεσία, σύμφωνα με την οποία δεν ήταν αναγκαία η έγκριση από την επιτροπή δεοντολογίας σε αυτή την περίπτωση. Όλοι οι ασθενείς και οι έλεγχοι ήταν άσχετες.

Η

κυτταρομετρίας ροής

Το παρακάτω, ποικιλοτρόπως συζευγμένο (PE, FITC, PerCP, Cy5 ή APC) αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν σε τρίθυρες και -four- χρώμα κυτταρομετρία ροής: αντι -CD3, -CD4, -CD5, -CD8, -CD16, -CD19, -CD28, -CD45, -CD45RA, CD45RO, -CD56, -CD94, -CD158a, -CD158b, -NKG2A, – TCR γδ. Το ρεπερτόριο των Τ κυττάρων αναλύθηκε με την ακόλουθη ΡΕ και FITC συζευγμένο αντι-TCRV

β (1, 2, 3, 4, 5.1, 5.2, 5.3, 7.1, 7.2, 8, 9, 11, 12, 13.1, 13.2 , 13.6, 14, 16, 17, 18, 20, 21.3, 22, 23) (Beckman Coulter) αντισώματα. Ισότυπου-μάρτυρες χρησιμοποιήθηκαν για κάθε χρώση. NKG2D έκφραση αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ΡΕ-συζευγμένα ON72 (Beckman Coulter) και 1D11 (BD PharMingen), είτε ΡΕ-συζευγμένα ή βιοτινυλιωμένο? ο τελευταίος ανιχνεύεται από στρεπταβιδίνης-PC5 (BD PharMingen). Κυττάρων περιφερικού αίματος μελετήθηκαν είτε μη κλασματοποιημένη ή μετά τη φυγοκέντρηση Ficoll κλίση πυκνότητας. Μονοπύρηνα κύτταρα απομονώθηκαν επίσης με φυγοκέντρηση σε διαβάθμιση πυκνότητας Ficoll από αρθρικό υγρά που λαμβάνονται από 1 RA, 3 οστεοαρθρίτιδα και 2 ασθενείς μη αυτοάνοσες αρθρίτιδα. Η κυτταρομετρία ροής εκτελέστηκε είτε σε BD FACSCalibur ™ (Becton Dickinson) ή FC 500 συστήματα (Beckman Coulter).

Η ανοσοϊστοχημεία

αρθρικό ιστών ελήφθησαν από ασθενείς 1 RA αγκώνα και 1 οστεοαρθρίτιδα κατά τη ώρα αρθροπλαστική γόνατος. Σιελογόνων αδένων ιστοί ελήφθησαν από 4 SS και 1 υγιείς εθελοντές κατά τη διάρκεια της ρινοπλαστικής. Για ανοσοϊστοχημεία, 4 μm τομές κρυοστάτη έγιναν από αρθρικούς ιστούς ή τους σιελογόνους αδένες και καταψύχθηκαν ταχέως σε υγρό άζωτο. Οι διαδοχικές τομές σταθεροποιήθηκαν σε ακετόνη, ξηράνθηκε στον αέρα, επανυδατώνονται εντός PBS, και αποκλείστηκαν με 0.3% υπεροξείδιο του υδρογόνου. Οι τομές επωάστηκαν με αντι: -NKG2D mAb 1D11 (BD PharMingen), -MIC mAb 6D4 (BD PharMingen), -CD4, -CD8 για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Η δέσμευση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας βιοτινυλιωμένο δευτερογενές αντι-IgG και στρεπταβιδίνη υπεροξειδάσης. Ακολούθησε χρώση με αιματοξυλίνη Harris και τοποθετείται με Glycergel.

Northern Blotting

κηλίδες ανθρώπινου mRNA αγοράστηκε από την Invitrogen (Invitrogen Βόρεια Εδάφη). Οι μεμβράνες διαδοχικά σε υβριδισμό με το

MICA, β-ακτίνη

και

β

2-μικροσφαιρίνη (β

2 μέτρα)

cDNA, υποβάλλεται στη συνέχεια σε υψηλές πλύσεις αυστηρότητας (64 ° C , 0,1 χ SSC, 0,1% SDS), πριν από την έκθεση σε φιλμ Kodak ΧΟΜΑΤ (Eastman Kodak, Rochester, ΝΥ) για αντίστοιχα 8 ώρες στους -70 ° C, 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και 4 ώρες στους -70 ° C αντίστοιχα.

