Αφηρημένο

Ο στόχος αυτής της μελέτης είναι να καθοριστεί εάν το υπεριώδες φως (UVC) σε ακτινοβολία σε συνδυασμό με χειρουργική με φθορίζουσα καθοδήγηση (FGS) μπορεί να εξαλείψει μεταστατικό ανθρώπινο καρκίνο του παγκρέατος σε ορθοτοπική μοντέλα γυμνό ποντίκι. Δύο εβδομάδες μετά ορθοτοπική εμφύτευση ανθρωπίνων MiaPaCa-2 καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος, που εκφράζουν πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP), σε γυμνούς ποντικούς, φωτεινό φως χειρουργική (BLS) διεξήχθη σε όλους τους ποντικούς που φέρουν όγκο (n = 24). Μετά BLS, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε 3 ομάδες θεραπείας? BLS-μόνο (n = 8) ή FGS (n = 8) ή FGS-UVC (n = 8). Οι υπολειμματικές όγκοι αποκόπηκαν χρησιμοποιώντας φορητές σύστημα απεικόνισης υπό πλοήγησης φθορισμού σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με FGS και FGS-UVC. Η χειρουργική εκτομή κλίνη ακτινοβολήθηκε με 2,700 J /m

2 UVC (254 nm) στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με FGS-UVC. Η μέση υπολειπόμενη περιοχή του όγκου μετά FGS (n = 16) ήταν σημαντικά μικρότερη από ό, τι μετά την BLS μόνο (n = 24) (0,135 ± 0,137 χιλιοστά

2 και 3.338 ± 2,929 χιλιοστά

2, αντίστοιχα?

p

= 0,007). Η BLS ποντίκια που έλαβαν αγωγή είχε μειώσει σημαντικά την επιβίωση σε σύγκριση με FGS- και FGS-UVC που έλαβαν ποντίκια για τόσο ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (RFS) (

σ

& lt? 0.001 και

σ

& lt? 0.001 , αντίστοιχα) και τη συνολική επιβίωση (OS) (

σ

& lt? 0.001 και

σ

& lt? 0.001, αντίστοιχα). FGS-UVC που έλαβαν τα ποντίκια είχαν αυξηθεί RFS και OS σε σύγκριση με το FGS μόνο ποντίκια που έλαβαν αγωγή (

σ

= 0.008 και

σ

= 0,025, αντίστοιχα)? με RFS διαρκείας θεραπεύτηκαν τουλάχιστον 150 ημέρες αναφέροντας τα ζώα. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης δείχνουν ότι UVC ακτινοβολία σε συνδυασμό με FGS έχει κλινική δυνατότητα να αυξήσει την επιβίωση

Παράθεση:. Χιροσίμα Υ, Maawy Α, Zhang Υ, Sato S, Murakami Τ, Yamamoto Μ, et al. (2014) με φθορίζουσα καθοδήγηση Χειρουργική σε Συνδυασμό με UVC ακτινοβολία θεραπείες Μεταστατικό Ανθρωπίνων καρκίνο του παγκρέατος σε μοντέλα ορθοτοπική ποντίκι. PLoS ONE 9 (6): e99977. doi: 10.1371 /journal.pone.0099977

Επιμέλεια: Juri Γ Gelovani, Πολιτειακό Πανεπιστήμιο Wayne, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 16 Γενάρη του 2014? Αποδεκτές: 20 Μαΐου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιουνίου 2014

Copyright: © 2014 Χιροσίμα et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε εν μέρει από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου CA επιχορήγηση CA132971 και CA142669, και επιχορηγήσεις-in-Aid από το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας Βασικής Έρευνας (C) (# 23592018 Ιάπωνες σε IE και # 24592009 να KT ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τα εξής ενδιαφέροντα: Yukihiko Χιροσίμα, Yong Zhang, Mako Yamamoto, Fuminari Uehara, Shinji Miwa, και Shuya Yano είναι θυγατρικές των αντικαρκινικών Inc. Masashi Momiyama και Takashi Chishima ήταν πρώην συνεργάτες των αντικαρκινικών Inc. Robert M. Hoffman είναι ένας μη μισθωτών θυγατρική αντικαρκινικών Inc. AntiCancer Inc. εμπορεύεται ζωικά μοντέλα καρκίνου. Δεν υπάρχουν άλλα ανταγωνιστικά συμφέροντα. Δεν υπάρχουν διπλώματα ευρεσιτεχνίας, τα προϊόντα στην ανάπτυξη, ή διατίθενται στην αγορά προϊόντα να δηλώσει. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών, όπως περιγράφεται λεπτομερώς σε απευθείας σύνδεση στον οδηγό για τους συγγραφείς.

