Αφηρημένο

Ιστορικό

Η πολυφαρμακευτική αντίσταση (MDR) σε γαστρικό καρκίνο εξακολουθεί να αποτελεί σημαντική πρόκληση στην κλινική θεραπεία. Ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα 4 (ATF4) είναι ένα γονίδιο αντίδραση στο στρες που εμπλέκονται στην ομοιόσταση και κυτταρική προστασία. Ωστόσο, η έκφραση και η λειτουργία των ATF4 σε γαστρικό καρκίνο MDR παραμένει άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, θα διερευνήσει κατά πόσον ATF4 παίζουν ρόλο στον γαστρικό MDR του καρκίνου και των πιθανών μηχανισμών της.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Έχουμε αποδείξει ότι ATF4 υπερέκφραση confered τον φαινότυπο MDR σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα, ενώ νοκ ντάουν της ATF4 στο MDR των παραλλαγών που προκαλείται εκ νέου ευαισθητοποίηση. Στη μελέτη αυτή δείξαμε επίσης ότι το NAD

+ – εξαρτώμενη SIRT1 αποακετυλάσης ιστόνης απαιτήθηκε για ATF4 επαγόμενη δράση MDR σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Έχουμε αποδείξει ότι ATF4 διευκόλυνε MDR σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα μέσω της άμεσης σύνδεσης με τον υποκινητή SIRT1, με αποτέλεσμα SIRT1 πάνω ρύθμιση. Σημαντικά, η αναστολή της

SIRT1

από μικρά RNA παρεμβολής (siRNA) ή ένα συγκεκριμένο αναστολέα (EX-527) εκ νέου θεραπευτική ευαισθησία. Επίσης, η αυξημένη Bcl-2 /αναλογία Bax και το επίπεδο έκφρασης MDR1 βρέθηκαν σε κύτταρα ATF4-υπερεκφράζουν.

Συμπεράσματα /Σημασία

Δείξαμε ότι ATF4 είχε βασικό ρόλο στη ρύθμιση της MDR στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα σε ανταπόκριση στη χημειοθεραπεία και αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η στόχευση ATF4 θα μπορούσε να ανακουφίσει θεραπευτική αντίσταση στο γαστρικό καρκίνο

Παράθεση:. Zhu η, Xia L, Zhang Υ, Wang η, Xu W, Χου H, et al. (2012) Ενεργοποίηση Μεταγραφή Factor 4 παρέχει πολλαπλά φάρμακα Αντίσταση φαινότυπο Τα καρκινικά κύτταρα του γαστρικού μέσω Μετενεργοποίησης της έκφρασης SIRT1. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10.1371 /journal.pone.0031431

Επιμέλεια: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Σεπτεμβρίου, 2011? Αποδεκτές: 8 Γενάρη του 2012? Δημοσιεύθηκε: 17, Φεβρουαρίου, 2012

Copyright: © 2012 Zhu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από συνδυασμό επιχορηγήσεων από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (NO.81090270, NO.81090273, και NO.81000864), το Ίδρυμα κινεζική Μεταδιδακτορικός Science (NO.20100471776), το Εθνικό Key και Basic Πρόγραμμα Ανάπτυξης Έρευνας της Κίνας ( ΟΧΙ. 2010CB529302), και το Εθνικό Σχέδιο Δημοτική Επιστήμης και Τεχνολογίας (2009ZX09103-667 και 2009ZX09301-009-RC06). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα είναι συνήθως η κύρια αιτία για την αποτυχία της χημειοθεραπείας κατά κακοήθων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του γαστρικού [1] .Η όρος αντοχής πολυφαρμάκου κλασικά χρησιμοποιείται για να ορίσει ένα φαινότυπο αντίστασης όπου τα κύτταρα καθίστανται ανθεκτικά ταυτόχρονα σε διαφορετικά φάρμακα με καμία προφανή δομική ομοιότητα και με διαφορετικούς κυτταρικούς στόχους [2]. MDR εμφανίζεται συχνότερα με τα νέα φάρμακα που έχουν πιο σημαντική αποτελεσματικότητα μετά την πρώτη εφαρμογή τους στη θεραπεία του καρκίνου. Η κλινική χρησιμότητα των πολλαπλών φαρμάκων περιορίζεται τόσο από φυσικές και επίκτητη αντίσταση όγκου των κυττάρων, η οποία σχεδόν πάντοτε είναι πολυπαραγοντική χαρακτήρα [3]. Οι παράγοντες που μπορούν να επηρεάσουν την ευαισθησία φαρμάκου περιλαμβάνουν: επιτάχυνση της αποβολής του φαρμάκου, η ενεργοποίηση του φαρμάκου και η αδρανοποίηση, οι μεταβολές στο στόχο του φαρμάκου, μεθυλίωση του DNA, την επεξεργασία της βλάβης που προκαλείται από φάρμακα, και της φοροδιαφυγής απόπτωσης [4]

καρκίνο του στομάχου. είναι σχετικά αναίσθητος σε χημειοθεραπευτικά. Οι μηχανισμοί MDR σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα έχουν ευρέως ερευνηθεί στο εργαστήριο μας και αλλού [1], [4], [5], όμως δεν έχουν πλήρως διευκρινιστεί, υποδεικνύοντας ότι άλλα άγνωστα μόρια ή πορείες μπορεί να εμπλέκονται στην ανάπτυξη του MDR.

