Αφηρημένο

Ο ρόλος των microRNAs σε καρκίνωμα πνεύμονα μικρών κυττάρων (SCLC) είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη. miR-34a είναι γνωστή ως ρ53 ρυθμίζεται ογκοκατασταλτικό microRNA σε πολλούς τύπους καρκίνου. Ωστόσο, οι θεραπευτικές επιπτώσεις του δεν έχει ποτέ μελετηθεί σε SCLC, έναν τύπο καρκίνου με συχνή δυσλειτουργία του ρ53. Μελετήσαμε την έκφραση ενός πάνελ 7 microRNAs (miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155, και αφήστε-7α) σε 31 SCLC όγκους, 14 SCLC κυτταρικές σειρές, και 26 κυττάρων NSCLC γραμμές. Παρατηρήσαμε σημαντικά χαμηλότερο miR-21, miR-29b, και η έκφραση του miR-34a σε κυτταρικές σειρές SCLC από ό, τι σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Η έκφραση των 7 microRNAs ήταν άσχετη με κλινικά χαρακτηριστικά SCLC ασθενών και δεν ήταν ούτε προγνωστικό στην διάρκεια της συνολικής επιβίωσης ή επιβίωση χωρίς εξέλιξη ούτε πρόβλεψης της ανταπόκρισης στη θεραπεία. Η υπερέκφραση ή προς τα κάτω ρύθμιση του miR-34a δεν επηρέασε SCLC βιωσιμότητα των κυττάρων. Η έκφραση αυτών των 7 microRNAs επίσης δεν προέβλεψαν

in vitro

ευαισθησία στη σισπλατίνη ή ετοποσίδη σε SCLC κυτταρικές σειρές. Η υπερέκφραση ή προς τα κάτω ρύθμιση του miR-34a δεν επηρέασε την ευαισθησία στη σισπλατίνη ή ετοποσίδη σε SCLC κυτταρικές σειρές. Σε αντίθεση με αρνητική ρύθμιση των γονιδίων στόχων miR-34a cMet και ΑχΙ από υπερέκφραση του miR-34a σε κυτταρικές γραμμές NSCLC, η εγγενής έκφραση του cMet και ΑχΙ ήταν χαμηλή σε SCLC κυτταρικές γραμμές και δεν επηρεάστηκε από την υπερέκφραση του miR-34a. . Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η έκφραση των 7 επιλεγεί microRNAs δεν είναι προγνωστική σε SCLC ασθενείς, και miR-34a είναι άσχετη με την κακοήθη συμπεριφορά των SCLC κυττάρων και είναι απίθανο να είναι ένας θεραπευτικός στόχος

Παράθεση: Lee JH , Voortman J, Dingemans A-MC, Voeller DM, Pham Τ, Wang Υ, et al. (2011) microRNA έκφρασης και του κλινικού αποτελέσματος της μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 6 (6): e21300. doi: 10.1371 /journal.pone.0021300

Συντάκτης: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 8 Φλεβάρη 2011? Αποδεκτές: 25 Μαΐου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 22 Ιουνίου 2011

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας, το πρόγραμμα των τειχών Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου. Καμία πρόσθετη εξωτερική χρηματοδότηση ελήφθη για τη μελέτη αυτή. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

μικροκυτταρικού καρκίνου του πνεύμονα (SCLC) αντιπροσωπεύει περίπου το 10-20% των περιπτώσεων καρκίνου του πνεύμονα και είναι διαβόητη για την επιθετικότητα του και τα φτωχά ποσοστά επιβίωσης [1], [2]. Παρά τη μέτρια πρόοδο που επιτεύχθηκε στις δύο τελευταίες δεκαετίες, το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών SCLC εξακολουθεί να είναι πολύ κακή [2], [3]. Εν μέρει λόγω της έλλειψης επαρκούς μοριακού βιοδείκτες για την καθοδήγηση της θεραπείας του SCLC, τα κλινικά αποτελέσματα της μοριακής στοχευμένες θεραπείες όπως imatinib, gefitinib, bcl-2 αναστολείς και αναστολείς mTOR στη θεραπεία των SCLC ασθενών απογοητευτική [4].