Εισαγωγή

Η πλήρης εκτομή του όγκου μπορεί να βελτιώσει τη συνολική επιβίωση ασθενείς με καρκίνο του παγκρέατος [1], η οποία είναι προς το παρόν 5% σε πέντε χρόνια. Μεταστατικό υποτροπή συχνά λαμβάνει χώρα μετά από απόπειρα θεραπευτική εκτομή του πρωτογενούς όγκου, επειδή όλα τα καρκινικά κύτταρα δεν απομακρύνονται από τον χειρουργό, λόγω της αδυναμίας να τους δει. Κάνοντας όγκους φθορίζουν προσφέρει μεγάλα πλεονεκτήματα για την ανίχνευση του όγκου κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης για να επιτευχθεί πλήρης εκτομή [2]. Έχουμε στο παρελθόν έδειξαν ότι η φθορίζουσα καθοδήγηση χειρουργική επέμβαση (FGS) για τον καρκίνο του παγκρέατος μειωθεί το υπολειπόμενο φορτίο του όγκου και βελτίωσε τη συνολική και την ελεύθερη νόσου επιβίωση σε μοντέλα ποντικών [3] – [5]. Ωστόσο, είναι δύσκολο να αφαιρεθούν όλα μικροσκοπική νόσο ακόμη και με FGS [5].

Η υπεριώδης (UV) ακτινοβολία φωτός έχει δείξει αποτελεσματικότητα σε διάφορα μοντέλα ποντικού στο εργαστήριο μας in vitro και in vivo σε καρκινικά κύτταρα που εκφράζουν φθορίζουσες πρωτεΐνες [6] – [10]. Αναφέραμε προηγουμένως το θάνατο των καρκινικών κυττάρων υν-επαγόμενης βρέθηκε να είναι μήκους κύματος και δοσοεξαρτώμενη, καθώς και κυτταρική γραμμή που εξαρτάται, με UVC είναι πιο αποτελεσματικές [9]. In vitro, τόσο λίγο όσο 25 J /m

2 UVC ακτινοβολία θανατώνονται περίπου το 70% των κυττάρων ανθρώπινου οστεοσαρκώματος 143Β που εκφράζουν πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) και κόκκινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (RFP). Κυτταρικό θάνατο άρχισε περίπου 4 ώρες μετά την ακτινοβόληση και συνεχίστηκε μέχρι 10 ώρες μετά την ακτινοβόληση. έκθεση UVC κατέστειλε επίσης την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων σε γυμνά ποντίκια σε ένα μοντέλο ελάχιστης υπολειμματικής καρκίνου (MRC) [7], [9]. Δείξαμε επίσης ότι καρκίνωμα ποντικού Lewis πνεύμονα (LLC) και ανθρώπινα κύτταρα U87 γλοιώματος, εκφράζουν GFP στον πυρήνα και RFP στο κυτταρόπλασμα, ήταν πιο ευαίσθητα στο UVC φως από μη χρωματισμένο LLC και U87 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι η έκφραση του φθορίζουσες πρωτεΐνες σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να ενισχύσει την φωτοδυναμική επίδραση του UVC σε καρκινικά κύτταρα.

στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι UVC ακτινοβολία που χρησιμοποιείται για irradicate MRC μετά FGS είναι πιο αποτελεσματική για την ανθρώπινη καρκίνο του παγκρέατος σε ορθοτοπική μοντέλα ποντικού από FGS μόνος , και οδηγεί σε προφανή θεραπείες.

Υλικά και Μέθοδοι

Ίδρυση της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης γραμμή με ετικέτα Cancer Cell

Για την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) μεταγωγή των καρκινικών κυττάρων, 70% συρρέοντα MiaPaCa-2 ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα [11], [12] χρησιμοποιήθηκαν. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν με ένα καταβυθισμένο μίγμα 1:01 των ρετροϊικών υπερκειμένων των κυττάρων ΡΤ67-GFP που εκφράζουν το γονίδιο GFP που συνδέεται με το γονίδιο αντοχής G418 και RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) που περιείχε βόεια εμβρυϊκό 10% ορού (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT) για 72 ώρες. Φρέσκο ​​μέσο αναπληρώθηκε αυτή τη στιγμή. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν με τρυψίνη /ΕϋΤΑ 72 ώρες μετά την μεταγωγή και υποκαλλιεργήθηκαν με αναλογία 1:15 σε μέσο, ​​το οποίο περιείχε 200 μg /ml του επιλεκτικού G418 παράγοντα. Το επίπεδο της G418 αυξήθηκε σταδιακά μέχρι 800 μg /ml [11], [13] – [15].

Cell Culture

MiaPaCa-2-GFP και BxPC-3 [16 ] ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα 5% CO

2 στον αέρα. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά θρυψινοποίηση και χρωματίζονται με κυανούν τρυπανίου (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ). Μόνο βιώσιμα κύτταρα τα οποία εξαιρούνται trypan μπλε μετρήθηκαν με ένα αιμοκυτταρόμετρο (Häusser Επιστημονική, Horsham, ΡΑ).