σε κύτταρα θηλαστικών, παράγοντα έναρξης της μετάφρασης ευκαρυωτικό 2 α υπομονάδα (eIF2α) φωσφορυλιώνεται από διαφορετικές κινάσες eIF2α σε απόκριση σε διαφορετικά σήματα στρες, συμπεριλαμβανομένων ανοξία /υποξία, ενδοπλασματικό δίκτυο στρες, στέρηση αμινοξέος, και το οξειδωτικό στρες. Αυτό το γεγονός οδηγεί σε φωσφορυλίωση μια ταχεία μείωση των παγκόσμιων ταυτόχρονη βιοσύνθεση πρωτεΐνης με επαγωγή της μεταγραφικής έκφραση των γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων των

ATF4

που λειτουργούν για την ανακούφιση κυτταρικής βλάβης από στρες [6], [7]. Παρά το γεγονός ότι ATF4 μπορεί να παίξει ένα προ-αποπτωτικό ρόλο κάτω από συνθήκες σοβαρής ή παρατεταμένης στρες,

ATF4

είναι ένα ισχυρό στρες που ανταποκρίνεται γονίδιο πιστεύεται ότι παίζουν ένα προστατευτικό ρόλο ρυθμίζοντας την κυτταρική προσαρμογή στις δυσμενείς συνθήκες στην απάντηση ολοκληρωμένη στρες ( ISR) [8], [9], [10]. Πρόσφατα, η υπερέκφραση του ATF4 αναφέρθηκε ότι είναι εμφανής σε μια ευρεία ποικιλία των όγκων και για την προστασία των κυττάρων του όγκου έναντι πολλαπλών τάσεων, καθώς και μια σειρά από καρκίνο θεραπευτικών παραγόντων [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Οι πιθανοί μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την προστασία αυτή περιλαμβάνουν επαγωγή αυτοφαγία, την προώθηση της επισκευής βλάβης του DNA, και τα πάνω ρύθμιση της ενδοκυτταρικής γλουταθειόνης [12], [13], [14], [17]. Ωστόσο, η έκφραση και η λειτουργία των ATF4 σε γαστρικό καρκίνο MDR παραμένει άγνωστη.

Σε αυτή τη μελέτη, ανέφεραν ότι ATF4 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε απόκριση MDR του γαστρικού καρκίνου κυττάρων σε σύγκριση με γονικά κύτταρα ελέγχου. Νοκ ντάουν του

ATF4

από siRNA ευαισθητοποιημένα σημαντικά κύτταρα με MDR σε μια ποικιλία χημειοθεραπευτικών παραγόντων, ενώ πάνω ρύθμιση των ATF4 στην SGC7901 και AGS κύτταρα καθίστανται τους πολλαπλού ανθεκτικά. Δείξαμε επίσης ότι ATF4 προωθείται γαστρικό καρκίνο MDR εν μέρει μέσω up-ρυθμίζουν την έκφραση της SIRT1. Και αναστολή SIRT1 θα μπορούσε να αντιστρέψει εν μέρει την γαστρικού καρκίνου MDR φαινότυπο διαμεσολαβείται από ATF4. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η στόχευση ATF4 μπορεί να παρέχει μια νέα θεραπευτική επιλογή για την αναστροφή των κλινικών καρκίνο του στομάχου MDR.

Αποτελέσματα

ATF4 διαμορφώνει τον φαινότυπο MDR των γαστρικών καρκινικών κυττάρων

Για να προσδιοριστεί εάν ATF4 εμπλέκεται στην ανάπτυξη του MDR σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα, τα επίπεδα ATF4 ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western και qPCR στο SGC7901 κυτταρική γραμμή και MDR του παραλλαγές, SGC7901 /VCR και SGC7901 /ADR. Και τα δύο επίπεδα πρωτεΐνης και του mRNA του ATF4 ήταν πολύ υψηλότερες στις ανθεκτικές κυτταρικές γραμμές από ό, τι σε γονικά κύτταρα (Εικ. 1Α).

(Α) Η πρωτεΐνη και τα επίπεδα mRNA του ATF4 σε MDR γαστρικά καρκινικά κύτταρα (SGC7901 /ADR και SGC7901 /VCR) και γονικών κυττάρων SGC7901 εξετάστηκαν με Western και qPCR. β-ακτίνη και GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος, αντίστοιχα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Η απόκριση του LV-διάνυσμα και LV-ATF4 σταθερά επιμολυσμένα SGC7901 και AGS να σισπλατίνη ελέγχθηκε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Οι κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε αγωγή συνεχώς είτε με 0 ή 0,25 μg /ml σισπλατίνης για 14 d? μέσα μαζικής ενημέρωσης ήταν αλλάζονται κάθε 3 ημέρες. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν, και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Αντιπροσωπευτικά πηγάδια εμφανίζονται. Γραφήματα παρέχουν μέσο ποσοτικοποίησης ως ποσοστό των μη επεξεργασμένο κυττάρων. (C) LV-SCR και LV-siATF4 σταθερά επιμολυσμένα SGC7901 /ADR και SGC7901 /VCR κύτταρα επεξεργάστηκαν συνεχώς είτε με 0 ή 0,5 μg /ml σισπλατίνης για 14 d? μέσα μαζικής ενημέρωσης ήταν αλλάζονται κάθε 3 ημέρες. (Δ) και (Ε) LV-διάνυσμα και LV-ATF4 σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές SGC7901 και LV-SCR και LV-siATF4 σταθερώς επιμολυσμένα SGC7901 /κύτταρα ADR υποβλήθηκαν σε αγωγή με υποδεικνυόμενες δόσεις των διαφορετικών φαρμάκων για 72 ώρες.

In vitro

ευαισθησία φαρμάκου ελέγχθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (F) και σταθερώς διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές SGC7901 (G) LV-διάνυσμα και LV-ATF4, LV-SCR και LV-siATF4 σταθερώς επιμολυσμένα SGC7901 κύτταρα /ADR και τις αντίστοιχες μη επεξεργασμένο ομολόγων τους (NC) αναπτύχθηκαν σε φρέσκο ​​μέσο με την παρουσία σισπλατίνης στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις (για SGC7901-NC, SGC7901-Vector, και SGC7901-ATF4, 5 μg /ml? για SGC7901 /ADR-NC, SGC7901 /ADR-SCR, και SGC7901 /ADR-siATF4, 10 μg /ml) για 36 ώρες. Στη συνέχεια, Hoechst 33258 πυρηνική χρώση και δοκιμασία κατάτμησης DNA διεξήχθησαν. (H) SGC7901 και SGC7901 /ADR σταθερές διαμολυσμένες κυτταρικές σειρές όπως παραπάνω επωάστηκαν για επιπλέον 6-24 ώρες σε φρέσκο ​​μέσο με δεικνυόμενες συγκεντρώσεις σισπλατίνης (για SGC7901-διάνυσμα και SGC7901-ATF4, 10 μg /ml? Για SGC7901 /ADR- SCR και SGC7901 /ADR-siATF4, 20 μg /ml). Κατά το χρόνο που υποδεικνύεται, τα εκχυλίσματα πρωτεΐνης συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδος για κασπάση-3 (μη διασπασμένο και διασπάται μορφών). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Η