έκφραση microRNA συσχετίζεται με βιολογικά χαρακτηριστικά του καρκίνου, όπως κυτταρική διαφοροποίηση, επιθετικότητα, εισβολή, αγγειογένεση και τη μεταστατική συμπεριφορά [5], [6], [7]. Για παράδειγμα, τα μέλη της οικογένειας miR-34, miR-34a, miR-34b, και miR-34c, είναι άμεσες μεταγραφική στόχοι της ρ53 και της έκφρασης τους προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε καρκινικές κυτταρικές σειρές [8]. miR-29b δρα ως καταστολέας των όγκων microRNA μέσω της αποκατάστασης της κανονικής πρότυπο μεθυλίωσης του DNA [9]. Κλινικά, microRNA προφίλ έχει αποδειχθεί για να βοηθήσει στη διάγνωση του καρκίνου, καθώς και πρόβλεψη της πρόγνωσης και θεραπείας απόκριση [6], [10]. Οι ρόλοι των microRNAs στη βιολογία του καρκίνου και πρόβλεψης πρόγνωση σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) έχουν μελετηθεί ευρέως. Αυξημένη miR-34a σχετίστηκε με λιγότερες υποτροπές σε μια μικρή αναδρομική μελέτη εκτομή των ασθενών με NSCLC [11]. Η υπερέκφραση του ας-7α, πιθανόν μέσω της καταστολής του ογκογονιδίου RAS [12], δείχθηκε ότι σχετίζεται με αυξημένη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με NSCLC [13], και ήταν επίσης μεταξύ των προστατευτικών προγνωστικούς παράγοντες πρόληψη της υποτροπής σε χειρουργικά NSCLC [14] . Η υπερέκφραση του «oncomirs» miR-21 και miR-155 δείχθηκε ότι σχετίζεται με μειωμένη συνολική επιβίωση σε ασθενείς με NSCLC [13], [15]. Υπάρχει μόνο λιγοστές δεδομένα σχετικά με τον ρόλο της έκφρασης microRNA σε SCLC, και η λειτουργία αρκετών καλά τεκμηριωμένες σχετίζονται με τον καρκίνο microRNAs σε άλλους τύπους καρκίνου δεν έχει ποτέ αντιμετωπιστεί σε SCLC. Για παράδειγμα, αν SCLC χαρακτηρίζεται από συχνές δυσλειτουργία p53 [16], το ρόλο του miR-34a, μια ρ53 ρυθμίζεται ογκοκατασταλτικό microRNA [8], [17], δεν έχει μελετηθεί σε SCLC.

απέδειξε πρόσφατα, χρησιμοποιώντας μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (PCR) -με βάση plateform, ότι τα προφίλ έκφρασης ενός πάνελ επτά σχετίζονται με τον καρκίνο microRNAs (miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, ΜΙΚ 155, και αφήστε-7α) δεν είναι ούτε έξυπνη ούτε προγνωστική σε ασθενείς με ΜΜΚΠ που λαμβάνουν με βάση την πλατίνα επικουρική χημειοθεραπεία [18]. Ωστόσο, στην εκτομή του καρκίνου του παγκρέατος με χρήση της ίδιας πάνελ microRNAs, δείξαμε ότι η χαμηλή έκφραση του miR-21 συσχετίστηκε με αυξημένη επιβίωση μετά επικουρική θεραπεία σε δύο ανεξάρτητες ομάδες ασθενών παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα [19], υποδηλώνοντας ότι η έκφραση των microRNAs και τους προγνωστικές και προγνωστική επιπτώσεις είναι πιθανό να είναι συγκεκριμένα του όγκου. Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε το ρόλο του microRNAs για την πρόβλεψη των δύο πρόγνωση και θεραπεία έκβαση σε SCLC χρησιμοποιώντας δείγματα ασθενών και κυτταρικές γραμμές SCLC. Μελετήσαμε περαιτέρω πώς η έκφραση του miR-34a επηρεάζει την κακοήθη συμπεριφορά των SCLC κυττάρων.

Αποτελέσματα

έκφραση microRNA στο SCLC όγκους και κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα

Ο Πίνακας 1 συνοψίζει τα χαρακτηριστικά κύρια ασθενών, καθώς και τον πίνακα S1 απεικονίζει την έκφραση microRNA σε σχέση με τις κλινικές μεταβλητές. Τάσεις παρατηρήθηκαν υπέρ της υψηλότερης έκφρασης ας-7a σε γυναίκες και σε νεότερους ασθενείς (p = 0,07 και 0,13 αντίστοιχα, από Wilcoxon τεστ Rank-Sum). Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ έκφρασης microRNAs και κλινικά χαρακτηριστικά. Συγκρίναμε την έκφραση των 7 microRNAs μεταξύ SCLC κυτταρικές σειρές και κυτταρικές σειρές NSCLC. Κάτω έκφραση του miR-21, miR-29b, και miR-34a βρέθηκε σε SCLC κυτταρικές γραμμές από ό, τι κυτταρικές σειρές NSCLC (ρ & lt? 0,001 για όλες τις τρεις microRNAs, Εικόνα S1), που είναι σε συμφωνία με μια προηγούμενη αναφορά [20] . Πραγματοποιήσαμε περαιτέρω

in situ υβριδισμού

του miR-34b σε SCLC δείγμα όγκου και παρατηρείται κυτταροπλασματική έκφραση του miR-34b και πυρηνική έκφραση της πυρηνισκικός RNA U6 όπως αναμενόταν (Εικόνα S2).