Ζώα

αθυμικά

nu /nu

γυμνά ποντίκια (AntiCancer Inc. , San Diego, CA), ηλικίας 4-6 εβδομάδων, χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. Οι ποντικοί κρατήθηκαν σε μία εγκατάσταση φράγματος υπό διήθηση HEPA. Οι ποντικοί τράφηκαν με δίαιτα ΚΥΨΕΛΩΤΟ εργαστήριο τρωκτικών. Όλες οι χειρουργικές διαδικασίες και απεικόνισης ποντικού διεξήχθησαν με τα ζώα αναισθητοποιούνται με ενδομυϊκή ένεση ενός 0,02 ml διαλύματος 50% κεταμίνης, ξυλαζίνης 38%, και 12% ακεπρομαζίνης μηλεϊνικό. Όλες οι μελέτες σε ζώα έχουν διεξαχθεί με ένα Φροντίδα Ζώων και Χρήση Επιτροπή AntiCancer Θεσμικών (IACUC) -Πρωτόκολλο ειδικά εγκεκριμένο για αυτή τη μελέτη και σύμφωνα με τις αρχές και τις διαδικασίες που περιγράφονται στο Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας Οδηγός για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων με αριθμό Διασφάλισης A3873-1.

υποδόριου όγκου κυττάρων Εμφύτευση

MiaPaCa-2-GFP κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και πλύθηκαν δύο φορές με μέσο χωρίς ορό. Τα κύτταρα (2 χ 10

6 σε 100 μι άνευ ορού μέσο) ενέθηκαν υποδορίως μέσα σε 30 λεπτά από τη συγκομιδή, πάνω από το δεξί και το αριστερό λαγόνες σε αρσενικούς γυμνούς ποντικούς. Υποδόρια όγκοι αφέθηκαν να αναπτυχθούν επί 2-4 εβδομάδες μέχρις ότου αρκετά μεγάλη ώστε να παρέχει επαρκή όγκο για τη συγκομιδή για τις επόμενες ορθοτοπική εμφύτευση.

ορθοτοπική Tumor Εμφύτευση

Ένα μικρό 6 έως 10 mm εγκάρσια τομή έγινε στο αριστερό πλευρό του ποντικού μέσω του δέρματος και του περιτοναίου του. Η ουρά του παγκρέατος εκτέθηκε μέσω αυτής της τομής, και ένα ενιαίο τεμάχιο όγκου (3-mm

3) από υποδόριους όγκους ράφτηκε στην ουρά του παγκρέατος χρησιμοποιώντας 8-0 νάιλον χειρουργικών ραμμάτων (Ethilon? Ethicon Inc., NJ, USA). Με την ολοκλήρωση, η ουρά του παγκρέατος επεστράφη στην κοιλιά, και η τομή έκλεισε σε μία στρώση χρησιμοποιώντας 6-0 νάιλον χειρουργικών ραμμάτων (Ethilon) [17] – [19].

φθορισμού Imaging

η OV100 System της Olympus Μικρών ζώων Imaging (Olympus Corp.), που περιέχει μια πηγή φωτός MT-20 (Όλυμπος Biosystems, Planegg, Γερμανία) και DP70 CCD κάμερα (Olympus Corp., Τόκιο, Ιαπωνία) [20] και η σύστημα Dino-Lite απεικόνισης (AM4113T-GFBW Dino-Lite Premier? Anmo Electronics Corporation, Ταϊβάν) [21] και η μεγάλη εργατική απόσταση μικροσκόπιο MVX10 (Olympus Corp.) [22], χρησιμοποιήθηκαν για την απεικόνιση ζωντανών ποντικιών. Όλες οι εικόνες αναλύθηκαν με ImageJ v1.440 (National Institutes of Health).

όγκων εκτομή και UVC ακτινοβολία

Δύο εβδομάδες μετά την ορθοτοπική εμφύτευση MiaPaCa-2-GFP καρκίνο του παγκρέατος, φωτεινό φως χειρουργική επέμβαση (BLS) πραγματοποιήθηκε σε όλα τα ποντίκια που φέρουν όγκο (n = 24). Το εκτεθειμένο παγκρέατος όγκος απεικονίζεται προεγχειρητικά με το OV100 σε μεγέθυνση 0.14x. Εκτομή του πρωτογενούς παγκρεατικού όγκου διεξήχθη υπό πρότυπες φωτεινού πεδίου με τη χρήση του μικροσκοπίου MVX10. Μετεγχειρητικά, η χειρουργική εκτομή κρεβάτι απεικονίστηκε με τον OV100 σε μεγέθυνση 0.56x για την ανίχνευση υπολειμματικού όγκου. Τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε BLS τυχαιοποιήθηκαν σε 3 ομάδες αγωγής: BLS-μόνο (n = 8), FGS (n = 8), ή FGS-UVC (n = 8) (Εικ. 1). Οι υπολειμματικές όγκοι των ομάδων FGS ή FGS-UVC των ποντικών αποκόπηκαν με τη χρήση του συστήματος απεικόνισης Dino-Lite υπό πλοήγησης φθορισμού. Μετά την ολοκλήρωση της FGS, η χειρουργική εκτομή κρεβάτι απεικονίστηκε με την OV100 σε μεγέθυνση 0.89x για την ανίχνευση μικροσκοπικών ελάχιστης υπολειμματικής καρκίνου (MRC) [23]. Η χειρουργική εκτομή κλίνη της ομάδας FGS-UVC ποντικών ακτινοβολήθηκε με 2,700 J /m

2 UVC (κορυφή εκπομπής 254 nm) από τον πυθμένα του θαλάμου χρησιμοποιώντας ένα transilluminator Benchtop 3UV (UVP, LLC, Upland, CA) . Η τομή κλείστηκε σε μία στρώση χρησιμοποιώντας 6-0 νάιλον χειρουργικά ράμματα. Μετά τη θεραπεία, οι ποντικοί αφέθηκαν να ανανήψουν στα κλουβιά τους.