Για να διερευνηθεί αν ATF4 υπερέκφραση είναι επαρκής για να επάγει ένα φαινότυπο MDR σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα,

ATF4

cDNA έκφρασης σταθερά επιμολυσμένα σε SGC7901 και AGS κύτταρα. Πρώτον, η ευαισθησία CDDP ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. Όπως φαίνεται από τον ποσοτικό προσδιορισμό του ποσοτικού προσδιορισμού σχηματισμού αποικίας, ATF4 υπερέκφραση οδήγησε σε σχεδόν 3-φορές αύξηση του αριθμού των αποικιών σε σύγκριση με τα κενά κελιά φορέα που εκφράζουν (Εικ. 1Β). προσδιορισμοί ΜΤΤ έδειξαν επίσης ότι το IC

50 τιμές SGC7901-ATF4 για ADR, VCR, CDDP, και 5-FU ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τα κενά κελιά φορέα επιμολυσμένα (Εικ. 1D).

Όπως τα επίπεδα ATF4 αυξημένα σε MDR γαστρικά καρκινικά κύτταρα, έχουμε περαιτέρω ήθελε να καθοριστεί αν ATF4 στόχευση θα μπορούσε εκ νέου ευαισθητοποίηση των κυτταρικών σειρών MDR. Knockdown του

ATF4 από

siRNA στα κύτταρα SGC7901 /ADR και SGC7901 /VCR οδήγησε σε 2- έως 3-φορές μείωση του αριθμού των κυττάρων όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με CDDP (Εικ. 1 C). Δεδομένα στο Σχ. 1Ε δείχνουν επίσης ότι τα κάτω ρύθμιση

ATF4

αντιστρέφει σημαντικά την αντίσταση των κυττάρων SGC7901 /ADR σε απόκριση στη χημειοθεραπεία.

Καθώς η αναστολή της απόπτωσης είναι ένας από τους σημαντικούς μηχανισμούς του MDR, μπορούμε επίσης διερευνήθηκε η ικανότητα των κυττάρων SGC7901 /ADR επιμολυσμένα με το ειδικό

ATF4

siRNA να υποβληθούν σε CDDP-επαγόμενη απόπτωση με χρώση και κατάτμηση του DNA δοκιμασίες Hoechst. Θεραπεία της SGC7901-ATF4 και SGC7901 κύτταρα /ADR-SCR με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις CDDP για 36 ώρες δεν προκάλεσε καμία απόπτωση, όπως εκτιμάται από την Hoechst πυρηνική χρώση (Εικ. 1 F) και δοκιμασίες κατάτμησης DNA (Σχ. 1G). Σε αντίθεση, SGC7901-διάνυσμα και SGC7901 /ADR-siATF4 κύτταρα εμφανίζονται σημαντικά την απόπτωση, με τη συχνότερη εμφάνιση των συνοπτικών και κατακερματισμένη πυρήνες και το σχηματισμό σκάλα του DNA. Επιπλέον, πιο προφανής διάσπαση της procaspase-3 παρατηρήθηκε μετά την αγωγή με CDDP σε SGC7901-διάνυσμα και SGC7901 κύτταρα /ADR-siATF4 σε σύγκριση με κύτταρα SGC7901-ATF4 και SGC7901 /ADR-SCR, αντιστοίχως (Εικ. 1).

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ATF4 προσδίδει ένα φαινότυπο MDR στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα και ότι η στόχευση ATF4 παρέχει μια μέθοδο ευαισθητοποίησης κυττάρων ανθεκτικών σε χημικές επεξεργασίες.

ATF4 up-ρυθμίζει την έκφραση του SIRT1, MDR1 , Bcl-2, και Bax σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα

Προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει ότι τα κύτταρα που υπερεκφράζουν SIRT1 εμφανίζεται μειωμένη ευαισθησία στη χημειοθεραπεία με πολλαπλούς μηχανισμούς [18], [19], [20], [21]. Είχαμε την περιέργεια να καθοριστεί εάν

SIRT1

, το οποίο είναι ένα γονίδιο σχετίζονται με το άγχος κρίσιμη για την ανάπτυξη MDR, θα μπορούσε να είναι η προς τα κάτω στόχος του ATF4 υπεύθυνος για τη μεσολάβηση ATF4 προκαλούμενη MDR σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

επίπεδα SIRT1 στην LV-φορέα και LV-ATF4 σταθερά επιμολυσμένα SGC7901 κύτταρα αναλύθηκαν με qPCR και κηλίδα Western. Η υπερέκφραση του ATF4 συσχετίστηκε με αυξημένη έκφραση SIRT1 τόσο στο μεταγραφικό (Σχ. 2Α, αριστερά) και τα επίπεδα της μεταφράσεως (Σχ. 2Β, αριστερά). Σε αντίθεση, siRNA knockdown του

ATF4

σε κύτταρα SGC7901 /ADR ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της ενδογενούς

SIRT1

έκφραση (Σχ. 2Α και 2Β, δεξιά). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ATF4 up-ρυθμίζει

SIRT1

έκφραση στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

(Α) επίπεδα mRNA της SIRT1 σε σταθερά επιμολυσμένα SGC7901 κυτταρικές σειρές LV-φορέα και LV-ATF4 (αριστερά) και LV-SCR και LV-siATF4 σταθερά επιμολυσμένα SGC7901 /κύτταρα ADR (δεξιά) υποβλήθηκαν σε qPCR. GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικός έλεγχος. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. λύματα (Β) Cell από κύτταρα στο τμήμα Α και των αντίστοιχων ομολόγων τους μη επεξεργασμένο (NC) στυπώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Η