σε πραγματικό χρόνο ποσοτική σιελογόνων αδένων βιοψίες PCR

Αξεσουάρ ελήφθησαν από ένα ανεξάρτητο σύνολο των 20 (19 θηλυκά και ένα αρσενικό? μέσος όρος ηλικίας 51, μέση 52) ασθενείς με πρωτοπαθή SS. Σιελογόνων αδένων από 5 ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση στοματοπροσωπικά (για τις ανεξάρτητες αιτίες) ελήφθησαν κατά τη διάρκεια των διαδικασιών και αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου, ενώ τόσο παθολογίας, καθώς και το ιστορικό του ασθενούς περαιτέρω εξαλειφθεί οποιαδήποτε σημάδια της αυτο-ανοσία σε αυτά τα άτομα ελέγχου. Το συνολικό κυτταρικό RNA απομονώθηκε με ΤΚΙζοΙ LS® (Invitrogen) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. Η ποιότητα του RNA εκχυλίζεται εξακριβώθηκε μέσω ηλεκτροφόρησης γέλης. 1 μg του ολικού RNA υποβλήθηκε σε αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας ολιγο-άΤ και το ™ Αντίστροφη σύστημα μεταγραφής IMPROM-II (Promega), ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή. Πραγματικού χρόνου ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε σε ένα ΑΒΙ PRISM 7000 χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα ολιγονουκλεοτίδια και ανιχνευτές TaqMan®. Τα επίπεδα έκφρασης του

MICA

και

MICB

βαθμονομήθηκαν χρησιμοποιώντας εκείνη του σπιτιού κρατώντας 18S RNA ανιχνεύεται χρησιμοποιώντας την ακόλουθη προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές αντίστοιχα 3′-CGGCTACCACATCCAAGGAA-5 ‘, 3’-GCTGGAATTACCGCGGCT -5 »και SYBR Green.

MICA

μεταγραφές ανιχνεύτηκαν χρησιμοποιώντας την ακόλουθη προς τα εμπρός, η αντίστροφη ολιγονουκλεοτίδια και TaqMan® διερευνητή αντίστοιχα 3′-CAGCTGCAAACGCCTCATATC-5 ‘, 3′-TGACCTATGAAACAGAGAAAATAAAAGC-5′ και 3’-ACATTTTGCAGCCTCCAACAACAATAAATAAGTG-5 ‘και των

MICB

με F 3′-CACCCAGGCTGCAGTTCACT-5 ‘, 3′-R CGGGAGTCTGAGGTACGAGAA-5′, 3’-ACCTCTGCCTCCCAGGTTCAAGCAC-5 ‘με την ίδια σειρά όπως παραπάνω. Θετική ρύθμιση προς τα άνω του

MIC

μεταγραφή διαπιστώθηκε σε κύτταρα HeLa καλλιεργούνται χωρίς θεραπεία ή θερμότητας συγκλόνισε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [24].

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Παρά το γεγονός ότι το αρχικό » glitch «προκαλώντας αυτοάνοσα νοσήματα γενικά και τη ρευματοειδή αρθρίτιδα ειδικότερα, παραμένει ως επί το πλείστον αινιγματική, δεκαετίες έρευνας έφεραν μαζί αρκετά αληθοφανή σενάρια, ενώ κατά την έναρξη, διάφορα μονοπάτια και καταρράκτες τείνουν να περισσότερο ή λιγότερο διαιωνίζουν μια αυτο-αντιδραστικών (Τ και /ή Β κύτταρο οδηγείται) δύναμη, οδηγώντας τελικά σε συμπτωματική παθολογία [6], [25] – [28]. Μία από τις τελευταίες ενοχοποιούνται Τ κυττάρου υποπληθυσμοί ως τέτοια, είναι το κλάσμα του CD4

+ βοηθητικά Τ κύτταρα που εκφράζουν τον υποδοχέα NKG2D ενεργοποίησης, αλλά στερείται του συν-διεγερτικού μορίου CD28 [15]. NKG2D, ένας τύπος-ΙΙ trans-μεμβράνης επιφάνεια ομοδιμερές αποτελείται από μία λεκτίνη τύπου C εξωκυτταρική περιοχή, που ακολουθείται από μια διαμεμβρανική και σε μικρή κυτταροπλασματική ουρά στερείται συγκεκριμένης λειτουργίας σηματοδότησης. Το μόριο σηματοδοτεί πράγματι (τουλάχιστον στον άνθρωπο) μέσω αλληλεπίδρασης με το trans-μεμβράνης πρωτεΐνη προσαρμογέας DAP 10 (DAP 10 και DAP12 σε mus ανάλογα με την ισομορφή NKG2D) [29]. NKG2D αναγνωρίζει μια ποικιλία από μακρινή συγγένεια μη συμβατικών MHC τάξης Ι μόρια? στον άνθρωπο MIC [7] και RAET1 [30] (ULBP) [31] και το ποντίκι RAE1 και Η60 [9], [29]. Ο αρχικός σκοπός της εργασίας αυτής ήταν να προωθήσει τη γνώση μας για τον πιθανό ρόλο της αλληλεπίδρασης MIC-NKG2D σε αυτοανοσία στον άνθρωπο. Για τέτοια να είναι η περίπτωση, (τουλάχιστον) πρέπει να πληρούνται δύο προϋποθέσεις: (1) κατ ‘αρχάς και ιδανικά, όργανα-στόχους για αυτοανοσία (εξ ου και δυνητικά όλα τα όργανα ή /και ιστούς), δεν πρέπει να εκφράζουν MIC στην βασική κατάσταση, σε με άλλα λόγια, MIC πρέπει να ανιχνευθεί μόνο σε νοσούντες ιστούς ή παθολογικές καταστάσεις. (2) δεύτερον, ότι η συστηματική ή /και ιστών διεισδύσει αυτοδραστικών CD4

+ Τ κύτταρα εκφράζουν NKG2D και να επεκταθεί μάλιστα σε τέτοια ασθένεια? ένα προοίμιο για το δυναμικό λειτουργικό ενδιαφέρον τους.