Δύο εβδομάδες μετά ορθοτοπική εμφύτευση MiaPaCa-2-GFP καρκίνο του παγκρέατος, φωτεινό φως χειρουργική (BLS) διεξήχθη σε όλους τους ποντικούς που φέρουν όγκο (n = 24). Μετεγχειρητικά, η χειρουργική εκτομή κρεβάτι απεικονίστηκε με τον OV100 σε μεγέθυνση 0.56x για την ανίχνευση υπολειμματικού όγκου. Τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε BLS τυχαιοποιήθηκαν σε 3 ομάδες αγωγής: BLS-μόνο (n = 8), FGS (n = 8), ή FGS-UVC (n = 8). Υπολειμματική όγκων σε ποντίκια στις ομάδες FGS και FGS-UVC αποκόπηκαν με τη χρήση του συστήματος απεικόνισης Dino-Lite υπό πλοήγηση φθορισμού. Μετά την ολοκλήρωση της FGS, η χειρουργική εκτομή κρεβάτι απεικονίστηκε με την OV100 σε μεγέθυνση 0.89x για την ανίχνευση micoscopic ελάχιστης υπολειμματικής καρκίνου (MRC). Η χειρουργική εκτομή κρεβάτι στο ποντίκια στην ομάδα FGS-UVC ακτινοβολήθηκε με 2,700 J /m

2 UVC (κορυφή εκπομπής, 254 nm) από τον πυθμένα του θαλάμου χρησιμοποιώντας ένα transilluminator Benchtop 3UV (UVP, LLC, Upland, CA).

η

μη επεμβατικής απεικόνισης του όγκου υποτροπής και εξέλιξη

για να εκτιμηθεί για υποτροπή και να ακολουθούν την εξέλιξη του όγκου μετεγχειρητικά, εβδομαδιαία μη επεμβατική απεικόνιση ολόκληρου του σώματος των ποντικών διεξήχθη με το OV100 σε μεγέθυνση 0.14x, μέχρι το τέλος του πειράματος.

Μονοκλωνικό αντίσωμα

τα μονοκλωνικά αντισώματα ειδικά για καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο (CEA) αγοράστηκαν από RayBiotech, Inc. (Norcross, GA ). Τα αντισώματα συζευγμένα με την Dylite 488 Kit Protein Labeling (Molecular Probes Inc., Eugene, OR) σύμφωνα με τους κατασκευαστές.

Ευαισθησία του μη χρωματισμένο ή φθορίζον Cancer παγκρεατικά κύτταρα να UVC ακτινοβολία in vitro

για να συγκριθεί η αποτελεσματικότητα του UVC ακτινοβολία σε μη χρωματισμένα BxPC-3 ή φθορίζοντα παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, BxPC-3 κύτταρα σημάνθηκαν με αντι αντίσωμα CEA συζευγμένο με Dylite 488 (BxPC-3-Ab488) ή GFP (BxPC-3 ΟΡΡ). BxPC-3-GFP ή BxPC-3-Ab488 ή μη χρωματισμένα κύτταρα BxPC-3 (10

3) απλώθηκαν σε 100 μΐ μέσου κυτταρικής καλλιέργειας ανά φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Τα κύτταρα ακτινοβολούνται με UVC σε διάφορες δόσεις (0, 25, 50 και 100 J /m

2) από ένα Σταθερά 3UV transilluminator (UVP, LLC, ορεινές, CA). Είκοσι ώρες μετά την ακτινοβόληση UVC, τα κύτταρα πλύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού (PBS) τρεις φορές. Ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με μικροσκόπιο φθορισμού IX71 (Όλυμπος, Tokyo, Japan).

Στατιστική Ανάλυση

PASWStatistics 18.0 (SPSS, Inc) χρησιμοποιήθηκε για στατιστικές αναλύσεις. Υπολειμματική περιοχή του όγκου εκφράζεται ως μέση τιμή ± SD. Οι δύο ουρά του Student

t-test

χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση συνεχείς μεταβλητές μεταξύ των 2 ομάδων. καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκαν για την εκτίμηση της επιβίωσης. εκβάσεις επιβίωσης συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας τεστ log rank. Ένα

σ

αξία & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική για όλες τις συγκρίσεις

Αποτελέσματα

FGS μειώνει σημαντικά Tumor Ένταση αλλά δεν Εξάλειψη όλων των υπολειπόμενων καρκινικά κύτταρα

BLS πραγματοποιήθηκε σε όλους τους ποντικούς που φέρουν όγκο (n = 24). Το εκτεθειμένο παγκρεατικού όγκου απεικονίστηκε προεγχειρητικά με το OV100 σε μεγέθυνση 0.14x (Εικ. 2Α). Μετεγχειρητικά, το χειρουργικό κρεβάτι εκτομή απεικονίστηκε με την OV100 σε μεγέθυνση 0.56x (Εικ. 2Β) για την ανίχνευση unresected όγκου. Τα ποντίκια που υποβλήθηκαν σε BLS τυχαιοποιήθηκαν σε 3 ομάδες θεραπείας? BLS-μόνο (n = 8), FGS (n = 8), ή FGS-UVC (n = 8) (Σχ. 1).