Για να διερευνηθούν περαιτέρω οι μοριακοί μηχανισμοί που εμπλέκονται στην ATF4 σχετίζονται MDR του γαστρικού καρκίνου, εξετάσαμε επίσης, MRP, Bcl-2, και Βαχ επίπεδα έκφρασης MDR1 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν παραπάνω. Όπως φαίνεται στο Σχ. 2Β, ATF4-ικανοί κύτταρα εξέφρασαν περισσότερο MDR1 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Εν τω μεταξύ, καμία εμφανής διαφορά στην έκφραση MRP βρέθηκε σε οποιαδήποτε από αυτές τις κυτταρικές σειρές. Είναι ενδιαφέρον ότι, και τα δύο επίπεδα έκφρασης Bcl-2 και Bax ήταν πάνω ρυθμισμένα σε ATF4-καλά κύτταρα, σε σύγκριση με τις κυτταρικές ελέγχου γραμμές, ενώ η έκφραση του Bax έδειξε μόνο μικρές αλλαγές, που υποδεικνύει ότι η προς τα άνω ρύθμιση της Bcl-2 για να Βαχ αναλογία θα μπορούσε να καταστείλει το φάρμακο απόπτωση στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα ATF4-υπερεκφράζουν.

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ATF4 προωθεί MDR ικανότητα των γαστρικών καρκινικών κυττάρων μέσω πολλαπλών μηχανισμών.

ATF4 διαενεργοποιεί δραστηριότητα SIRT1 υποκινητή και συνδέεται άμεσα με τον υποκινητή SIRT1

για να προσδιορίσετε αν μεσολαβεί ATF4

SIRT1

μεταγραφή του γονιδίου, τα κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με 1,2 kb

SIRT1

πλασμίδιο ανταποκριτή υποκινητή και το

ATF4

πλασμίδιο έκφρασης. Η δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης έδειξε ότι η

SIRT1

δραστηριότητα υποκινητή ήταν αξιοσημείωτα ενεργοποιείται από ATF4 με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 3Α).

(Α) Κύτταρα 293Τ συν-επιμολύνθηκαν με τις 1.2 kb

SIRT1

πλασμίδιο ανταποκριτή υποκινητή και το

ATF4

πλασμίδιο έκφρασης. Μετά από 48 ώρες, δοκιμασία λουσιφεράσης χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει το

SIRT1

δραστηριότητα υποκινητή. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. (Β) Μία σχηματική αναπαράσταση του γονιδίου SIRT1 υποκινητή της ανθρώπινης δείχνοντας τις θέσεις των RT-PCR εναύσματα για ανάλυση chip. (C) Δοκιμασία τσιπ που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση της άμεσης δέσμευσης ATF4 στο

SIRT1

υποκινητή. κύτταρα SGC7901-ATF4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ChIP χρησιμοποιώντας αντι-ATF4 αντισώματος. A1 αντιπροσωπεύουν την υποτιθέμενη θέση δέσμευσης άπω και Α2 αντιπροσωπεύουν την υποτιθέμενη εγγύς θέση πρόσδεσης. Οι εκκινητές υποκινητή Εθνικές Λέσχες χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός έλεγχος, και εκκινητές GAPDH χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικός έλεγχος.

Η

Σε μια προσπάθεια να αποκτήσουν ειδική γνώση των μηχανισμών του

SIRT1

επαγωγή, εξετάσαμε τις πιθανές οδούς επαγωγής από ATF4. Με την ανάλυση της 5′-πλευρικής αλληλουχίας του

SIRT1

γονίδιο με λογισμικά βιοπληροφορική (Tfsitescan υπηρεσία, TESS, και Genomatix), δύο θέσεις πρόσδεσης ATF4 υποθετικό εντοπίστηκαν εντός της bp περιοχή -950 έως -600 του

SIRT1

υποκινητή (Σχ. 3Β).

Για να διαπιστώσετε εάν

SIRT1

αποτελεί άμεσο στόχο ATF4, τσιπ με το αντίσωμα ATF4 χρησιμοποιώντας SGC7901-ATF4 κύτταρα παρουσίασαν εμπλουτισμό των δύο περιοχές εντός του

SIRT1

περιοχή του υποκινητή δέσμευσης, υποδεικνύοντας ότι το RNA και η επακόλουθη επίπεδο πρωτεΐνης αυξήσεις των

SIRT1

σε ATF4 εκφράζουν κυτταρικές σειρές είναι πιθανόν να οφείλεται σε μια άμεση αλληλεπίδραση της ATF4 με το

SIRT1

γονίδιο υποκινητή (Σχ. 3C).

για να ερευνηθεί ο ρόλος των δύο θέσεων σύνδεσης ATF4 στη ρύθμιση SIRT1 μετενεργοποίησης, τοποκατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση χρησιμοποιήθηκε για την μετάλλαξη αυτών των θέσεων. δοκιμασία λουσιφεράσης ανταποκριτή έδειξε ότι είτε μεταλλάσσοντας την θέση δέσμευσης 1 ή 2 θέση δέσμευσης μείωσε τη δραστηριότητα SIRT1 υποκινητή επάγεται από ATF4. Επιπλέον, η μετάλλαξη και των δύο θέσεων δέσμευσης καταργήσει τη δραστηριότητα SIRT1 υποκινητή. Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι οι θέσεις σύνδεσης τόσο ATF4 εμπλέκονται στην τρανσενεργοποίηση του υποκινητή SIRT1 (Εικ. S1).

Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι SIRT1 είναι ένας άμεσος μεταγραφικός στόχος του ATF4.