Ξανά και αν ο ορισμός βιβλίο του MIC έκφραση είναι αυτή της οιονεί περιορισμό σε εντεροκύτταρα [20], [24], η πραγματικότητα απέχει πολύ από το να είναι τόσο ξεκάθαρη και αυτή η απλουστευτική θέα απλά δεν ανταποκρίνεται στην πραγματικότητα (βλέπε παρακάτω). Πράγματι, οι πρώτες μονοκλωνικά αντισώματα εγείρονται έναντι MICA αποδείχθηκε για τη χρώση κατά προτίμηση, αν όχι οιονεί αποκλειστικά, τα ανθρώπινα εντεροκύτταρα, με την αξιοσημείωτη εξαίρεση του θυμικού επιθηλίου [24]. Αυτό ήταν σύμφωνο με την αρχική Βόρεια blottings τονίζοντας τη μεταγραφή του γονιδίου, δεν σε κυτταρικές σειρές (μεταμορφώθηκε) του lymphohematopoeitic καταγωγή, αλλά σε εκείνες των επιθηλιακών /ινοβλαστικά προέλευσης [7]. Από την άλλη πλευρά, τα πειράματα μεταφοράς γονιδίων έχουν δείξει σαφώς, ξανά και ξανά, ότι δεν έχει σημασία η καταγωγή του αποδέκτη κυτταρικής γραμμής, αν το διαγονίδιο (κάτω από ένα heterelogous υποκινητή που είναι) είναι σωστά μεταγράφεται, το MIC πρωτεΐνη πάντοτε συντίθεται και φτάνει κυτταρική επιφάνεια [24], [32] – [37], ως εκ τούτου αποκλείοντας κάθε κυτταρικό »στοιχείο (-α) περιορισμού» όπως αυτές που φαίνονται precedently να απαιτείται για την ορθή έκφραση επιφανείας των άλλων μη κλασική γονιδίων MHC κατηγορίας Ι, π.χ. αλληλουχία σήματος κλασική HLA πεπτίδια προερχόμενα στην περίπτωση HLA-E /Qa-1 στον άνθρωπο /ποντικό [38] ή από βακτήρια που προέρχονται από Ν-φορμυλιωμένο πεπτιδίων σε περίπτωση Η2-Μ3 το ποντίκι [39]. Ως εκ τούτου, το κρίσιμο ερώτημα είναι σε ποιο ιστού /οργάνου

MICA

και

MICB

πράγματι μεταγράφονται, οπότε θα μπορούσε κανείς να υποθέσει με βεβαιότητα επακόλουθη έκφραση επιφάνειά τους. Ως ασήμαντο, όπως το ζήτημα αυτό μπορεί να φαίνεται, σχεδόν 15 χρόνια από την αναγνώρισή τους [7], δεν υπάρχει συστηματική ανάλυση της μεταγραφής του

MIC

γονίδια έχει δημοσιευθεί μέχρι σήμερα. Εδώ σας παρουσιάζουμε μια πρώτη τέτοια ανάλυση. Πράγματι εκτεταμένη κηλίδωση Northern ενός μεγάλου αριθμού των ανθρώπινων ιστών και οργάνων δείχνει σαφώς ότι, σε αντίθεση με τις προηγούμενες τους ισχυρισμούς, τόσο

MICA

και

MICB

είναι ευρέως μεταγράφονται. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 (άνω πλαίσιο), αυτές οι μεταγραφές που βρέθηκαν σχεδόν σε κάθε όργανο που εξετάστηκαν με την αξιοσημείωτη εξαίρεση του κεντρικού νευρικού συστήματος (άνω, ακραία δεξιά πάνελ, Εικόνα 1). Αυτό συσχετίζεται πράγματι απόλυτα με το πρότυπο μεταγραφής της κλασικής loci MHC-I, όπως αποδεικνύεται με ανίχνευση των ίδιων μεμβρανών με

β

2m

cDNA ανιχνευτή (ενδιάμεσο πάνελ, Εικόνα 1). Δίνοντας μεγαλύτερη προσοχή στην

MIC

πρότυπο έκφρασης, παρατηρεί κανείς ότι ακόμη και ένα όργανο «γεμίζουν» με lymphohematopoeitic κύτταρα – η σπλήνα – δεν στερείται

