Αφηρημένο

Ιστορικό

ανάπτυξη θεραπευτικό αντίσωμα είναι ένας από τους ταχύτερα αναπτυσσόμενους τομείς της φαρμακευτικής βιομηχανίας. Παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων υψηλής ποιότητας έναντι δεδομένης θεραπευτικός στόχος είναι ζωτικής σημασίας για την επιτυχή ανάπτυξη φαρμάκων. Ωστόσο, λόγω της ανοσολογικής ανοχής, γεγονός που καθιστά δύσκολο να δημιουργηθούν αντισώματα χρησιμοποιώντας συμβατικές προσεγγίσεις.

Μεθοδολογία /Εκτίμηση

Mixed τέσσερα ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου (GC) κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν ως το ανοσογόνο σε Α /J ποντίκια? δεκαέξι ιδιαίτερα αποικίες θετικές υβριδώματος επιλέχθηκαν μέσω ενεργοποιημένων με φθορισμό διαλογή κυττάρων-εξέταση υψηλής απόδοσης (FACS-HTS) χρησιμοποιώντας συνολικά 20.000 αποικίες σε εξήντα επτά πλάκες 96-φρεατίων κατά ζωντανών κυττάρων (μικτά κύτταρα ανθρώπινου GC έναντι της ανθρώπινης ελέγχους PBMC). MS17-57 και να ελέγχουν τις εμπορικές αλκαλική φωσφατάση (ALP) mAbs χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσουν τα αντιγόνα στόχους (ΕΕΑ), τα οποία ταυτοποιήθηκαν ως ALPS εκφράζεται στην επιφάνεια των κυττάρων GC μέσω ενός συνδυασμού κηλίδα western, ανοσοκαταβύθιση και φασματοσκοπία μάζας (MS).

MS εντοπιστεί η ΕΕΑ αναγνωρίζονται από MS17-57 είναι δύο παραλλαγές ενός εκκρίνεται ALP, σιαγόνων και IALP (πλακούντα και την εντερική ALP). Αυτές οι πρωτεΐνες ανήκουν σε μια οικογένεια ενζύμων υδρολάσης υπεύθυνο για την απομάκρυνση των φωσφορικών ομάδων από πολλούς τύπους μορίων. χρώση ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας MS17-57 απέδειξε υψηλότερα χρώση των ιστών του γαστρεντερικού (GI) καρκίνος σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς GI (

P

& lt? 0,03), και επιβεβαιώθηκε σύνδεση της MS17-57 να περιορίζεται σε ένα λειτουργικό επίτοπο που εκφράζεται επί ο καρκίνος κυτταρική επιφάνεια. δοκιμασίες πολλαπλασιασμού χρησιμοποιώντας την κεραία σιαγόνων /IALP-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν GC έδειξε ότι MS17-57 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 32 ± 8%. δοκιμασίες κυτταρικής μετανάστευσης Transwell τεκμηριωμένο ότι MS17-57 μπορεί να αναστείλει κεραία σιαγόνων /IALP εκφράζουν GI μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων κατά 25 ± 5%. MS17-57 mAb ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου σε γυμνά ποντίκια.

Συμπεράσματα

Τα ευρήματά μας δείχνουν ότι κεραίας σιαγόνων και IALP μπορεί να εκφράζεται εκτοπικά σε εξωκυττάριας μήτρας καρκίνων GI, και ότι MS17-57 κατευθύνονται έναντι κεραία σιαγόνων /IALP μπορούν να αναστείλουν GI καρκινικά κύτταρα ανάπτυξης και της μετανάστευσης

στο

vitro

και

στο

vivo

. Αυτή η έρευνα παρέχει ένα παράδειγμα της αναγνώρισης των βιοδεικτών του καρκίνου που αντιπροσωπεύουν πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στόχους χρησιμοποιώντας mAb που παράγεται μέσα από μια πρωτότυπη τεχνολογία HTS

Παράθεση:. Λι Μ, Gao J, Feng R, Wang Υ, Chen X, Sun J, et al. (2013) Δημιουργία Μονοκλωνικού Αντισώματος MS17-57 στόχευση εκκρινόμενη αλκαλική φωσφατάση εκτοπικά που εκφράζονται πάνω στην επιφάνεια των κυττάρων του καρκίνου του γαστρεντερικού συστήματος. PLoS ONE 8 (10): e77398. doi: 10.1371 /journal.pone.0077398

Επιμέλεια: Nikki Pui-Yue Lee, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 1η του Μάη 2013? Αποδεκτές: 3 Σεπ 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Οκτ 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (αριθμοί επιχορήγηση 81201596, 81101847, 81172324, 91229106, 31270963)? Βασικά έργα στο Εθνικό Επιστημονικό & amp? Πρόγραμμα τεχνολογίας πυλώνα της Κίνας (2011BA203191)? Επιστήμης και Τεχνολογίας της Επιτροπής του Δήμου Σαγκάης (12XD1403700, 12PJ1406300)? Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης της Κίνας (20110073110071)? Βασικό έργο της επιτροπής της Σαγκάης Παιδείας (12ZZ105). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Όλοι οι συγγραφείς είναι οι εφευρέτες της εκκρεμούσης αίτησης διπλώματος ευρεσιτεχνίας σχετικά με τις ανοσοποίηση ποντικών, προετοιμασία MS17- 57 υβριδιώματος και τη χρήση του μονοκλωνικού αντισώματος MS17-57 για τη θεραπεία του καρκίνου. Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δύο συγγραφείς είχαν προσληφθεί από μια εμπορική εταιρεία, Σαγκάη MabStar, Inc. Οι συγγραφείς δηλώνουν επίσης ότι MS17-57, καθώς και η μέθοδος ελέγχου έχει υποβληθεί για την αίτηση διπλώματος ευρεσιτεχνίας με τον τίτλο του «Generation αντι εκτοπικά-εκφράζεται αλκαλικό φωσφατάση mAb, τη μέθοδο και τις εφαρμογές της »(εκκρεμεί δίπλωμα ευρεσιτεχνίας), κρατική Υπηρεσία διανοητικής Ιδιοκτησίας της Λαϊκής Δημοκρατίας της Κίνας (CN201310090565.9). Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών. Τα άλλα τέσσερα μονοκλωνικά αντισώματα θα κατοχυρωθεί με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας και τα αποτελέσματα θα δημοσιευθούν επίσης.