SIRT1

αναστολή από siRNA αντιστρέφει εν μέρει τον φαινότυπο MDR των γαστρικών καρκινικών κυττάρων ATF4-υπερεκφράζουν

Ο προσδιορισμός των ATF4 μεσολάβηση

επίπεδο έκφρασης SIRT1

αυξήσεις του γαστρικού καρκίνου κύτταρα, οδήγησε μας να αναλύσουμε το ρόλο αυτού του μονοπατιού σε γαστρικό MDR καρκίνο. Για να αντιμετωπιστεί αυτό, συγκρίναμε το

in vitro

ευαισθησία φαρμάκου σε ATF4 σταθερά επιμολυσμένα γαστρικά καρκινικά κύτταρα μετά την επιμόλυνση των

SIRT1

siRNA ή ομελέτα siRNA με σχηματισμό αποικιών και προσδιορισμούς ΜΤΤ. Νοκ ντάουν του

SIRT1 από

siRNA σε SGC7901-ATF4 κύτταρα οδήγησε σε & gt? Μείωση κατά 40% του αριθμού των αποικιών, όταν χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με CDDP (Εικ. 4Α, άνω). Αυτό το αποτέλεσμα παρατηρήθηκε επίσης σε κύτταρα AGS-ATF4 (Εικ. 4Α, χαμηλότερα). Επιπλέον, τα στοιχεία από την δοκιμασία ΜΤΤ έδειξαν επίσης ότι η εξουδετέρωση του

SIRT1

μπορούσε εκ νέου να ευαισθητοποιήσει SGC7901-ATF4 κυττάρων σε χημικά φάρμακα, αλλά αυτό δεν συνέβη σε κωδικοποιημένα siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 4Β).

(Α) SGC7901-ATF4 και AGS-ATF4 κύτταρα επιμολύνθηκαν με μπερδεμένο siRNA (SCR) ή SIRT1 siRNA (siSIRT1). Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα, οι γραμμές κυττάρων υπέστησαν αγωγή συνεχώς είτε με 0 ή 0,25 μg /ml σισπλατίνης για 14 d? μέσα μαζικής ενημέρωσης ήταν αλλάζονται κάθε 3 ημέρες. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν εις τριπλούν, και το πείραμα επαναλήφθηκε τρεις φορές. Αντιπροσωπευτικά πηγάδια εμφανίζονται. Γραφήματα παρέχουν μέσο ποσοτικοποίησης ως ποσοστό των μη επεξεργασμένο κυττάρων. Ένθετο, η σχετική πρωτεΐνη SIRT1 έκφρασης με στύπωμα Western. (Β) SGC7901-ATF4 κύτταρα επιμολύνθηκαν με μπερδεμένο siRNA (SCR) ή SIRT1 siRNA (siSIRT1). Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα, και οι δύο κυτταρικές γραμμές υπέστησαν κατεργασία με τις υποδεικνυόμενες δόσεις διαφόρων φαρμάκων για επιπλέον 72 ώρες.

In vitro

ευαισθησία φαρμάκου ελέγχθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για να προσδιορίσετε αν SIRT1 προστατεύει τα κύτταρα από CDDP απόπτωση, κύτταρα SGC7901-ATF4 επιμολυσμένα με

SIRT1

siRNA ή ομελέτα siRNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με CDDP και επισημαίνονται με Annexin V και PI. Τα αποπτωτικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με την επισήμανση αννεξίνης V. Η αποπτωτική ποσοστό SIRT1 siRNA επιμολυσμένα SGC7901-ATF4 κυττάρων ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου (Σχ. 5Α, 72,8% έναντι 25,9%). Η εμφάνιση των συμπυκνωμένων και κατακερματισμένων πυρήνων ήταν επίσης αυξημένη σε SIRT1 siRNA επιμολυσμένα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Σχ. 5Β). Επιπλέον, η διάσπαση της procaspase-3 παρατηρήθηκε ήδη 12 ώρες μετά την αγωγή με 10 μg /ml CDDP σε SIRT1 siRNA επιμολυσμένα SGC7901-ATF4 κύτταρα, αλλά όχι σε κωδικοποιημένα siRNA επεξεργασμένα κύτταρα, ακόμη και μετά από 24 ώρες θεραπείας CDDP (Σχ. 5C ). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η υπερέκφραση SIRT1 καταστέλλει CDDP απόπτωση.

(Α) SGC7901-ATF4 κύτταρα επιμολύνθηκαν με μπερδεμένο siRNA (SCR) ή SIRT1 siRNA (siSIRT1). Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα, τα κύτταρα επωάστηκαν για επιπλέον 36 ώρες σε φρέσκο ​​μέσο απουσία ή παρουσία σισπλατίνης σε 5 μg /ml. Μετά την επεξεργασία φαρμάκου, τα κύτταρα σημάνθηκαν με Annexin V και ΡΙ. Το πρότυπο κατανομής των ζωντανών και αποπτωτικών κυττάρων προσδιορίσθηκε με ανάλυση FACS. (Β) SGC7901-ATF4 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον ίδιο τρόπο στο τμήμα Α και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 5 μg /ml σισπλατίνης για 36 ώρες. Στη συνέχεια, Hoechst 33258 πυρηνική χρώση διεξήχθη για την ανίχνευση αποπτωτικών κυττάρων. (C) SGC7901-ATF4 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον ίδιο τρόπο στο τμήμα Α και επωάστηκαν για επιπλέον 6-24 ώρες σε φρέσκο ​​μέσο με 10 μg /ml σισπλατίνης. Κατά το χρόνο που υποδεικνύεται, τα εκχυλίσματα πρωτεΐνης συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση ανοσοκηλίδος για κασπάση-3 (μη διασπασμένο και διασπάται μορφών). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. (D) SGC7901-ATF4 κύτταρα επιμολύνθηκαν με τον ίδιο τρόπο στο τμήμα Α Εβδομήντα δύο ώρες αργότερα, λύματα κυττάρων κηλιδώθηκαν με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος.