Άνω πάνελ είναι φωτεινού πεδίου (BF), και κάτω πάνελ δείχνουν φθορισμού όγκου. Η υπολειμματική όγκου μετά BLS ήταν σαφώς ανιχνεύθηκε τόσο με την OV100 σε μεγέθυνση 0.56x (Β) και το Dino-Lite σε μεγέθυνση 30x (Ε). Η υπολειμματική όγκου μετά FGS ήταν οριακά ανιχνεύθηκε είτε με το OV100 σε μεγέθυνση 0.56x (C) ή τον Dino-Lite σε μεγέθυνση 30x (F). Η OV100 σε μεγέθυνση 0.89x εντοπιστεί σαφώς την ελάχιστη εναπομένουσα όγκου μετά FGS (D). (Ζ) Η εναπομένουσα περιοχή του όγκου μετά FGS ήταν σημαντικά μικρότερη από ό, τι μετά την BLS. Όλες οι εικόνες μετρήθηκαν για υπολειμματική περιοχές όγκου χρησιμοποιώντας ImageJ. **

σ

& lt?. 0.01

Η

Απεικόνιση διεξήχθη σε όλα τα 24 ζώα μετά BLS και πριν από οποιαδήποτε άλλη θεραπεία. Η μέση υπολειπόμενη περιοχή του όγκου της κάθε ομάδας ήταν 3,46 ± 3,45 χιλιοστών

2 (BLS), 3,26 ± 2,69 χιλιοστών

2 (FGS) ή 3,30 ± 2,99 χιλιοστών

2 (FGS-UVC). Η έκταση της υπολειπόμενης νόσου ήταν στατιστικά ισοδύναμη.

Για FGS, ο Dino-Lite χειρός φορητό σύστημα απεικόνισης χρησιμοποιήθηκε (Βίντεο S1). Μετά την ολοκλήρωση της FGS, η χειρουργική εκτομή κρεβάτι απεικονίστηκε με την OV100 σε μεγέθυνση 0.89x (Σχ. 2D) για την ανίχνευση μικροσκοπικών MRC. MRC μετά BLS-μόνο ήταν σαφώς ανιχνεύθηκε τόσο με το OV100 σε μεγέθυνση 0.56x (Εικ. 2Β) και ο Dino-Lite σε μεγέθυνση 30x (Σχ. 2Ε). MRC μετά FGS οριακά ανιχνεύθηκε είτε με το OV100 σε μεγέθυνση 0.56x (Σχ. 2C) ή το Dino-Lite σε μεγέθυνση 30x (Σχ. 2F). Η OV100 σε υψηλή μεγέθυνση (0.89x) μπορεί εύκολα να ανιχνεύσει μικροσκοπικά MRC μετά FGS (Σχ. 2D). Η μέση υπολειπόμενη περιοχή του όγκου μετά FGS (n = 16) ήταν σημαντικά μικρότερο από το BLS-μόνο (n = 24) (0,135 ± 0,137 χιλιοστά

2 και 3.338 ± 2,929 χιλιοστά

2, αντίστοιχα?

p

= 0,007). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι FGS μείωσε σημαντικά τον υπολειμματικό όγκο του όγκου μετά BLS-μόνο, αλλά μικροσκοπικές MRC παρέμεινε στο χειρουργικό κρεβάτι, ακόμη και μετά FGS.

UVC ακτινοβόλησης σε συνδυασμό με FGS Θεραπείες Μεταστατικό Ανθρώπινο Καρκίνο του παγκρέατος

Περιοδική όγκοι ανιχνεύθηκαν με μη επεμβατική απεικόνιση ολόκληρου του σώματος κατά τις εβδομάδες 3 έως 11 στους ποντικούς BLS-μόνο θεραπεία και κατά τις εβδομάδες 11 έως 20 στους ποντικούς FGS-μόνο αγωγή (Σχ. 3Α και 4). Υποτροπή ανιχνεύθηκε στα 8 ποντίκια (100%) στην BLS-μόνο ομάδα και 5 ποντίκια (62,5%) στην ομάδα FGS (Εικ. 4). Όλες οι υποτροπιάζοντες όγκοι προχώρησαν ταχέως και μεταστάσεις σε περιφερειακό και μακρινή και σκότωσε τον ποντικούς μεταξύ των ημερών 30 σε 156 κατά τους ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με BLS-μόνο και μεταξύ των ημερών 134 195 το ποντικούς που έλαβαν θεραπεία με FGS (Σχ. 3Β-3F και 4Β). Αντίθετα, δεν θα επαναληφθούν ή θάνατος ανιχνεύθηκαν σε οποιαδήποτε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με FGS-UVC (Σχ. 3G-3J και 4Β), υποδεικνύοντας ότι UVC ακτινοβολία εξαλειφθεί μικροσκοπική MRC μετά FGS.