Εισαγωγή

γαστρεντερικού (GI) καρκίνος είναι μία από τις πιο κοινές κακοήθεις όγκους σε ανθρώπους με υψηλό κίνδυνο θνησιμότητας σε όλο τον κόσμο [1]. Η ανάπτυξη θεραπευτικών αντισωμάτων για τη διερεύνηση, την αξιολόγηση, την πρόληψη και τη θεραπεία του καρκίνου είναι ένας από τους ταχύτερα αναπτυσσόμενους τομείς της έρευνας τόσο στον ακαδημαϊκό χώρο και τη φαρμακευτική βιομηχανία [2]. Η παραγωγή μονοκλωνικών αντισωμάτων υψηλής ποιότητας (mAbs) έναντι δείκτες καρκίνου ως θεραπευτικοί στόχοι είναι μια σημαντική οδός για την κλινική ανάπτυξη φαρμάκων. Μερικοί δείκτες καρκίνου είναι γνωστές (π.χ., ανθρώπινο υποδοχέα του επιδερμικού αυξητικού παράγοντα 2 και αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα) ή έχουν αναπτυχθεί καλά, αλλά οι περισσότεροι είναι ακόμη άγνωστες ή υπανάπτυκτες [3]. Υπάρχει επομένως μεγάλο ενδιαφέρον για τη δημιουργία mAb κατά νέο και άγνωστο στόχων καρκίνου. mAb έναντι συγκεκριμένων στόχων όγκου μπορούν να αναπτυχθούν και να ταυτοποιηθούν χρησιμοποιώντας μια ποικιλία προσεγγίσεων, συμπεριλαμβανομένων ένζυμο-συνδεδεμένη ανοσορροφητική δοκιμασία (ELISA) διαλογή -Υψηλής απόδοσης (HTS), ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων (FACS) -HTS, και

in vitro

και

in vivo

διαλογής.

Ταυτοποίηση νέων βιοδεικτών του καρκίνου που εμπλέκονται στην καρκινογένεση, την ανάπτυξη του καρκίνου, ή την πρόληψη του καρκίνου εξακολουθεί να είναι μεγάλο ενδιαφέρον σε όλο τον κόσμο [4,5]. Λόγω εξελίξεις στην πρωτεομική και άλλες πτυχές της μοριακής βιολογίας, οι έρευνες αυτές είναι όλο και πιο εφικτή στη σημερινή εποχή από ό, τι στο παρελθόν. Τεχνολογία αιχμής HTS είναι σχετικά καλά ανεπτυγμένα και είναι πολύ δημοφιλής σε πολλούς ακαδημαϊκούς τομείς [6,7].

Για το λόγο αυτό έχουν ερευνήσει τη γενιά των mAbs έναντι των πιθανών νέων Ags στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων με τη χρήση ενός FACS- μέθοδο HTS. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι MS17-57 mAbs θα μπορούσε να εντοπίσει πλακούντα και εντερική αλκαλική φωσφατάσες (κεραία σιαγόνων και IALP, αντίστοιχα) ως στόχοι που εκφράζονται επί της κυτταρικής μεμβράνης του καρκίνου. Η στρατηγική μας ήταν να εκμεταλλευθεί μια νέα μέθοδο FACS-HTS και η τεχνολογία υβριδώματος χρησιμοποιώντας ένα μίγμα 4 ζωντανά καρκινικά GI κυτταρικές σειρές ως ανοσογόνο [8], υποθέτοντας ότι τουλάχιστον μερικά από τα mAb που παράγονται είναι πιθανόν να συνδέονται με διαμορφωτικό επίτοπο (-α ) στην κυτταρική επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων GI. Τα δεδομένα έδειξαν ότι MS17-57 μπορούσε να συνδεθεί με κεραία σιαγόνων και IALP που εκτοπικά εκφραζόμενη στην επιφάνεια των κυττάρων, και θα μπορούσε να εξουδετερώσει ALP δραστικότητα τόσο

in vitro

και

in vivo

. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι κεραίας σιαγόνων και IALP εκφράζεται επί της επιφάνειας του όγκου με παρεκκλίνουσα GI μεταβολισμό των καρκινικών κυττάρων και μονοπατιού σηματοδότησης στην οποία μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση. MS17-57 είναι ένα mAb με υψηλή συγγένεια και ειδικότητα, πιθανώς αντιπροσωπεύει ένα χρήσιμο αντιδραστήριο και μια πιθανή βάση για μια νέα θεραπευτική στρατηγική για την ανάπτυξη φαρμάκων για τον καρκίνο.

μελλοντικές μελέτες μας θα επικεντρωθεί στην μοριακό μηχανισμό του MS17-57 αναστολή των καρκινικών κυττάρων πολλαπλασιασμού και μετανάστευσης μέσω σύνδεσης προς κεραία σιαγόνων /IALP στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων, και στην αποσαφήνιση ενδοκυτταρικής μονοπάτια σηματοδότησης που επηρεάζονται από τη δράση αυτού του αντισώματος. Υποθέτοντας πρόσθετες έρευνες επιβεβαιώνουν τα ελπιδοφόρα αποτελέσματα που περιγράφονται σε αυτές τις προκαταρκτικές έρευνες, θα μπορούσε να επιδιωχθεί μηχανικής αντισώματος MS17-57 ως χιμαιρικό ή εξανθρωπισμένο αντίσωμα για θεραπευτική εφαρμογή.

Υλικά και Μέθοδοι

τηλέφωνα Πολιτισμών

καρκίνο του γαστρεντερικού κυτταρικές γραμμές ΜΚΝ45, BGC823, SGC7901, ΜΚΝ28, AGS και GES-1 αγοράστηκαν από το Ινστιτούτο Βιοχημείας και Κυτταρικής Βιολογίας , Σαγκάη Ινστιτούτα Life Science, κινεζική Ακαδημία Επιστημών (Σαγκάη, Κίνα) και την Bioresource Κέντρο Riken (Tsukuba, Ιαπωνία). Τα καρκινικά GI κυτταρικές σειρές ΜΚΝ-74 [9] και ΤΜΚ-1 [9] ήταν η προσφορά του Δρ Gary K. Schwartz (Memorial Sloan-Kettering, στη Νέα Υόρκη, NY, USA), και τα κύτταρα KKLS [10] ελήφθησαν από τον Dr. Yukuta Takahashi (Cancer Research Institute, University Kanazawa, Καναζάβα, Ιαπωνία). Οι κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου ST-8 και ST-9 [11] ήταν η ευγένεια του Δρ. Bradley McIntyre και Paul F. Μάνσφιλντ, το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου (Houston, TX, USA). Όλες οι άλλες κυτταρικές γραμμές (SP2 /0, κ.λπ.) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Μονοπυρηνικά κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) ελήφθησαν από ένα υγιή εθελοντή με ενημερωμένη συγκατάθεση.