Η

Για να μελετηθεί η επίδραση της προς τα κάτω ρύθμιση SIRT1 με siRNA επί σχετίζεται MDR μόρια, εξετάσαμε τα επίπεδα έκφρασης MDR1, MRP, Bcl-2, Βαχ και στα κύτταρα SGC7901-ATF4 μετά την επιμόλυνση με SIRT1 siRNA ή ομελέτα siRNA. Κάτω ρύθμιση των MDR1 παρατηρήθηκε στα SIRT1 siRNA-κατεργασμένα κύτταρα (Εικ. 5D) σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Σε αντίθεση, καμία προφανής διαφορά του MRP, Bcl-2, και τα επίπεδα έκφρασης Bax βρέθηκαν μεταξύ των δειγμάτων.

Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι η SIRT1 μεσολαβεί στην επαγόμενη από ATF4 επίδραση MDR σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

η αναστολή της δραστηριότητας SIRT1 νέου ευαισθητοποιεί ATF4 επιμολυσμένα κύτταρα με DNA-επιζήμια παράγοντες

για να παρέχουν αποδείξεις ότι καταλυτική δράση SIRT1 είναι επίσης υπεύθυνη για τις ATF4 που προκαλείται από τα κύτταρα MDR, SGC7901-ATF4 προκατεργάστηκαν με EX-527 , μία νέα, ισχυρός και ειδικός αναστολέας μικρού μορίου της SIRT1, και ακολουθείται από κατεργασία με διαφορετικές χημικές φάρμακα. Πρώτον, έχουμε καθορίσει τη βασική κυτταροτοξικότητα της EX-527 στο LV-φορέα και LV-ATF4 σταθερά επιμολυσμένα SGC7901 κύτταρα. Η δοκιμασία ΜΤΤ αποκάλυψε ότι ΕΧ-527 σε συγκεντρώσεις έως 10 μΜ δεν αναστέλλει, αλλά μάλλον αυξήθηκε ελαφρώς, η βιωσιμότητα και των δύο κυτταρικών σειρών (Σχ. 6Α). Στη συνέχεια, εξετάσαμε SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, Bcl-2, και τα επίπεδα έκφρασης Bax μετά από επώαση 24 ωρών με ή χωρίς τις υποδεικνυόμενες δόσεις ΕΧ-527 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν παραπάνω. Μόνο η έκφραση του MDR1 ήταν κάτω-ρυθμίζονται από EX-527 σε συγκέντρωση-εξαρτώμενο τρόπο (εικ. 6Β). Στη συνέχεια προεπωάζεται SGC7901-ATF4 κυττάρων με όχημα ή ΕΧ-527 (0.5, 1, 2, 4, και 10 μΜ) για 24 ώρες και στη συνέχεια CDDP- και 5-FU μεσολάβηση κυτταρικό θάνατο παρακολουθούνταν. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C, ΕΧ-527 ενισχύεται σημαντικά την κυτταροτοξικότητα των δύο φαρμάκων με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Προσδιορίσαμε επίσης την πιθανή συνεργιστική δράση των ΕΧ-527 σε διαφορετικές δόσεις CDDP- και 5-FU μεσολάβηση αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κύτταρα SGC7901-ATF4. Όπως ήταν αναμενόμενο, 10 μΜ EX-527 είναι επαρκής για να ενισχύσει την κυτταροτοξικότητα των δύο φαρμάκων (Εικ. 6D).

(Α) κυτταρικές σειρές σταθερά διαμολυσμένες SGC7901 LV-διάνυσμα και LV-ATF4 επωάστηκαν με ή χωρίς την ενδεικνυόμενες δόσεις ΕΧ-527. Ενενήντα έξι ώρες αργότερα, οι κυτταρικές βιωσιμότητες προσδιορίστηκαν με ανάλυση ΜΤΤ. (Β) σταθερά επιμολυσμένες κυτταρικές σειρές SGC7901 στο τμήμα Α επωάστηκαν με ή χωρίς ΕΧ-527 (1-10 μΜ) για 24 ώρες, και η συνολική κυτταρολύματα υποβλήθηκαν σε ανοσοκηλίδωση με τα υποδεικνυόμενα αντισώματα. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. (C) SGC7901-ATF4 κύτταρα προεπωάστηκαν με τις υποδεικνυόμενες δόσεις ΕΧ-527 για 24 ώρες. Στη συνέχεια SGC7901-διάνυσμα και SGC7901-ATF4 κύτταρα εκτέθηκαν σε σισπλατίνη (1 μg /ml) ή 5-φθοριοουρακίλη (1,25 μg /ml) για επιπλέον 72 ώρες. βιωσιμότητες κυττάρου προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ. (D) SGC7901-ATF4 κύτταρα προεπωάστηκαν με ή χωρίς ΕΧ-527 (10 μΜ) για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα εκτέθηκαν στις υποδεικνυόμενες δόσεις σισπλατίνης ή 5-φθοριοουρακίλη για επιπλέον 72 ώρες. βιωσιμότητες κυττάρου προσδιορίζεται με δοκιμασία ΜΤΤ. Όλα τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν το μέσο ± S.D. τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Γραφήματα παρέχουν μέσος ποσοτικοποίηση ως ποσοστό των μη επεξεργασμένο κυττάρων.

Η

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η δραστηριότητα SIRT1 παίζει επίσης έναν κρίσιμο ρόλο στην ATF4 επαγόμενη γαστρικού MDR καρκίνο και ο ρόλος αυτός θα μπορούσε να διαμεσολαβείται εν μέρει μέσω της έκφρασης MDR1 .

Συζήτηση

MDR αποτελεί σημαντική κλινική προκλήσεις για την αποτελεσματική χημειοθεραπεία πολλών ανθρώπινων κακοηθειών. Οι μηχανισμοί με τους οποίους τα κύτταρα αποκτούν ανθεκτικότητα είναι πολλαπλές και σύνθετες, τόσο πιο εκτεταμένη κατανόηση από αυτούς, καθώς και τον εντοπισμό νέων μηχανισμών για χημειοαντίσταση, θα είναι ιδιαίτερα χρήσιμη για την παροχή καλύτερων θεραπευτικών επιλογών. Η μελέτη αυτή είναι η πρώτη αναφορά ότι τα υψηλά επίπεδα της ATF4, κοινώς δει σε καρκινικά κύτταρα κάτω από στρεσογόνες συνθήκες, παρέχει γαστρικό καρκινικά κύτταρα με φαινότυπο MDR, και προσδιορίζει ότι αυτό το αποτέλεσμα προκαλείται εν μέρει από μετενεργοποίηση έκφρασης SIRT1.