Η επανάληψη ανιχνεύθηκε αρχικά από μη -invasive απεικόνισης ολόκληρου του σώματος χρησιμοποιώντας το OV100 σε μεγέθυνση 0.14x την εβδομάδα 11 μετά FGS (Α? λευκό βέλος). Η περιοδική όγκος προχώρησε ταχύτατα (Β-D) και θανατώνονται τα ποντίκια με εβδομάδα 22 μετά FGS (D). Αριστερά μασχαλιαίους μετάσταση λεμφαδένων (Ε? Λευκό βέλος), μεγάλες τοπικές υποτροπιάζοντα όγκο και πολλά διάδοση οζίδια όγκου (F) ανιχνεύθηκαν στα ποντίκια κατά τη στιγμή του θανάτου. Αντίθετα, δεν θα επαναληφθούν ανιχνεύθηκε στην ομάδα που FGS-UVC (G-J). Ράβδοι κλίμακας:. 10 χιλιοστά

Η

Η επιβίωση των επιπτώσεων της UVC ακτινοβόλησης σε συνδυασμό με FGS

ελεύθερη υποτροπής επιβίωση (RFS) και τη συνολική επιβίωση (OS) εκτιμήθηκαν με την 3 πειραματικές ομάδες ποντικών. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 4Α και 4Β, 3-μηνών RFS σε ποντικούς μετά BLS-μόνο, FGS και FGS-UVC ήταν 0%, 50% και 100%, αντίστοιχα? και 5-μηνών OS ήταν 10%, 90% και 100%, αντίστοιχα. Μέσος RFS σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με BLS-μόνο, FGS και FGS-UVC ήταν 28 ημέρες, 103 ημέρες και 138 ημέρες, αντίστοιχα, και η διάμεση OS ήταν 57,5 ​​ημέρες, 188,5 ημέρες, και 195 ημέρες, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με BLS-μόνο έδειξε σημαντικά μειωμένη επιβίωση σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με FGS και FGS-UVC τόσο για την RFS (

σ

& lt? 0.001 και

σ

& lt? 0.001, αντίστοιχα) και OS (

σ

& lt? 0.001 και

σ

& lt? 0.001, αντίστοιχα). FGS-UVC αγωγή ποντικοί έδειξαν σημαντικά μεγαλύτερη επιβίωση σε σύγκριση με τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με FGS τόσο για RFS και OS (

σ

= 0.008 και

σ

= 0.025, αντίστοιχα) (Σχ. 4 και στον Πίνακα 1 ), γεγονός που υποδηλώνει ότι UVC ακτινοβολία σε συνδυασμό με FGS εξαλειφθεί μικροσκοπική MRC.

η

η αποτελεσματικότητα του UVC ακτινοβολία για τον καρκίνο του παγκρέατος κύτταρα επισημαίνονται με αντι-ΟΕΑ αντίσωμα συζευγμένο με Dylite 488

in vitro

ή GFP σύγκριση με Unlabeled κύτταρα

Η αποτελεσματικότητα του UVC ακτινοβολία για BxPC-3 παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σημασμένα με αντίσωμα αντι-CEA συζευγμένο με Dylite 488 (BxPC-3-Ab488), BxPC-3-GFP και μη επισημασμένη BxPC-3 συγκρίθηκε (εικ. 5Α). UVC ακτινοβολήθηκε σε διάφορες δόσεις (0, 25, 50 και 100 J /m

2). Σε σύγκριση με μη-χρωματισμένα κύτταρα BxPC-3, ο αριθμός των BxPC-3-Ab488 και BxPC-3-GFP κυττάρων μειώθηκε σημαντικά λόγω UVC ακτινοβολία με 25 J /m

2 (ρ = 0,016 και ρ = 0,01, αντίστοιχα ) και 50 J /m

2 (p = 0,001 και p & gt? 0.001, αντίστοιχα). BxPC-3-Ab488 και τα κύτταρα BxPC-3-GFP ήταν εξίσου πιο ευαίσθητα στο UVC φως από μη χρωματισμένα κύτταρα BxPC-3.

(Α) Εκπρόσωπος εικόνες της μη-χρώματος BxPC-3, BxPC-3 -Ab488 και BxPC-3-GFP in vitro. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με τη FV1000 ομοεστιακό μικροσκόπιο (Olympus, Tokyo, Japan). Ράβδοι κλίμακας: 50 μm. (Β) UVC ακτινοβολήθηκε σε διάφορες δόσεις (0, 25, 50 και 100 J /m

2). Σε σύγκριση με μη-χρωματισμένα κύτταρα BxPC-3, ο αριθμός των BxPC-3-Ab488 και τα κύτταρα BxPC-3-GFP μειωθεί σημαντικά λόγω UVC ακτινοβολία με 25 και 50 J /m

2. Τα πειραματικά δεδομένα εκφράζονται ως ο μέσος ± SD. * P & lt? 0,05, ** p & lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Η χειρουργική μοντέλο ποντικού ορθοτοπική εμφύτευση (SOI) που χρησιμοποιείται στην παρούσα μελέτη έχει άμεση σχέση με την κλινική έκβαση της δωρητές του ασθενούς σε προηγούμενη μελέτη μας. Φρέσκα χειρουργικά δείγματα που προέρχονται από ασθενείς με προχωρημένο καρκίνο του στομάχου ήταν μεταμοσχεύεται ορθοτοπικά σε γυμνούς ποντικούς χρησιμοποιώντας SOI. Υπήρχαν στατιστικώς-σημαντικές συσχετίσεις (ρ & lt? 0,01). και για τις δύο ηπατικές μεταστάσεις και περιτοναϊκή εμπλοκή μεταξύ των ασθενών και ποντικούς [24]