Εκτός από κύτταρα μυελώματος SP2 /0 και των κυττάρων υβριδώματος mAb, όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε MD6, ένα σπιτικό, μέσο άνευ ορού που προέρχεται από τροποποιημένο μέσο Dubecco Eagle (Gibco BRL, Rockville, MD, USA) με 5% ορό απενεργοποιημένο με θερμότητα εμβρυϊκό ορό (FBS) (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /mL στρεπτομυκίνη (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Τα κύτταρα μυελώματος και υβριδώματος καλλιεργήθηκαν ομοίως αλλά χωρίς ορό εμβρύου μόσχου. Μυέλωμα και υβριδώματος κύτταρα αναπτύχθηκαν σε εναιώρημα. GI καρκινικά κύτταρα αναπτύχθηκαν να τηρούν φιάλες καλλιέργειας ιστού με 5% FBS /μεσαίου MD6.

ιστούς ασθενών

Φρέσκα δείγματα όγκου και των παρακείμενων noncancerous ιστούς (βλεννογόνο) του επτά ασθενείς GC υποβάλλονται σε χειρουργική επέμβαση ήταν που λαμβάνονται από το Τμήμα Χειρουργικής της Σαγκάης Ruijing Νοσοκομείο στη Σαγκάη της Κίνας. Αυτοί οι ασθενείς δεν είχαν λάβει κυτταροτοξική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία πριν από την επέμβαση. πρωτόκολλα Institutional Review Board παρατηρήθηκαν και δεοντολογική έγκριση για τη μελέτη χορηγήθηκε από την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας της Ruijing Νοσοκομείο, Σαγκάη Jiaotong University School of Medicine. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση είχαν ληφθεί από όλους τους συμμετέχοντες (συμπεριλαμβανομένων των εθελοντών δοτών) που συμμετέχουν στη μελέτη.

Φρέσκα ιστοί βάφτηκαν με MS17-57 καθώς και mAb ισοτυπικού ελέγχου. Τα σήματα δεσμευτική ενισχύθηκαν, επισημαίνονται με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη, και υπολογίζονται με FACS-HTS.

Ποντίκια

Άντρας A /J ποντίκια (Εργαστήριο Jackson, Bar Harbor, ΜΕ, USA) 6- ηλικίας 8 εβδομάδων αγοράστηκαν από τη Nanjing πειραματικό μοντέλο Κέντρο ζώων του Πανεπιστημίου Nanjing, Nanjing, Κίνα, και διατηρήθηκε στην εγκατάσταση ζώων της Σαγκάης MabStar, Σαγκάη της Κίνας. Η διατήρηση των ποντικών Α /J και πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από τη Σαγκάη καλή μεταχείριση των ζώων και την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας, Επιστημών και Τεχνολογίας Επιτροπή της Σαγκάης Δημοτική κυβέρνηση, η Κίνα και ο αριθμός της άδειας είναι SYXK (Hu) 2.009 έως 0.087.

αρσενικό JAX γυμνά ποντίκια ηλικίας 4-8 εβδομάδων αγοράστηκαν από τη Σαγκάη πειραματικό μοντέλο Κέντρο των ζώων και να διατηρηθεί στο Πειραματικό Κέντρο ζώων της Σαγκάης Ruijing Νοσοκομείου. Αυτά τα γυμνά ποντίκια χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα με ξενομοσχεύματα ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου (GC) και οι μέθοδοι είναι παρόμοιες με ομάδα Sela περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Η διατήρηση της JAX άτριχων ποντικών και πειραματικές διαδικασίες εγκρίθηκαν από τη Σαγκάη καλή μεταχείριση των ζώων και την Επιτροπή Ερευνών Δεοντολογίας, Επιστημών και Τεχνολογίας Επιτροπή της Σαγκάης Δημοτική κυβέρνηση, η Κίνα και ο αριθμός της άδειας είναι SYXK (Hu) 2011 – 0113.

Ζωντανά Cancer Cell Ανοσοποίηση

Κάθε Α /J ποντίκια χορηγήθηκε με υποδόρια ένεση σε 5-10 τοποθεσίες, καθώς και μία φορά ενδοπεριτοναϊκά (ΙΡ) με περίπου 5-10×10

6 κύτταρα (ίσες ποσότητες ΜΚΝ45, BGC823, SGC7901, και τα κύτταρα ΜΚΝ28) σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS? ρΗ 7,4). Τρία ποντίκια κατανεμήθηκαν ανά πειραματική παρτίδα. Δύο εβδομάδες αργότερα, τα ποντίκια ενέθηκαν και πάλι, για συνολικά τρεις ανοσοποιήσεις, συν ένα ε.π. αναμνηστική τρεις ημέρες πριν από το πείραμα σύντηξης

Τρεις ημέρες μετά την αναμνηστική, τα κύτταρα σπλήνας συλλέχθηκαν από χειρουργική επέμβαση από ένα ανοσοποιημένο ποντίκι θυσιάστηκε με CO

2 εισπνοή και όλες οι προσπάθειες έγιναν για τη μείωση της ταλαιπωρίας των ζώων.? τα σπληνοκύτταρα μετά συντήκονται με μυέλωμα 0 κύτταρα SP2 /[13,14] σε διάλυμα πολυαιθυλενογλυκόλης (ρΗ 7,4) σύντηξη του 50% για την παραγωγή mAb υβριδώματα. Τα συντηγμένα κύτταρα υβριδώματος διατηρήθηκαν σε υποξανθίνη-αμινοπτερίνη-θυμιδίνη μέσο (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA), και 280 μί /πηγάδι συντηγμένα κύτταρα (περίπου 1-2 χ 10

4 κύτταρα σπληνός /εκβάθυνση) μοιράστηκαν σε το εξήντα επτά 96-πηγαδιών πλάκες καλλιέργειας με επίπεδο πυθμένα των ιστών και επωάστηκαν στους 37 ° C σε ένα επωαστή με 5% CO

2 για 10 ημέρες. Την ίδια στιγμή, οι καρκινικές κυτταρικές γραμμές τέσσερις GI αναπτύχθηκαν σε χύμα σε πολλαπλές φιάλες.