MICA

μεταγραφές και περιέχει

MICB

μεταγραφές σε ίσες ποσότητες και σε άλλα όργανα (πνεύμονες, τους νεφρούς …). Και πάλι, η σαφής έλλειψη

MIC

από το κεντρικό νευρικό σύστημα είναι αξιοσημείωτη, και μάλιστα απροσδόκητο, κατά το ότι παραλληλίζεται σαφώς ότι τα γονίδια της κλασικής MHC-I (

β

2m

πάνελ ) και αυτό παρά το γεγονός ότι τουλάχιστον οι άμεσες περιοχές υποκινητή από αυτούς τους τόπους (

MIC

και συμβατικά

MHC-I

) δεν παρουσιάζουν καμία εμφανή ομολογία ακολουθίας [24]. Τέλος, και προκειμένου να καλυφθούν οι λόγοι όσο το δυνατόν περισσότερο σε σχέση με την

MIC

μεταγραφή, επεκτείναμε αυτήν την μεταγραφική γραφημάτων από υγιείς για να tumorized ιστούς. Ένας αριθμός των όγκων διαφόρων τύπων ιστών αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν με υγιείς γειτονικούς ιστούς (Σχήμα 2). Και πάλι,

MIC

μεταγραφή ήταν ευρέως σήμερα, και όχι γενικό πρότυπο της επαγωγής /καταστολής θα μπορούσε να παρατηρηθεί σε όγκους έναντι υγιείς ιστούς (Σχήμα 2), σε αντίθεση με precedently πρότεινε [13]. Ως εκ τούτου, όλα σε όλους,

MIC

μεταγράφεται σχεδόν σε κάθε εξεταζόμενο ιστό με την αξιοσημείωτη εξαίρεση του κεντρικού νευρικού συστήματος. Η συνολική μοτίβο σε όγκους είναι ενδεικτική ενός «χαλαρό» μοτίβο μεταγραφής. Ο λόγος για τον οποίο ορισμένοι αντι-MIC αντισώματα έχουν προφανώς φαίνεται να απεικονίζουν ένα περιορισμένο πρότυπο έκφρασης ιστού πρέπει, συνεπώς, να βρίσκεται αλλού, π.χ. γενετικός πολυμορφισμός [40], διάφορα Ν-συνδεδεμένη πρότυπα γλυκοζυλίωσης (MICA διαθέτει 8 πιθανές θέσεις Ν-συνδεδεμένης γλυκοζυλίωσης) [7], [24].

Ο πίνακας αντιπροσωπεύει RNA που προέρχονται από μεγάλα ανθρώπινα όργανα. Κάθε πίνακας περιέχει RNA πνεύμονα ως εσωτερικό πρότυπο. Κορυφαία πάνελ υποβλήθηκε σε υβριδισμό με

MICA

cDNA. Το μήκος διαφορική μεταγραφή του

MICA

και

MICB

οφείλεται σε τεκμηριωθεί προηγουμένως μεγαλύτερο 3’UT στο

MICB

mRNA [50]. Το μεσαίο πάνελ απεικονίζει την έκφραση του

β

2m

, ενδεικτικό της β

δεσμεύεται συμβατικά έκφραση 2m MHC-I. Τέλος, η

β-ακτίνης

μεταγραφή ενεργεί ως μάρτυρας φόρτωσης. Για πιο λεπτομερή εξήγηση βλέπε κυρίως κείμενο.

Η

Η ίδια διάταξη όπως στο Σχήμα 1 ισχύει, αλλά αυτή τη φορά οι κηλίδες περιέχουν λωρίδες όγκου και ελέγχου (δίπλα ελεύθερη νόσου των ιστών).

Η

Αφού διαπιστώθηκε ότι

MIC

μεταγράφεται και επομένως δυνητικά μεταφραστεί σε οποιαδήποτε /κάθε ιστό, θέτουμε τώρα να εξετάσει την καταλληλότητα των

MIC

και εμμέσως ότι του MIC-NKG2D έκφραση σε αυτό- ασυδοσία. Για τέτοια, επελέγησαν τρία πρωτότυπο αυτοάνοσα νοσήματα, λόγω της ίδιας της σημασίας τους στην κατανόηση της ανθρώπινης αυτοανοσία [25], [41], [42], την κλινική /ιατρικό ενδιαφέρον καθώς και το γεγονός ότι σε σχέση με RA, προηγούμενα στοιχεία είχαν επισημάνει MIC-CD4

+ NKG2D

+ αλληλεπίδρασης σε αιτιολογία της ασθένειας /παθογένεια [15]