Σε μια άλλη προηγούμενη μελέτη μας, δείγματα του παγκρέατος καρκίνου μεταμοσχεύθηκαν στο γυμνό-ποντικού πάγκρεας χρησιμοποιώντας SOI [25]. Τα προκύπτοντα υποδείγματα αντιπροσωπεύονται κλινική του καρκίνου του παγκρέατος, συμπεριλαμβανομένων: επέκταση του τοπικά αυξανόμενης ανθρώπινου παγκρεατικού καρκίνου του στομάχου και του δωδεκαδακτύλου nude-ποντίκι? μεταστάσεις στο ήπαρ και τοπικούς λεμφαδένες? και απομακρυσμένων μεταστάσεων με τα επινεφρίδια, το διάφραγμα, και του μεσοθωρακίου λεμφαδένες. Τα μεταμοσχευμένα ανθρώπινα παγκρεατικά καρκινώματα έδειξε ένα παρόμοιο μοτίβο έκφρασης της ανθρώπινης σχετίζονται με όγκους γλυκοπρωτεΐνη 72 και καρκινοεμβρυονικό αντιγόνο.

Έχουμε προηγουμένως δείξει ότι SOI του άθικτου ιστού ανθρώπινου καρκίνου του στομάχου οδήγησε στο σχηματισμό των μεταστάσεων στο 100% των τα ποντίκια με εκτεταμένη πρωτογενή ανάπτυξη στην περιφερειακή λεμφαδένες, το ήπαρ, και τον πνεύμονα. Σε αντίθεση, ορθοτοπική εμφύτευση κυτταρικών εναιωρημάτων του ίδιου ανθρώπινου καρκίνου του στομάχου στην ίδια θέση, μεταστάσεις εμφανίστηκαν σε μόνο 6,7% των ποντικών με το σχηματισμό τοπικών όγκων. Τα αποτελέσματα αυτά υπογραμμίζουν τη σημασία της χρήσης SOI να επιτρέψει την πλήρη έκφραση του μεταστατικού δυναμικού [26].

Επίσης, στο παρελθόν έναντι της μεταστατικής ποσοστό SN12C ανθρώπινο νεφρικό καρκίνωμα κυττάρων όταν μεταμοσχεύονται από SOI ή ορθοτοπική εμφύτευση των κυττάρων αναστολών κατά το νεφρό. Μεταστατικό ποσοστά στις εμπλεκόμενες όργανα (πνεύμονας, το ήπαρ, και μεσοπνευμόνια γάγγλια) ήταν 2-3 φορές υψηλότερες με SOI σε σύγκριση με την κυτταρική ορθοτοπική εμφύτευση. Ο μέσος χρόνος επιβίωσης σε μοντέλο SOI ήταν 40 ημέρες, η οποία ήταν σημαντικά μικρότερη από εκείνη των κυτταρικών ορθοτοπική εμφύτευση (68 ημέρες) [27].

Σε μία άλλη από τις προηγούμενες μελέτες μας, σε σύγκριση με την κυτταρική SOI ορθοτοπική μεταμόσχευση καρκίνο της ουροδόχου κύστης. Μετά SOI του όγκου κύστης RT-10, μεταστάσεις συνέβη στο περιφερειακό και μακρινό λεμφαδένων, του ήπατος, του παγκρέατος, της σπλήνας, και στον ιστό δίπλα στο επινεφρίδια και του ουρητήρα, καθώς και στους πνεύμονες. Όταν αναλυτικά RT-10 κύτταρα εγχέονται transurethrally, υπάρχουν μεταστάσεις που σχηματίζονται [28], [29].

Όσον αφορά την πιστότητα της ανταπόκρισης των ναρκωτικών, σε μια άλλη προηγούμενη μελέτη μας, σισπλατίνη (CDDP) είχαν σημαντική αποτελεσματικότητα σε καρκίνο του πνεύμονα μικρών κυττάρων (SCLC) αυξάνεται ορθοτοπικά στον πνεύμονα και μιτομυκίνη C (MMC) δεν το έκαναν, το οποίο αντανακλούσε την κλινική κατάσταση. Σε αντίθεση, όταν ο SCLC μεγάλωνε υποδορίως, οι όγκοι ανταποκρίθηκαν στο MMC και όχι σε CDDP. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι όγκοι αυξάνονται ορθοτοπικά αντανακλούν τις κλινικές επιδράσεις των φαρμάκων στην ανθρώπινη SCLC πιο στενά από τους όγκους που μεγαλώνει υποδόρια [30]. Ως εκ τούτου, το μοντέλο SOI, δεν θα πρέπει να επηρεάζει την ευαισθησία UV των παγκρεατικών κυττάρων, όπως αυτές που αναπτύσσονται σε φυσικές ορθοτοπική τους οργάνων.