ενεργοποιημένων με φθορισμό κυττάρων Ταξινόμηση με High-Throughput Screening (FACS-HTS)

Το σύστημα FACSCalibur-HTS (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για τη διαλογή των επιλεκτική υβριδωμάτων από μεγάλες ποσότητες σύντηξη κυττάρων /αποικιών στα τρυβλία σύντηξης. Έως 200 ελέγχου και μετρητή διαλογής (καρκινικά κύτταρα έναντι φυσιολογικών κυττάρων) πλάκες θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε ένα τέτοιο ποσοτικό προσδιορισμό διαλογής. Κύτταρα και από τις τέσσερις γραμμές GC συλλέχθηκαν, αναμίχθηκαν, και κλασματοποιήθηκε (περίπου 1×10

6 κύτταρα /φρεάτιο) σε πλάκες 96-φρεατίων υ-πυθμένα (67 πλάκες) .Το ίδιο αριθμό ανθρώπινων μονοπύρηνων κυττάρων περιφερικού αίματος (PBMCs) από ένα υγιή εθελοντή διαχωρίστηκαν με τη χρήση του διαλύματος ανθρώπινων λεμφοκυττάρων-διαχωρισμού Ficoll-Plaque Plus (GE Healthcare Biosciences, Pittsburgh, ΡΑ, USA) και κατανέμονται σε 96-φρεατίων υ-πυθμένα πλάκες (άλλο 67 πλάκες για διαλογή counter). Το υπερκείμενο (80 μL /φρεάτιο) από κάθε μία από τις πλάκες σύντηξης 67 μεταφέρθηκε σε πλάκες των κυττάρων GC επισημαίνονται από 1 έως 67 μετά αυτά τα κύτταρα είχαν μπλοκαριστεί από 2,0% αλβουμίνη βόειου ορού (BSA) /PBS ρυθμιστικό αποκλεισμού στις πλάκες. Το υπερκείμενο από τις ίδιες πλάκες σύντηξης παρομοίως μεταφέρθηκαν σε πλάκες PBMC. Αφού το κύτταρο GC και πλάκες PBMC πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού, το δευτερεύον αντίσωμα [ανοσοσφαιρίνη κατσίκας αντι-ποντικού G (IgG) Fc συζευγμένο με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη] δειγματίστηκε σε αμφότερες τις πλάκες GC κυττάρων και πλάκες PBMC (100 μL /φρεάτιο) και επωάζεται σε πάγο ή σε ψυγείο στους 4 ° C για 30 λεπτά, και πλύθηκαν πάλι τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα αποκλεισμού. Τα κύτταρα φθορίζουσα χρώση μονιμοποιήθηκαν σε 1.5% παραφορμαλδεΰδη /PBS. Το ποσοστό των χρωματισμένο αιχμής κυττάρων μετατόπιση και η μέση ένταση φθορισμού (MFI) παρακολουθούνταν συνεχώς από το σύστημα FACS-HTS για 134 διαλογή και αντι-διαλογή πλακών 96 φρεατίων U-πυθμένα. αποικίες υβριδώματος που εμφανίζουν ισχυρή δέσμευση και εξειδίκευση για κύτταρα GC (και καμία δέσμευση σε PBMCs) επιλέχθηκαν για επεκτατική ανάπτυξη, απογαλακτισμού από ρυθμισμένο μέσο, ​​και υποκλωνοποιήθηκε.

mAb Generation

Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν από τα επιλεγμένοι κλώνοι υβριδώματος και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας πρωτεΐνη Α στήλες Sepharose (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA). Επιλέξαμε το καθαρισμένο mAb MS17-57 για επιπλέον ανάλυση, το οποίο διηθήθηκε μέσω μεμβράνης 0.2 μm, αποστειρωμένα, και κατανέμονται σε κρυοσωλήνες διατηρήθηκε στους 4 ° C για χρήση σε καλλιέργειες κυττάρων ή

in vivo

μελέτες (που περιγράφεται παρακάτω). Το μίγμα του mAb σε PBS και 50% γλυκερόλη καταψύχθηκε στους -20 ° C για μακροπρόθεσμη αποθήκευση.

Ποντικού IgG ισοτύπου

Χρησιμοποιήσαμε ένα κιτ mAb ποντικού ισότυπων (Isostrip, RochePharma AG , Reinach, Switzerland) για να χαρακτηρίσει την ισοτόπου του MS17-57 mAb ποντικού (IgG).

cDNA αλληλουχίας της μεταβλητής περιοχής της MS17-57

Χρησιμοποιήσαμε ένα κιτ RNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA) για την απομόνωση ολικού RNA από κύτταρα υβριδώματος MS17-57. Η βιβλιοθήκη cDNA MS17-57 δημιουργήθηκε από mRNA σε αντιδράσεις αντίστροφης μεταγραφής με SuperScript III πρώτου κλώνου kit (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA). Οι MS17-57 IgG Fab θραύσμα που προσδένει Ag μεταβλητές περιοχές ενισχύθηκαν με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) με 21 ζεύγη βαριάς αλυσίδας και ελαφριάς αλυσίδας εκκινητές, τα οποία ελήφθησαν από το ποντίκι IgG Βιβλιοθήκη Primer Set (Progen Biotechnik, Heidelberg, Γερμανία). PCR προϊόντα χρησιμοποιήθηκαν για αλληλούχιση του DNA, το οποίο εκτελείται από τον Lee & amp? Lu εργαστήριο στο Αντικαρκινικό Κέντρο MD Anderson, Houston, TX, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. περιοχές καθορισμού συμπληρωματικότητας (CDR) και περιοχών πλαισίου (FWRs) της MS17-57 ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας διαθέσιμα στο Εθνικό Κέντρο για τις ιστοσελίδες Biotechnology Information πόρων και τον καθορισμό των ευθυγραμμίσεις των cDNA και αμινοξέων [15-18].