Για την ανάλυση αυτή έχουν συγκεντρωθεί τα ακόλουθα ομάδα των ατόμων:. 25 υγιείς μάρτυρες και 75 ασθενείς που πάσχουν από τα προαναφερθέντα αυτοάνοσες διαταραχές, δηλαδή 35 RA, 15 ΣΕΛ και 25 SS (Πίνακας 1). Μεταξύ αυτών μια υποομάδα των οποίων 10 άτομα ελέγχου, 10 RA, 2 SS και 2 ασθενείς με SLE είχαν εκτενώς ανοσοφαινότυπου με ένα ευρύ πάνελ αντισωμάτων, σε διάφορους συνδυασμούς, έτσι ώστε να μετρηθεί εσωτερικά πρότυπα πριν από την πλήρη προσπάθεια κλίμακας (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι για την πλήρη κατάλογο των αντισωμάτων). Με αυτόν τον τρόπο διερευνήθηκαν διάφορους πληθυσμούς κυττάρων Τ, Β και ΝΚ. Καμία σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε μεταξύ του ασθενούς και των πληθυσμών ελέγχου (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Πιο συγκεκριμένα η κατανομή των NKG2D στην επιφάνεια του αβ CD8

+ και γδ Τ λεμφοκύτταρα όπως επίσης και κύτταρα ΝΚ, που αρχικά ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας ολικό παρασκευασμάτων κυττάρων περιφερικού αίματος, δεν αποκάλυψε, όπως αναμενόταν, κάθε αξιοσημείωτη διαφορά μεταξύ ασθενών και μαρτύρων. Στη συνέχεια γύρισε την εστίασή μας στον πληθυσμό του ενδιαφέροντος δηλαδή CD4

+ NKG2D

+ Τ κυττάρων (Σχήμα 3). Η αναλογία των NKG2D έκφρασης CD4

+ Τ κύτταρα βρέθηκε να είναι εξίσου παρόμοια σε όλες τις υγιείς εθελοντές (0,8 έως 8,5%, μέσος όρος 2,7%, τυπική απόκλιση 2), όλα τα RA (0,4 έως 9,7%, μέσος όρος 2,1%, τυπική απόκλιση 1,9), όλα SLE (0,3 έως 7,8%, μέσος όρος 2,4%, τυπική απόκλιση 2), και όλοι οι ασθενείς SS (μηδέν έως 36,2%, μέσος όρος 4%, τυπική απόκλιση 7,6) (Σχήμα 4). Δύο ασθενείς SS πράγματι βρέθηκαν να έχουν υψηλότερα NKG2D έκφραση σε CD4 τους

+ Τ κύτταρα (18,6% και 36,2% αντίστοιχα) (βλέπε παρακάτω για περαιτέρω ανάλυση) (σχήματα 4 και 3.

Σημείωση

: Εικόνα 3 απεικονίζει πράγματι ένα τέτοιο ασθενή). Επειδή μια μελέτη προηγούμενο, το οποίο είχε βρεθεί σημαντικά υψηλότερη CD4

+ NKG2D

+ Τ κύτταρα στο ΡΑ έναντι ελέγχων, είχε χρησιμοποιήσει μια άλλη αντι-NKG2D mAb, δηλαδή 1D11 (BD PharMingen) (έναντι της ανωτέρω χρησιμοποιείται ON72 κλώνος , Beckman Coulter), ελέγξαμε επίσης αυτό το αντίσωμα. Σύγκριση της χρώσης NKG2D είτε με αντισώματα σε CD4

+ Τ κύτταρα σε 3 υγιείς εθελοντές, 4 RA, 1 ΣΕΛ και 2 SS δεν αποκάλυψε καμία σημαντική διαφορά (μέση διαφορά: 0,21? Τυπική απόκλιση: 0,24). Επιπλέον, συγκρίναμε επίσης αυτό ανοσοφαινοτυποποίηση σύγκριση συνολικού περιφερικού αίματος εναντίον μονοπύρηνα κύτταρα, χρησιμοποιώντας ON72 mAb. Αυτό εκτιμάται σε 1 υγιείς εθελοντές, 2 RA και 2 SS χωρίς υπαινίχθηκε σε οποιαδήποτε διαφορά (μέση διαφορά: 0.33? Τυπική απόκλιση: 0,52). Τέλος, και προκειμένου να επικυρώσει πλήρως την εγκατάσταση, ενδο-ατομική σταθερότητα NKG2D έκφρασης CD4

+ Τ λεμφοκύτταρα επαληθεύτηκε την πάροδο του χρόνου σε 2 υγιείς εθελοντές σε αντίστοιχα ημέρες 1/14 και 1/120, για 1 RA ασθενή σε δ1 /D120 και για 2 ασθενείς SS στο d1 /D150. παρατηρήθηκαν σε διαφορετικούς υποπληθυσμούς λεμφοκυττάρων και ιδιαίτερα εκείνων CD4

+ Τ κύτταρα που εκφράζουν NKG2D:?: Δεν αξιοσημείωτες διαφορές (0,5 μέση τυπική απόκλιση 0,31). Δεδομένου ότι η ίδια προαναφερθείσα έκθεση είχε υπαινιχθεί την επαγωγή της έκφρασης NKG2D σε CD4