Ένα σημαντικό πρόβλημα στην χειρουργική ογκολογία είναι MRC, μετά την αρχική θεραπευτική εκτομή του όγκου [23]. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως την ενισχυμένη απεικόνιση και εκτομή του πρωτογενούς και του μεταστατικού καρκίνου από FGS με τη χρήση τελομεράσης που εξαρτώνται από αδενοϊό (OBP-401) που εκφράζει το

GFP

γονίδιο μόνο σε καρκινικά κύτταρα τα οποία εκφράζουν το ένζυμο τελομεράση [ ,,,0],31] – [33]

FGS μελέτες έχουν επίσης προηγουμένως διεξαχθεί στο εργαστήριο μας με επισήμανση των όγκων με φθορίζοντα αντισώματα όγκου-ειδικά που έχουν άμεση κλινική εφαρμοσιμότητα [3] -. [5], [34] – [36]

Α φθορισμοφόρο-συζευγμένο αντίσωμα για το CEA χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση της FGS παγκρεατικών όγκων σε μοντέλα ποντικών SOI της ανθρώπινης παγκρεατικού καρκίνου BxPC-3.. Μετά από ενδοφλέβια ένεση του αντι-ΟΕΑ-Alexa Fluor 488, πλήρης εκτομή επιτεύχθηκε στο 92% των ποντικών στην ομάδα FGS σε σύγκριση με 45,5% στην ομάδα BLS. ποσοστά Cure με FGS σύγκριση με BLS βελτιώθηκε από 4,5% έως 40%, αντίστοιχα, και 1 έτους μετεγχειρητική ποσοστά επιβίωσης αυξήθηκε από 0% με BLS στο 28% με FGS. Διάμεση DFS αυξήθηκε από 5 εβδομάδες με BLS σε 11 εβδομάδες με FGS. Διάμεση OS αυξήθηκε από 13,5 εβδομάδες με BLS έως 22 εβδομάδες με FGS [37].

Τα αποτελέσματα αυτών των προηγούμενων μελετών δείχνουν τις μεγάλες δυνατότητες της FGS. Ωστόσο, τα τεχνικά προβλήματα παραμένουν για να αφαιρέσετε MRC μετά FGS. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η MRC παρέμεινε στο χειρουργικό κρεβάτι, ακόμη και μετά FGS (Σχ. 2D), το οποίο εξελίχθηκε ταχέως και θα μπορούσε να σκοτώσει τα ζώα (Σχ. 3Β-3F). Ωστόσο, η ακτινοβολία UVC, σε συνδυασμό με το FGS προληφθούν πλήρως υποτροπής (Σχ. 3G-3J και 4Β) και έδειξαν σημαντικά αυξημένη επιβίωση σε σύγκριση με το FGS μόνη της τόσο για την RFS και OS (

σ

= 0.008 και

p

= 0,025, αντίστοιχα) (Σχ. 4 και πίνακα 1). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η UVC ακτινοβολία θα μπορούσε να εξαλειφθεί μικροσκοπική MRC που απομένει μετά FGS.

Έχουμε δείξει στο παρελθόν ότι UVC ακτινοβολία είναι σε θέση να διεισδύσει μέχρι και 40 μm σε τρισδιάστατο ιστοκαλλιέργεια χρησιμοποιώντας Gelfoam και ένα

ex vivo

μοντέλο όγκου, καθώς επίσης και να σκοτώσουν τα καρκινικά κύτταρα επιπολής μέχρι βάθος 40 μm

in vivo

χωρίς βλάβη του βαθείς ιστούς [7]. Στην παρούσα μελέτη, MRC οπτικοποιήθηκε, αλλά μόνο κάτω από υψηλή μεγέθυνση, αφού FGS (Σχ. 2D). UVC ήταν σε θέση να εξαλείψουν το MRC χωρίς εμφανείς παρενέργειες και να εξαλειφθούν υποτροπής (Σχ. 3G-3J και 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι ένα βάθος 40 μm είναι επαρκούς βάθους για την εξάλειψη της μικροσκοπικής MRC μετά FGS. Έτσι UVC ακτινοβολία μπορεί να αποστειρωθεί το χειρουργική εκτομή κλίνη των καρκινικών κυττάρων μετά FGS.

Επιπλέον, έχουμε αποδείξει σε αυτή τη μελέτη ότι τα κύτταρα BxPC-3-Ab488 ήταν πιο ευαίσθητα στο φως UVC από μη χρωματισμένο BxPC-3 κύτταρα και ισοδύναμες σε ευαισθησία σε BxPC-3-GFP κύτταρα (Σχ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η UVC ακτινοβολία θα μπορούσε να εξαλειφθεί μικροσκοπική MRC, επισημαίνονται με μια εξωγενή φθοροφόρου, αφού FGS και ότι η τεχνολογία που περιγράφεται στην παρούσα έκθεση εφαρμόζεται στην κλινική πράξη.

Υποστήριξη Πληροφορίες

βίντεο S1.

εκτομή του υπολειπόμενου όγκου μετά BLS υπό φθορισμού navigation.

doi:10.1371/journal.pone.0099977.s001

(MP4)

Acknowledgments

Dedication: Η εργασία αυτή είναι αφιερωμένη στη μνήμη του Α R. Moossa, M.D.