Έμμεση ELISA

Ag (πρωτεΐνη) (0.2 μg /mL σε PBS) επιστρώθηκε πάνω Immulon-II HB 96 φρεατίων πλάκες ELISA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, μΑ, USA) και επωάστηκαν σε μια υγρή -κουτί όλη τη νύκτα σε θερμοκρασία δωματίου (RT). Ag-επικαλυμμένες πλάκες πλύθηκαν και μπλοκαρίστηκαν με /PBS-Tween 20 (PBST) ρυθμιστικό 1.0% BSA, και 100 μL του πρωτογενή αντισώματα αραιωμένα σε ατομικά 1.0% BSA /PBST προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Οι πλάκες επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου και πλύθηκε με PBST. Μετά την έκπλυση, 100 μL του αραιωμένου (1: 2500) με υπεροξειδάση κοχλιαρίας (HRP) κατσίκας αντι-Ρο IgG ποντικού πολυκλωνικό δευτερεύον αντίσωμα (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, ΡΑ, USA) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 1 ώρα σε RT. Μετά επιπλέον πλύση με PBST, 150 μL υποστρώματος υπεροξειδάσης (τετραμεθυλοβενζιδίνης σε 0.02Μ [ρΗ 6,0] κιτρικού οξικού ρυθμιστικού διαλύματος και /0,003% Η

2O

2) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο για την ανάπτυξη του χρώματος των δεσμευτικών σήματα? ανάπτυξη διακόπηκε με την προσθήκη 50 μι 0.2Μ H

2SO

4 σε κάθε φρεάτιο. Η απορρόφηση (οπτική πυκνότητα? OD) των πλακών αντίδρασης διαβάστηκε στα 450 nm με την αναφορά θολότητα ορίζεται σε 620nm.

Immuocytochemical Ανάλυση με Cytospin Διαφάνειες

Για να κάνετε 1×10

6 κύτταρα GC σε 50 μί /έκαστο, κυτταροπεριστροφής τρύπες θάλαμο περιστράφηκαν σε διαφάνειες και μονιμοποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη /PBS διάλυμα, αφυδατωμένα με 70% αιθανόλη και ξηραίνεται στον αέρα. Τα πλακίδια επανυδατώθηκαν σε PBST σε επίπεδη θέση για 5 λεπτά και κατόπιν επωάστηκαν σε 10% ορό κατσίκας /PBS. Τα πλακίδια επωάστηκαν με πρωτεύοντα αντισώματα σε κατάλληλη αραίωση επί 1 ώρα σε RT ή τη διάρκεια της νύχτας στους 4 ° C, ξεπλύθηκαν σε PBST δύο φορές για 5 λεπτά /το καθένα σε οριζόντια θέση. Τα πλακίδια επωάστηκαν στη συνέχεια με το HRP επισημασμένο δευτερογενές αντίσωμα (γίδινο αντι-ποντικού IgG Fc-HRP, Jackson ImmunoResearch Laboratories) σε αραίωση 1: 500 σε PBS για 30 λεπτά σε RT. Ανίχνευση η χρώση mAb επί καρκινικών κυττάρων πραγματοποιήθηκε με 0,125% aminoethylcarbazole χρωμογόνο υπόστρωμα για 5-10 λεπτά σε RT, και τα mAb χρώση πλακίδια cytospin βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη του Gill (Dako, Carpinteria, CA, USA). Αντι-fade μέσο στερέωσης (Vector Labs, Burlingame, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για να τοποθετήσετε τις διαφάνειες.

Καρκίνος του κυτταρικού πολλαπλασιασμού Δοκιμασία Αναστολή

Η δοκιμασία αναστολής του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του καρκίνου διεξήχθη χρησιμοποιώντας μέτρηση των κυττάρων Kit-8 (Dojindo Molecular Technologies, Santa Clara, CA, USA) και βασίστηκε στην ανίχνευση της αφυδρογονάσης σε βιώσιμα κύτταρα. Ένα σύνολο 5.000 κυττάρων /150 μί επιλεγμένων BGC823, ΜΚΝ45, ή και οι δύο τύποι κυττάρων από τις κυτταρικές σειρές 4 GC που χρησιμοποιούνται στην ανοσοποίηση, διανεμήθηκε σε κάθε φρεάτιο πλακών 96-φρεατίων για κάθε ένα από τετραπλασιάζεται συνθήκες δοκιμής. Οι πλάκες προ-επωάστηκαν για 24 ώρες σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 5% CO

2. 50 μί /φρέαρ MS17-57 (8 και 2 μg /ml), ένα άσχετο (έλεγχος ισότυπου) mAbs (30 και 8 μg /mL) και ένα μέσο μόνο (μάρτυρα αναφοράς) προστέθηκε στις πλάκες δοκιμής εις τετραπλούν για να μειωθεί παραλλαγή. Οι πλάκες δοκιμασίας επωάζονται χρησιμοποιώντας τις ίδιες συνθήκες όπως και η προ-επώαση. CCK-8 διάλυμα προστέθηκε στις πλάκες (10 μΙ /φρεάτιο), λαμβάνεται ως μία πλάκα για κάθε συνθήκη δοκιμής ανά ημέρα από τις ημέρες 1 έως 7. Οι πλάκες επωάστηκαν για 3 ώρες και η απορρόφηση στα 450 nm μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα VERSAmax αναγνώστη μικροπλακός (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Cancer Cell Migration δοκιμασία αναστολής

Η αναστολή χημοταξικών μετανάστευση καρκινικών κυττάρων εκτιμήθηκε με τη χρήση του 24-φρεατίων χρωματομετρικό προσδιορισμό κυτταρικής μετανάστευσης QCM ( EMD Millipore, Billerica, ΜΑ, USA). Σε RT, 300 μΙ του κυτταρικού εναιωρήματος (1,0 χ 10

5 κύτταρα /mL σε MD6), με ή χωρίς κάθε 5, 10, και 20 μg /mL MS17-57 συν άσχετο mAbs προστέθηκαν σε κάθε ένθετο, προστέθηκε σε καθένα από τα 24 φρεάτια του θαλάμου μετανάστευσης, και 500 μL του MD6 με 5% ορό εμβρύου μόσχου προσετέθησαν σε κάθε φρεάτιο του κάτω θαλάμου. Οι πλάκες δοκιμασίας επωάζονται σε επωαστήρα ιστοκαλλιέργειας στους 37 ° C με 5% μη-μεταναστευτικά κύτταρα CO