+ Τ κυττάρων μετά adjunction του TNFα (

in vitro

), ασθενείς με ΡΑ υπό θεραπεία με αντι-TNFα δεν είχαν συμπεριληφθεί σε αυτό το μελέτη, παρά το γεγονός ότι μια προκαταρκτική ανάλυση των τριών ασθενών με ΡΑ που έλαβαν θεραπεία με infliximab δεν έδειξαν καμία σημαντική διαφορά από το επίπεδο NKG2D έκφρασης CD4

+ Τ λεμφοκύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ως εκ τούτου, όλα σε όλους, δεν ήμασταν σε θέση να βρει κάποια σημαντική διαφορά μεταξύ των CD4

+ NKGD

+ πληθυσμού σε υγιείς μάρτυρες εναντίον RA, SS ή ΣΕΛ ασθενείς. Τέλος, το Σχήμα 5 δίνει μια πλήρη εικόνα της

+ πισίνα κυττάρων Τ CD4 σε σχέση με NKG2D και /ή παρουσία ή απουσία CD28.

Αυτό το παράδειγμα, που λαμβάνονται από έναν από τους δύο ασθενείς SS (κα XET) φιλοξενεί μια ιδιαίτερα υψηλή αναλογία CD4

+ NKG2D

+ Τ κύτταρα (36,2%) απεικονίζει τη μεθοδολογία που χρησιμοποιήθηκε για την απαρίθμηση αυτών των κυττάρων σε όλα τα άτομα (μάρτυρες και ασθενείς) που περιλαμβάνονται σε αυτό το έργο κατά τη διάρκεια μιας ρουτίνας 50 000 εκδηλώσεις ανάλυση.

η

Αυτό το σχήμα απεικονίζει την αναλογία των CD4

+ NKG2D

+ Τ κυττάρων στα πλαίσια της συνολικής περιφερική πισίνα CD4 στον έλεγχο, RA, SLE και SS άτομα. Η μεταβλητότητα σε ασθενείς SS οφείλεται σε 2 άτομα τα οποία αντιπροσωπεύουν μια ασυνήθιστα υψηλή αναλογία (βλέπε κυρίως κείμενο για επεξήγηση). Καμία από τις διαφορές είναι σημαντικές, όπως εκτιμάται από το κείμενο Wilcoxon: p = 0,1658 για τους ελέγχους εναντίον RA? p = 0,9547 για τους ελέγχους εναντίον ΣΕΛ και p = 0,5012 για τους ελέγχους συναρτήσει του SS.

Η

Αυτό, πιο σφαιρική εικόνα, αναλύει την αναλογία των CD4

+ Τ κύτταρα που φέρουν ή όχι CD28 και /ή NKG2D, ή όχι. Καμία από τις διαφορές είναι στατιστικά σημαντική.

Η

Ο τελικός στόχος σε RA είναι το κοινό, που ορίζεται δίπλα για να αναλύσει την CD4

+ NKG2D

+ επίπεδα έκφρασης μέσα σε μονοπύρηνα κύτταρα το ρευστό αρθρική συλλέχθηκαν μετά από φυγοκέντρηση πυκνότητας Ficoll διαβάθμιση από το ένα αγκώνα RA και 5 ελέγχους (τρία οστεοαρθρίτιδα γονάτου και δύο μη-άνοση γόνατο αρθρίτιδα) ασθενείς. Και πάλι δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην έκφραση του NKG2D επί CD4

+ Τ κύτταρα τονίστηκε μεταξύ των ελέγχων και RA σε κοινές υγρά, και μεταξύ του περιφερικού αίματος και αρθρικού υγρού σε έναν ασθενή RA (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Για να διερευνηθεί περαιτέρω η σημασία της έκφρασης της NKG2D επί CD4

+ και CD8

+ Τ κυττάρων

in situ

, αρθρικούς ιστούς αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία, προκειμένου να προσδιοριστεί ποσοτικά η παρουσία του CD4, NKG2D, CD8 και MICA /Β κύτταρα που εκφράζουν. Αυτό έγινε σε μία RA (αρθροπλαστική ισχίου) και ένας έλεγχος οστεοαρθρίτιδα (χειρουργική επέμβαση στο γόνατο) άτομο. Στον έλεγχο άτομο NKG2D βρέθηκε να εκφράζεται σε 3,8% του περιφερικού αίματος CD4

+ Τ λεμφοκυττάρων έναντι 2,5% εκείνων που βρίσκονται στο αρθρικό υγρό. Δεδομένου ότι το άτομο αυτό δεν φέρει καμία ενεργή ενδο-αρθρική φλεγμονή, δεν ήταν έκπληξη να μην παρατηρήσει μια αξιοσημείωτη διείσδυση των CD4

+, CD8

+ +/- NKG2D

+ λεμφοκύτταρα (δεν MIC έκφραση βρέθηκε είτε σε αυτόν τον ασθενή). Στον ασθενή RA, NKG2D εκφράστηκε στο 0,9% των κυκλοφορούντων CD4

+ Τ κύτταρα (χωρίς αρθρικό υγρό μπορεί να ανακτηθεί από το ισχίο RA υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση). Ο ιστός διεισδύσει σε RA (Σχήμα 6Α) ήταν κυρίως CD4