ATF4

και

SIRT1

είναι εξελικτικά συντηρημένες γονίδια αντίδραση στο στρες που εμπλέκονται σε ένα ευρύ φάσμα βιολογικών διεργασιών, πολλά από τα οποία είναι σωτήρια για την ομοιόσταση και κυτταρική προστασία [22], [23], [ ,,,0],24]. Και οι δύο από αυτά τα γονίδια που επάγεται σε απόκριση σε μία ποικιλία τάσεων, συμπεριλαμβανομένων στέρηση οξυγόνου (υποξία /ανοξία), οξειδωτικό στρες, βλάβη του DNA, θρεπτική στέρηση, και χημειοτοξικές στρες. Levenson VV

et al.

Αναφέρθηκε για πρώτη φορά ότι οι αλλαγές στην έκφραση του ATF4 θα μπορούσε να διαδραματίσει ένα ρόλο στην πλειοτροπική αντίσταση σε διαφορετικές κατηγορίες φαρμάκων DNA στόχευσης [16]. Κατά τα τελευταία έτη, διάφορες μελέτες διαπίστωσαν ότι ATF4 εμπλέκεται άμεσα ή έμμεσα στην ανάπτυξη αντοχής φαρμάκου μέσω αυτοφαγία, η γλουταθειόνη-εξαρτώμενο σύστημα οξειδοαναγωγής, και επιδιόρθωση της βλάβης του DNA [11], [12], [13], [14] , [15], [16], [17], [25], [26]. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η προστατευτική ικανότητα του ATF4 μεσολαβεί πράγματι ένα φαινότυπο MDR σε ATF4 υπερεκφράζει κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου σε απόκριση σε χημειοθεραπεία. Τα ευρήματά μας δείχνουν σαφώς ότι η υπερέκφραση της ATF4 στα γαστρικά καρκινικά κύτταρα συσχετίστηκε με μεγαλύτερη αντίσταση, ενώ νοκ ντάουν της ATF4 που προκαλείται εκ νέου ευαισθητοποίηση. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ATF4 είναι πιθανώς ένας σημαντικός μεσολαβητής κατάντη της αντίστασης που προκαλείται από πολλαπλούς μηχανισμούς και επομένως είναι ένας πολύτιμος θεραπευτικός στόχος. Ωστόσο, ως ένας από τους σημαντικότερους μεταγραφική μεσολαβητές του ISR που ενεργοποιεί μια ποικιλία γονιδίων στόχων που προάγουν αποκατάσταση της ομοιόστασης, ATF4 μπορεί επίσης να μεσολαβήσει αντίσταση από άλλους μηχανισμούς. Στη μελέτη μας, SIRT1 βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα που υπερεκφράζουν ATF4-σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα φορέα. Σε αντίθεση, knockdown του

ATF4

με ATF4 ειδικό siRNA οδήγησε σε μια ρύθμιση προς τα κάτω της SIRT1 στην αντιμετώπιση της MDR γαστρικά καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η SIRT1 θα μπορούσε να είναι ένας μεταγενέστερος μεσολαβητής ATF4 που προκαλείται από καρκίνο του στομάχου MDR.

Ως μέλος της ATF υποοικογένεια του φερμουάρ λευκίνης βασικής περιοχής (bZIP) μεταγραφικούς παράγοντες [22], ATF4 έχει η δυνατότητα να δρουν είτε ως μεταγραφικός ενεργοποιητής ή ένας μεταγραφικός καταστολέας μέσω ATF ή cAMP στοιχείο απόκρισης (CRE) θέσεις πρόσδεσης [22]. Η θέση σύνδεσης συναίνεσης για την ATF ορίστηκε ως TGACGT (C /A) (G /A) [27], η οποία είναι μια αλληλουχία πανομοιότυπη με την CRE συναίνεση στοιχείο (TGACGTCA) [28]. Επίσης, η άκρως συντηρημένη πυρήνας μοτίβο – ACGT – στις περισσότερες CREs [29] μπορεί να συνδεθεί με διάφορους παράγοντες bZIP, ανάλογα με τις πλευρικές βάσεις του πυρήνα μοτίβο [22], [30], [31]. Στη μελέτη μας δύο υποθετικές θέσεις πρόσδεσης ΑΤΡ-CRE βρέθηκαν στα 1,2 kb

SIRT1

περιοχή προαγωγέα, και ATF4 άμεσα ενεργοποιημένο

SIRT1

μεταγραφή μέσω δέσμευσης των δύο στοιχείων σύνδεσης. Ωστόσο, το πώς οι δύο θέσεις πρόσδεσης παίζουν τους ρόλους τους σύμφωνα με τους λεπτομερείς συνθήκες στρες παραμένει άγνωστη και απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση.