2 για 24 ώρες, και απομακρύνθηκαν απαλά από το εσωτερικό των ένθετων με ένα βαμβάκι-στυλεό. Τα κύτταρα στην κάτω επιφάνεια της μεμβράνης βάφτηκαν με εμβάπτιση των ενθέτων σε κρυσταλλικό ιώδες (α νουκλεϊκό χρωστική) διάλυμα χρώσης (500 μL /φρεάτιο) για 20 λεπτά. Τα ένθετα ξεπλύθηκαν σε νερό αρκετές φορές, αφέθηκε να στεγνώσει στον αέρα, και φωτογραφήθηκαν. Τα βαμμένα κύτταρα κλασματοποιήθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων και μετρήθηκαν με VERSAmax ανάγνωσης μικροπλάκας (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

Ανάπτυξη Όγκου σε ποντικούς Balb /C ποντικοί Nude

Η αντικαρκινική δραστηριότητα της MS17-57 μελετήθηκε με ξενομοσχεύματα ανθρώπινου GC σε Balb /C γυμνούς ποντικούς όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Εν συντομία, 1 x 10

6 επιλεγμένα BGC823 ή ΜΚΝ45 κύτταρα σε MD6 με ή χωρίς MS17-57 συν άσχετα μονοκλωνικά αντισώματα εγχύθηκαν ε.π. σε κάθε ποντικό. Αυτή η ένεση παρήγαγε όγκους σε όλα τα ποντίκια με 6 εβδομάδες μετά την εμφύτευση των κυττάρων, και το βάρος του οζιδίου του όγκου του κάθε ήταν περίπου 0.3-1.0 γραμμάριο, το οποίο εξαρτάται από το πόσο εμβολιάσθηκαν πολλοί αρχικά κύτταρα. Η θεραπεία με MS17-57, άσχετο mAbs, και PBS (ως μέσον τυφλές) (όλα ip) άρχισε την ημέρα μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων (δηλαδή, την ημέρα 1) και επαναλήφθηκε κατά τις ημέρες 15 και 29. Κάθε ομάδα θεραπείας αποτελείτο από κατά τουλάχιστον τέσσερα ζώα. Ο αριθμός των οζιδίων όγκου μετρήθηκε, και η διάμετρος όζου μετρήθηκε μία φορά. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν με εισπνοή CO2 κατά την ημέρα 48 και όλες οι προσπάθειες έγιναν για τη βελτίωση ταλαιπωρία των ζώων.

ανοσοκατακρήμνιση (ΙΡ) και φασματομετρία μάζας (MS) Ανάλυση

Για τις έμμεσες IP, μαγνητικά Dynabeads επικαλυμμένα με πρωτεΐνη-Α (Invitrogen, Grand Island, NY, USA) επωάστηκαν με 50 μα MS17-57 για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με διαρκή ανάδευση. Τα σφαιρίδια στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με προϊόν λύσης επιλεγμένων BGC823 ή ΜΚΝ45 GC κύτταρα, τα οποία τα προϊόντα λύσης αραιώθηκαν κατάλληλα. Η επώαση έλαβε χώρα με την παρουσία 0,1% TritonX-100 σε εκχυλίσματα δοκιμασία ραδιοανοσοκατακρήμνισης (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA). mAb έναντι αντι-β-ακτίνης (περίπου 42 kDa σε νάτριο δωδεκυλ θειικού πολυακρυλαμιδίου ηλεκτροφόρηση πηκτής [SDS-PAGE] γέλη) χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικό πρότυπο βαθμονόμησης. Το προϊόν λύσης διαδοχικά εκτίθεται σε MS17-57-επικαλυμμένα σφαιρίδια για 30 λεπτά με περιστροφή. Bound σφαιρίδια πλύθηκαν με 0,5% TritonX-100 που ακολουθείται από νερό. Τα δείγματα εκλούσθηκαν με θέρμανση σε βραστό νερό με 50 μί /κάθε εκλούσματος του Laemmli μετουσίωσης ρυθμιστικού δείγματος (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Στη συνέχεια, τα δείγματα φορτώθηκαν και διαχωρίστηκαν σε 10% Bis-Tris γέλης (Bio-Rad) σε 1 × 2 – (

N-μορφολινο

) αιθανοσουλφονικό οξύ ρυθμιστικό τρέξιμο και SDS-PAGE. Το πήγμα κηλιδώνεται με ένα κιτ χρωστική αργύρου (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA). Οι χρωματισμένες ζώνες στόχοι αποκόπηκαν και αναλύθηκαν με μία σειρά σύστημα ProteinChip 4000 φασματόμετρο μάζας (Enterprise Edition) (Bio-Rad).

Άμεση IP πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ σύζευξης Dynabeads αντίσωμα (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ, USA) σε απευθείας ζευγάρι τα σφαιρίδια με MS17-57. Τα υπόλοιπα στάδια ήταν τα ίδια όπως περιγράφεται για την έμμεση ΙΡ.

mRNA έκφρασης με Ποσοτική Αντίστροφη Μεταγραφή (qRT) Ανάλυση -PCR

Εκχύλιση του συνολικού RNA από κυτταρικές γραμμές καρκίνου 10 GI διεξήχθη με ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (Invitrogen, Grand Island, Νέα Υόρκη, ΗΠΑ) [19]. RNA προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας την αναλογία απορρόφησης Α260 /Α280-nm. Για τη μετατροπή του RNA σε cDNA, ένα 1 μL του συνολικού δείγματος RNA χρησιμοποιήθηκε σε μία αντίστροφη αντίδραση μεταγραφής με αναστολέα RNase (Invitrogen), SuperScript III ανάστροφης μεταγραφάσης (Invitrogen), διθειοθρεϊτόλη, και ρυθμιστικό διάλυμα πρώτου κλώνου. Τα μίγματα των δειγμάτων επωάστηκαν σε RT για 10 λεπτά και στη συνέχεια στους 42 ° C για 50 λεπτά. Η αντίδραση απενεργοποιήθηκε στους 70 ° C για 15 λεπτά.