+ (Σχήμα 6Β), ενώ η έκφραση CD8 ήταν λιγότερο σημαντική (Σχήμα 6C). NKG2D έκφραση ήταν σαφώς αποκλειστικά των CD4 και περισσότερο με εκείνη των CD8 (Σχήμα 6D) (Σημ .: αυτά είναι διακριτά τμήματα του ιστού, ως εκ τούτου, δεν υπάρχει υπέρθεση έχει νόημα). Τέλος, MICA /B εκφράστηκε επί ινοβλαστικών επιθηλιακών κυττάρων /και όχι σε φλεγμονώδεις διηθήσεις (Σχήμα 7Α και Β).

(Α) Χρώμα λεκές με χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση με τη χρήση (Β) CD4 (C) CD8 και (Δ) NKG2D αντισώματα. Η διήθηση είναι σαφώς λεμφοκυτταρικής προέλευσης με την πλειοψηφία των CD4 Τ κυττάρων.

Η

Ανοσοϊστοχημική ανάλυση του (Α) (Β) υμενίτιδα RA και ενός (γ) (δ) SS αξεσουάρ σιελογόνων αδένων χρώστηκαν με ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-MICA. MIC έκφραση είναι σαφώς επιθηλιακών /ινοβλαστικών φύση και στις δύο ιστούς /όργανα.

Η

Παρά το γεγονός ότι τα αποτελέσματά μας σε RA είναι σε αντίθεση με μερικά από τα παλαιότερα δημοσιευμένα στοιχεία, ορισμένες διευκρινίσεις του τελευταίου μπορεί να βοηθήσει να βάλει τα αποτελέσματά μας και μάλιστα το όλο θέμα σε μια προοπτική. Πριν να το κάνουμε αυτό, είμαστε σαφώς δεν αναπαράγουν την εργασία από Groh et al. όσον αφορά την επέκταση των CD4

+ NKG2D

+ στη ΡΑ, αν κάναμε το καλύτερό μας για να κολλήσει με το πρωτόκολλο τους π.χ. χρησιμοποιώντας τα ίδια αντι-NKG2D αντισώματα κλπ [15]. Μπορεί να υπάρχουν λογικές εξηγήσεις για τέτοια, ένα ον έλλειψη λεπτομερών πληροφοριών σε σχέση με τον πληθυσμό των ασθενών τους, για παράδειγμα, το κλάσμα υπό θεραπεία με αντι-TNFα κ.λπ. Μια βαθύτερη ανάλυση της βιβλιογραφίας δείχνει πράγματι ότι η επέκταση του χρόνου αυτού, CD4

+ CD28

– Τ κύτταρα, δεν είναι τόσο παθογνωμονικό της ΡΑ, δεδομένου ότι μπορεί να φαινόταν στην αρχή [18]. Πράγματι, μια πιο πρόσφατη ανάλυση του ανεξάρτητου ομάδα των ασθενών που δείχνει σαφώς ότι το ήμισυ των ασθενών με ρευματοειδή αρθρίτιδα (n = 94) (σύμφωνα με τους συγγραφείς εκείνους που στερούνται οζώδης ΡΑ και σύνδρομο sicca) δεν έχουν σημαντική αύξηση στο περιφερικό τους CD4

+ CD28

– πισίνα Τ κυττάρων σε σχέση με τους ελέγχους (βλέπε Εικόνα 1 [43] Τέλος Saez-Borderias et al φέρει σε μια νέα συστροφή στο θέμα, αναφέροντας την επαγωγή των CD4

+ NKG2D..

+ Τ κυττάρων σε απόκριση του ανθρώπινου κυτταρομεγαλοϊού (HCMV), με αποτέλεσμα να οραματίζονται το γεγονός ότι η προηγούμενη αναφερθεί επεκτάσεις μπορεί να χρειαστεί να επανεκτιμηθούν υπό το πρίσμα του HCMV ορολογική κατάσταση των ασθενών και των ελέγχων. Αυτό ανοίγει επίσης το λεωφόρος για αυτό υποπληθυσμό να αναγνωρίζουν, πέρα ​​από HCMV, άλλους μικροβιακούς παράγοντες, ένα σημείο δεν έχει δοκιμαστεί σε προηγούμενες (και σήμερα) μελέτες [44].