θηλαστικών

SIRT1

είναι το πιο κοντινό ομόλογο της μαγιάς

Sir2

και η πιο εκτεταμένα μελετηθεί μέλος της οικογένειας SIRT. Είναι σε μεγάλο βαθμό εμπλέκεται στη ρύθμιση κυτταρικών διαδικασιών που καθορίζουν τη μακροζωία, συμπεριλαμβανομένων των αντι-απόπτωση, νευρωνική προστασία και την κυτταρική γήρανση ή τη γήρανση [32]. Πρόσφατα, ένας αυξανόμενος αριθμός μελετών έχουν ενοχοποιήσει αυξημένη έκφραση του SIRT1 με αντίσταση στη χημειοθεραπεία και ιονίζουσες ακτινοβολίες [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36]. Για παράδειγμα, η υπερέκφραση SIRT1 έχει βρεθεί σε ανθεκτικά σε φάρμακο νευροβλάστωμα, οστεοσάρκωμα, μαστικούς, των ωοθηκών, του προστάτη, του παχέος εντέρου, και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα σε σύγκριση με τους ομολόγους τους ευαίσθητα σε φάρμακο. Όλα αυτά τα ανθεκτικά στα φάρμακα επιδράσεις της SIRT1 θα μπορούσε ενδεχομένως να οφείλεται σε αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα του [37], [38] και αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων [39]. Τέλος, θα μπορούσαμε να προβλέψουμε ότι, αν SIRT1 εμπλέκεται στην ATF4 προκαλούμενη MDR, η αναστολή της SIRT1 θα πρέπει να επηρεάζει την ευαισθησία των κυττάρων που υπερεκφράζουν ATF4 σε απόκριση σε χημειοθεραπεία. Όπως ήταν αναμενόμενο, τόσο siRNA και φαρμακολογική αναστολή της SIRT1 θα μπορούσε εκ νέου να ευαισθητοποιήσει κύτταρα ATF4-υπερεκφράζουν σε χημικά φάρμακα. Επιπλέον, η μελέτη μας δείχνει ότι SIRT1 προστατεύει τα κύτταρα από τον θάνατο εν μέρει μέσω ενός αντι-αποπτωτικό αποτέλεσμα.

Έχει αναφερθεί ότι MDR1 ήταν ρυθμισμένη σε κύτταρα με αυξημένη έκφραση SIRT1 [18], [36]. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε επίσης ότι MDR1 είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε κύτταρα ATF4 υπερεκφράζουν και knockdown του SIRT1 με SIRT1 ειδικό siRNA ή αναστέλλοντας τη δράση του με ΕΧ-527 θα μπορούσε να οδηγήσει σε μειορύθμιση MDR1, η οποία είναι συνεπής με ένα φάρμακο ανθεκτικών ρόλο SIRT1. Ωστόσο, η αναλογία /Bax Bcl-2, η οποία ήταν επάνω ρυθμισμένη στα κύτταρα ATF4 υπερεκφράζουν, ήταν SIRT1-ανεξάρτητη, υποδηλώνοντας ότι SIRT1-ανεξάρτητοι μηχανισμοί παίζουν επίσης ένα ρόλο στην ATF4 προκαλούμενη MDR σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα.

συνοπτικά, έχουμε αποδείξει ότι ATF4 προσδίδει ένα φαινότυπο MDR σε γαστρική καρκινικά κύτταρα, και αυτό το αποτέλεσμα εν μέρει μεσολαβείται από μετενεργοποίηση του SIRT1 υπερέκφραση. Επιπλέον, ATF4 είναι ένα έγκυρο στόχο σε γαστρικών όγκων ανθεκτικών στα φάρμακα, και θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη η ανάπτυξη αποτελεσματικών αναστολέων του ATF4 στο μέλλον. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν νέες γνώσεις για τον ρόλο των ATF4 στον έλεγχο της έκφρασης SIRT1 και σε χαρακτηριστικά στρες αντοχή του στην ογκογένεση και τη χημειοθεραπεία. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό για την κλινική εξέταση, καθώς ATF4 μπορεί να ρυθμίζεται προς τα πάνω από τη στέρηση οξυγόνου, το οξειδωτικό στρες, θρεπτική στέρηση και σχεδόν όλες τις δυσμενείς στρεσογόνους σε ένα μικροπεριβάλλον του όγκου, το οποίο θα μπορούσε να καταληφθεί από τα καρκινικά κύτταρα για να αποφύγουν την αναστολή του πολλαπλασιασμού και κυτταρικού θανάτου σε απόκριση στη χημειοθεραπεία. Ως εκ τούτου, οι παρεμβάσεις στηρίζεται σε διατάραξη του στρες που προκαλείται από την έκφραση ATF4 σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να είναι αποτελεσματική στην παράκαμψη ή την αναστροφή της αντίστασης στα φάρμακα για τον καρκίνο του στομάχου.

Υλικά και Μέθοδοι

Για αναλυτικές μεθόδους, ανατρέξτε Κείμενο S1 .

κυτταρικής καλλιέργειας και αντιδραστηρίων

το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα στομάχου κυτταρικές σειρές SGC7901 (που λαμβάνεται από την Ακαδημία Στρατιωτικής Ιατρικής Επιστήμης, Πεκίνο, Κίνα) και η MDR παραλλαγές, SGC7901 /ADR και SGC7901 /VCR (ορίζεται και διατηρείται στο εργαστήριο μας), και AGS (που λαμβάνεται από το κύτταρο τράπεζα της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών, Σαγκάη, Κίνα) καλλιεργήθηκαν σε RPMI-1640 συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Hyclone) και πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη. 293Τ κύτταρα (επίσης λαμβάνεται από την κυτταρική τράπεζα της κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών) καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Για να διατηρηθεί το MDR φαινότυπο, αδριαμυκίνη (με τελική συγκέντρωση 0.5 μg /ml) και βινκριστίνη (με τελική συγκέντρωση 1 μg /ml) προστέθηκαν στα μέσα καλλιέργειας για SGC7901 /ADR και κύτταρα SGC7901 /VCR, αντίστοιχα. ΕΧ-527 (Sigma) διαλύθηκε σε DMSO στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Αδριαμυκίνη (ADR), βινκριστίνη (VCR), σισπλατίνη (CDDP), και 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) διαλύθηκαν σε φυσιολογικό ορό σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις.

Κυττάρων επιμόλυνση και σταθερές κυτταρικές σειρές

Το ανθρώπινο

ATF4

πλασμίδιο έκφρασης (ρΟΜν5-ATF4) παρασχέθηκε ευγενώς από τον καθηγητή Amy S. Lee [25]. Φορέα λεντοϊού που κωδικοποιεί siRNA ειδικά για

ATF4

και siRNA ελέγχου δημιουργήθηκαν με τη χρήση του PLKO.1-TRC (Addgene) και ορίστηκαν ως LV-siATF4 και ελέγχου LV-SCR, αντιστοίχως.