Τα εμπρός και προς τα πίσω εκκινητές IALP, κεραία σιαγόνων, και αφυδρογονάση γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής (5′-TCCATCTTCGGGTTGGCCCCC-3 ‘και 5′-TCCGTGGGTCTCGGACGACAG-3 «? 5’- CCTGGGTGCTGCTCCTGCTGGG-3 ‘και 5′-CGTAGACACCCCCATCCCGTCAC-3′? και 5’-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 ‘και 5′-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3’, αντίστοιχα) συντέθηκαν και χρησιμοποιήθηκαν σε πραγματικό χρόνο αντίδρασης PCR με SYBR πράσινο αντιδραστήρια (Life Science, Hercules, CA, USA) και φορτώθηκε σε μία πλάκα 96 φρεατίων. Το μίγμα των δειγμάτων διεξήχθη σε πραγματικό χρόνο σύστημα ανίχνευσης CFX96 Touch PCR (Bio-Rad) υπό τις ακόλουθες συνθήκες: 93 ° C για 2 λεπτά για προ-μετουσίωση, 93 ° C για 1 λεπτό για μετουσίωση, 55 ° C για 1 λεπτό για ανόπτηση, 72 ° C για 1 λεπτό για επέκταση σε 40 κύκλους, και 72 ° C για 7 λεπτά για την τελική επώαση. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού Opticon Monitor (Life Science, Hercules, CA, USA).

Στατιστική Ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση του λογισμικού SPSS (IBM). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέσο ± τυπικό σφάλμα του μέσου. Οι διαφορές αναλύθηκαν με t-test του Student?

P

τιμές & lt? 0,05 θεωρήθηκαν ως σημαντικές

Αποτελέσματα

MS17-57 Hybridoma δημιουργήθηκε με ανοσοποίηση με ζωντανά κύτταρα GC

Σύμφωνα με τις αρχές. του mAb γενιάς [10], χρησιμοποιήσαμε ένα μείγμα ζωντανών κυττάρων ΜΚΝ45, BGC823, SGC7901, και ΜΚΝ28 GC ως ανοσογόνο για την ανοσοποίηση A /J ποντίκια τρεις φορές. Πριν από την τελική ώθηση, ο ορός από ένα ουρά-αφαίμαξη κάθε ανοσοποιημένο ποντίκι συλλέχθηκε. SGC7901 και BGC823 κύτταρα επιλέχθηκαν τυχαία από τις τέσσερις κυτταρικές γραμμές που GC χρησιμοποιήθηκαν σε ζωντανό κύτταρο ανοσοποίησης. Ανθρώπινα PBMCs απομονώνονται από πλήρες αίμα ενός υγιούς δότη χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος noncancer. Ανθρώπινα κύτταρα GC και τα PBMCs δεσμεύεται με ορό από κάθε ανοσοποιημένους ποντικούς και με μη ανοσοποιημένα ορό ποντικού για τον έλεγχο (Σχήμα 1). Και οι τρεις ποντικοί σε κάθε ομάδα κυτταρική γραμμή εμφάνισε σήματα σε κυτταρικές σειρές GC και PBMCs πρόσδεσης, αν και PBMCs είχαν σχετικά ασθενέστερα σήματα.

Ανθρώπινα PBMCs απομονώθηκαν από ολικό αίμα ενός υγιούς δότη που επιλέγεται για κανονικό έλεγχο των κυττάρων. ΜΚΝ45, BGC823, SGC7901, και ΜΚΝ28 κύτταρα που χρησιμοποιούνται σε πειράματα, αλλά κυτταρικές σειρές SGC7901 και BGC823 επιλέχθηκαν τυχαία ως παραδείγματα σε αυτό το σχήμα. Η MFI ήταν υψηλότερες σε αυτά τα κύτταρα από ό, τι σε PBMCs. Και οι τρεις ποντικοί παρουσίασαν ισχυρές ανοσοαποκρίσεις προς τις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC.

Η

Σπληνοκύτταρα από τέσσερις ανθρώπινες κυτταρικές σειρές GC ανοσοποιημένα ποντίκια συντήχθηκαν με 0 κύτταρα μυελώματος ποντικού SP2 /για να δημιουργηθεί το υβρίδωμα αντισώματος. FACS-HTS χρησιμοποιήθηκε για τη διαλογή ως προς τη δέσμευση ισχυρότερη Ag από μια μεγάλη δεξαμενή των συνδετικών (δηλ mAbs) στο ρεπερτόριο υβριδώματος. Τα mAbs δεσμεύεται κυρίως στους διαμορφωτικούς επίτοπους επί της επιφανείας των ζώντων καρκινικών κυττάρων. Χρησιμοποιώντας FACS-HTS, επιλέξαμε αποικίες υβριδώματος με ισχυρά σήματα σύνδεσης χρησιμοποιώντας ένα σύνολο 20.000 αποικιών σε εξήντα επτά τρυβλία 96 φρεατίων έναντι των μικτών ζωντανά κύτταρα GC και φυσιολογικά ανθρώπινα PBMCs (μετρητής κύτταρα διαλογής). Μετά αυτά τα κύτταρα υβριδώματος απογαλακτισμού από το μέσο επιλογής, επιλέχθηκαν οι πέντε υβριδώματα με τα υψηλότερα σήματα σύνδεσης για υποκλωνοποίηση και καθαρισμό συγγένειας αντισώματος. Εμείς επιλέξαμε το MS17-57 κλώνο για περαιτέρω μελέτη. (Οι υπόλοιποι τέσσερις mAbs θα αξιολογηθεί σε μεταγενέστερη ημερομηνία.)

MS17-57 Χαρακτηρισμός

χαρακτηρίζεται MS17-57 mAb με μια ποικιλία μεθόδων. Πληροφορίες σχετικά με IgG1 για την βαριά αλυσίδα και κ για την ελαφριά αλυσίδα ελήφθη από ισότυπων αντισώματος ποντικού [20]. Οι μεταβλητές περιοχές (ελαφριά και την βαριά αλυσίδα) στο κλάσμα Fab του MS17-57 αλληλουχήθηκαν για το DNA και τα αμινοξέα (Σχήμα 2). Οι μοναδικές περιοχές Ag δέσμευσης έδειξαν ότι οι CDRs μεταξύ των FWRs των βαριών και ελαφριών αλυσίδων ήταν παρόντες στην μεταβλητή περιοχή του Fab θραύσματος και την ταυτότητα MS17-57.