για να εξετάσουν τη δυνητική σημασία των CD4

+ NKG2D

+ Τ κυττάρων στο ανοσοπαθολογία του SS, ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε επί των σιελογόνων αδένων τους ιστούς με στόχο τον εντοπισμό CD4, NKG2D, CD8 και MICA /B. Τρεις ιστούς σιελογόνων αδένων SS ελήφθησαν από βιοψία κατά τη διάρκεια της νοσηλείας, ενώ ιστό των σιελογόνων αδένων, ένας έλεγχος ελήφθη από ένα κατά τα άλλα υγιείς εθελοντές τους κατά τη ρινοπλαστική για ανεξάρτητους λόγους. Στο ατομικό έλεγχο, ο ανοσοϊστοχημεία δεν αποκάλυψε την παρουσία τυχόν αξιοσημείωτη αριθμούς CD4, CD8 και /ή κυττάρων που εκφράζουν NKG2D σε συμφωνία με την απουσία οποιασδήποτε φλεγμονώδη διήθηση? αυτό ήταν εξίσου η περίπτωση για έκφραση MICA /Β (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στο SS, NKG2D εκφράστηκε σε αντίστοιχα 0,4, 0,9, 2% του περιφερικού αίματος CD4

+ Τ λεμφοκύτταρα. Ανοσοϊστοχημεία (Σχήμα 8Α), εστιάζεται στη φλεγμονώδη διηθήματα, έδειξαν ότι σε όλες 3 ασθενείς, CD4 Τ κύτταρα ήταν πιο διαδεδομένη, και πάλι αλληλοαναιρούνται με CD8 χρώση (Σχήμα 8Β και C). Η ποσότητα και η κατανομή των NKG2D έκφραση φάνηκε να είναι συγκρίσιμη με εκείνη των CD8 αλλά όχι εκείνη του CD4 (Εικόνα 8D, C και Β). Επιπλέον, η έκφραση MICA /Β ανιχνεύθηκε σε επιθηλιακά κύτταρα του αδενικού κανάλια αλλά όχι επί λεμφοειδών διηθήσεις (Σχήμα 7C και D).

(Α) Χρώμα λεκές με χρώση αιματοξυλίνης-ηωσίνης. Ανοσοϊστοχημική ανάλυση με τη χρήση (Β) CD4 (C) CD8 και (Δ) NKG2D αντισώματα. Η διήθηση είναι σαφώς λεμφοκυτταρικής προέλευσης με την πλειοψηφία των CD4 Τ κυττάρων.

Η

Όσον αφορά την SS, δεδομένης της τεκμηριωμένη έκφραση των γονιδίων και πρωτεϊνών MIC σε επιθηλιακά κύτταρα [24], υποθετική συμμετοχή διαφόρων ιών σε SS παθοφυσιολογία [45] και της σχετικής ευκολίας να έχει πρόσβαση στον ιστό στόχο, δηλαδή σιελογόνων αδένων? έχουμε ως στόχο να ποσοτικοποιήσει το επίπεδο του

MIC

μεταγραφή σε υγιείς και SS πληγεί σιελογόνους αδένες. Αυτό επιτεύχθηκε με πραγματικού χρόνου ποσοτική ανάλυση PCR του

MICA

και

MICB

μεταγραφές. Πριν να το κάνουμε όπως στο RNA αδένα, η μεθοδολογία ελέγχθηκε σε κύτταρα HeLa? τεκμηριωμένα να υποθάλπουν

MICA /MICB

μεταγραφές σε σημαντικά επίπεδα, και οι οποίες ρυθμίζονται από το κελί του στρες, π.χ. θερμικού σοκ [7], [24]. θερμικού σοκ διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [24]. Όσον αφορά την

MICA

υπήρχε 8x επαγωγή μετά από 15 λεπτά και 3,5 × για

MICB

. Μετά από 60 λεπτά η επαγωγή παρέμεινε στο 4,5 × για

MICA

και 2 × για

MICB

. Τυπικές γραφικές παραστάσεις qRT-PCR δείχνονται στο Σχήμα 9Α και Β Εντός σιελογόνου αδένα ιστούς, αν και η έκφραση δείχνει μια σαφή διακύμανση μεταξύ των ατόμων, δεν υπάρχει σημαντική διαφορά μπορεί να παρατηρηθεί μεταξύ ασθενών και μαρτύρων (Σχήμα 10Α και Β).

MICA

(Α) και

MICB προφίλ

(Β) έκφρασης όπως αναλύθηκε με RT-qPCR. ▪ Τα δείγματα 15 λεπτά μετά από θερμικό σοκ, δείγματα ♦ 60 λεπτά μετά από θερμικό σοκ, ▴ χωρίς θεραπεία ελέγχους.

Η

Σχετική επίπεδο έκφρασης του

MICA

(Α) και

MICB

(Β) σε ασθενείς σύνδρομο Sjögren, σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Οι διαφορές μεταξύ των ασθενών και των ελέγχων δεν είναι σημαντικά, όπως αξιολογήθηκε με Mann-Whitney

τεστ U

(α = 0,27 για

MICA

και α = 0,53 για

MICB

).

Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, μεταξύ όλων των 75 ασθενών που αναλύθηκαν, δύο ασθενείς SS (κα XET και XRL? με αυτή τη σειρά σε αυτό το σημείο) πράγματι παρουσιάζουν ιδιαίτερα υψηλό ποσοστό των CD4

+ NKG2D

+ Τ λεμφοκυττάρων στο περιφερικό αίμα (αντίστοιχα 36,2% και 18,6%).