FWRs βρίσκονται μεταξύ CDRs.

MS17-57 η σύνδεση με το λύματα GI καρκινικά κύτταρα

για να ορίσετε κάποια βιολογικά χαρακτηριστικά των MS17-57 mAb, λύματα του ΜΚΝ45, BGC823, και GES-1 κυτταρικές σειρές (το τελευταίο παράγεται και αθανατοποιημένα από την κανονική του βλεννογόνου του στομάχου κύτταρα και μετασχηματισμένα με ιό πιθήκου 40) [21] μεμονωμένα επιχρίσθηκαν σε πλάκες ELISA. Το καθαρισμένο MS17-57 προστίθεται στην πλάκα συν δευτερεύον αντίσωμα-ΗΚΡ ενισχυμένα τα σήματα δέσμευσης (Σχήμα 3). Αυτή η έμμεση ELISA έδειξε ότι θα μπορούσε ακόμα MS17-57 δεσμεύονται ειδικά στο μετουσιωμένο στόχο (ες) πρωτεΐνης κυτταρικής μεμβράνης από τις καρκινικές κυτταρικές λύματα. κύτταρα ΜΚΝ45 εξέφρασε τον στόχο MS17-57 σε υψηλότερο επίπεδο από ό, τι BGC823 ή GES-1 κύτταρα έκαναν, υποδηλώνοντας ότι τα επίπεδα έκφρασης στόχου μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των κυτταρικών σειρών.

κύτταρα ΜΚΝ45, BGC823, SGC7901, και ΜΚΝ28 χρησιμοποιήθηκαν σε πειράματα, αλλά κυτταρικές γραμμές ΜΚΝ45 και BGC823 επιλέχθηκαν τυχαία ως παραδείγματα σε αυτό το σχήμα. MS17-57 εξέφρασε την ισχυρή δέσμευση σήματα στα κύτταρα ΜΚΝ45 και μέτρια σήματα δεσμευτικές για BGC823 κύτταρα και GES-1 κύτταρα. Τα κυτταρολύματα επικαλύφθηκαν με 1,0 μg /ml PBS επί Immulon-II HB 96 φρεατίων πλάκες ELISA (100 μλ /φρεάτιο). Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης αυτών των προϊόντων λύσης κυττάρου ήταν ισορροπημένο, αλλά όχι για τους δεσμευτικούς στόχους (ΕΕΑ) που θα μπορούσαν να είναι μια μεγάλη παραλλαγή. Άσχετο mAb χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος ισοτύπου.

Η

Εντοπισμός MS17-57 Στόχοι σε καρκινικά κύτταρα

MS17-57 δεσμευμένο σε όλες τις κυτταρικές σειρές τέσσερις GC που χρησιμοποιούνται για την ανοσοποίηση, αν και η σύνδεση σήματα δεν ήταν ίσης έντασης (Σχήμα 4Α). Το επίπεδο έκφρασης των MS17-57 στόχος ήταν υψηλότερη στην ΜΚΝ45 κύτταρα και χαμηλότερα στα κύτταρα SGC7901. Παρόμοια με τα αποτελέσματα αντι-διαλογής, MS17-57 mAb δεν συνδέεται προς ανθρώπινα PBMCs. Το έκανε δεσμεύονται με ορισμένους άλλους τύπους κυττάρων GC (Σχήμα 4Β), αλλά όχι να gi κύτταρα (Σχήμα 4C). Έτσι, ο στόχος (-οι) MS17-57 δεν είναι καθολικά εκφράζονται, αν και φαίνεται να είναι πιο συχνή σε κύτταρα GC από τα κύτταρα GI.

A.MS17-57 συνδεδεμένο με όλες τις κυτταρικές τέσσερις GC γραμμές που ήταν που χρησιμοποιούνται για ζωντανό κύτταρο ανοσοποίησης. Β MS17-57 παρουσίασαν ισχυρή δεσμευτική σήματα στα κύτταρα AGS GES-1 και όμως κανένα σήμα δεσμευτικός ως προς όλα τα ανθρώπινα PBMCs. C. MS17-57 δεν συνδέεται προς ανθρώπινα PBMCs ούτε κανένα από τα πέντε κυττάρων GI όγκου. Άσχετο mAb χρησιμοποιήθηκε ως ο έλεγχος ισότυπος mAb.

Η

Φρέσκα καρκινικών ιστών και των παρακείμενων noncancerous ιστούς από έξι ασθενείς GC βάφτηκαν για MS17-57 και mAb ελέγχου ισοτόπου και στη συνέχεια ποσοτικά με τη δόση εξαρτάται δεσμευτικός ως προς όλα FACS-HTS. Συνολικά, η δεσμευτική σήμα MS17-57 ήταν ισχυρότερη σε καρκινικούς ιστούς σε σύγκριση με μη καρκινικό ιστούς (

P

& lt? 0,03) (Πίνακας 1 και Σχήμα 5). Αυτό το πείραμα έδειξε ότι MS17-57 μπορεί να συνδεθεί με τους στόχους της στη μητρική τους μορφή στην επιφάνεια των νωπών δειγμάτων όγκου.

Ασθενής GC

ιστών

mAb

ΝΧΙ

% Βιτρώ Peak

αφαιρείται ΝΧΙ

2

Κανονικοποιημένη ΝΧΙ

3

Ασθενών-1TumorIsotype Ctrl6.150.5113.0611.56MS17-5719.2118.23NormalIsotype Ctrl11.620.3215.898.76MS17-5727.5111.58Patient-2TumorIsotype Ctrl10.962.836.155.78MS17- 5717.1111.94NormalIsotype Ctrl28.3110.48-12.592.06MS17-5715.728.26Patient-3 * TumorIsotype Ctrl —- MS17-57 – NormalIsotype Ctrl —- MS17-57 – ασθενής-4TumorIsotype Ctrl3.760.18.2711.83MS17-5712.0313 NormalIsotype Ctrl4.90.861.294.67MS17-576.193.82Patient-5TumorIsotype Ctrl8.583.2-0.53.48MS17-578.084.02NormalIsotype Ctrl9.515.32-4.651.89MS17-574.861.08Patient-6TumorIsotype Ctrl7.95.488.317.59MS17-5716.217.63NormalIsotype Ctrl10.3310.213