Η

microRNA δεν συσχετίζεται με την επιβίωση των ασθενών SCLC

Η διάμεση συνολική επιβίωση και η επιβίωση χωρίς εξέλιξη αυτής της σειράς μελέτης ήταν 49,1 και 35,7 εβδομάδες, αντίστοιχα. Όπως ήταν αναμενόμενο, μεγαλύτερη συνολική επιβίωση παρατηρήθηκε σε ασθενείς με SCLC που είχαν περιορισμένη ασθένεια και οι ασθενείς που πέτυχαν πλήρη ανταπόκριση μετά τη θεραπεία (Πίνακας 1 και Πίνακας S2). Μεταξύ των 7 microRNAs που μελετήθηκαν, δεν υπήρξε καμία διαφορά επιβίωση μεταξύ των ασθενών με υψηλή και χαμηλή έκφραση microRNA, που ορίζεται από τη διάμεση τιμή έκφρασης του κάθε microRNA σε δείγματα όγκου (Πίνακας 2). Αυτό ήταν αλήθεια σε ασθενείς δύο περιορισμένη και εκτεταμένη νόσο (Πίνακας S3).

Η

έκφραση της πρωτεΐνης p53 είναι άσχετη με miR-34a /b /c έκφραση σε SCLC όγκους

Όπως ΜΙΚ 34α, miR-34b, και miR-34c είναι άμεση μεταγραφική στόχοι της p53 [8] και bcl-2 είναι ένας στόχος του miR-34a [21], θα διερευνηθεί κατά πόσον η έκφραση p53 επηρεάζει την έκφραση του miR-34a /b /c και εάν η έκφραση Bcl-2 σχετίζεται με miR-34a. Χρησιμοποιώντας δείγματα από την ίδια ομάδα μελέτης, Dingemans

κ.ά.

έδειξαν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης του p53 είναι άσχετη με την επιβίωση των ασθενών SCLC και είναι άσχετη με πρωτεΐνη έκφραση του bcl-2, καθώς και [22]. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης του p53 σε SCLC όγκους ήταν άσχετη με την έκφραση του miR-34a, miR-34b, και miR-34c (Σχήμα S3A, Β, και Γ). Επιπλέον, η έκφραση του miR-34a ήταν άσχετη με την έκφραση του bcl-2 σε SCLC όγκους (Σχήμα S3D).

έκφραση του miR-34a δεν έχει σχέση με τη βιωσιμότητα του SCLC

in vitro

για να διερευνήσουν το ρόλο της έκφρασης microRNA στην κακοήθη συμπεριφορά των SCLC, εστιάσαμε στην miR-34a επειδή miR-34a αναφέρθηκε να είναι ένας προγνωστικός δείκτης επιβίωσης [11] και να είναι ένας από τους λίγους υποψηφίους για την αντικατάσταση microRNA θεραπεία σε NSCLC [23], [24]. Εμείς υπερεκφράζεται ή προς τα κάτω-ρυθμίζονται miR-34a σε SCLC κύτταρα. Χρησιμοποιώντας ένα Cy3-επισημασμένο πρόδρομο miR ή αναστολέα για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα μορφομετατροπής, βρήκαμε ότι 24 ώρες μετά την επιμόλυνση, η αποτελεσματικότητα επιμόλυνση των miR-προδρόμου ή αναστολέα σε κύτταρα ΝΟΙ-Η82 SCLC ήταν σχεδόν 100% (Εικόνα S4). αποτελεσματικότητα High διαμόλυνση παρατηρήθηκε επίσης σε NCI-H146, ΝΟΙ-N592, GLC4, Α549 και κύτταρα ΝΟΙ-Η1299 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Παρατηρήσαμε υψηλότερη ώριμη έκφραση miR-34a σε κύτταρα επιμολυσμένα με πρόδρομο miR-34a και κάτω ώριμη έκφραση miR-34a σε κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολέα miR-34a σε σύγκριση με κύτταρα επιμολυσμένα με πρόδρομο έλεγχο και αναστολέα, αντιστοίχως (Σχήμα 1Α). Ότι η υπερέκφραση του miR-34a προκαλεί G1 διακοπή σε αρκετές καρκινικές κυτταρικές γραμμές [8], G1 σύλληψης δεν παρατηρήθηκε σε NCI-H82 SCLC κυττάρων επιμολυσμένα με πρόδρομο miR-34a (Σχήμα 1Β). Προς τα κάτω ρύθμιση του miR-34a σε κύτταρα NCI-H146, η οποία εξέφρασε υψηλότερο επίπεδο miR-34a σε σύγκριση με το μέσο επίπεδο έκφρασης των 14 SCLC κυτταρικές σειρές (Πίνακας S4), και σε κύτταρα ΝΟΙ-N592, η οποία εξέφρασε χαμηλότερο επίπεδο miR -34a, δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα των κυττάρων SCLC (Σχήμα 1 C και D). Σε αντίθεση με τη γενικά αποδεκτή ογκοκατασταλτικό αποτέλεσμα του miR-34a, η υπερέκφραση του miR-34a σε NCI-82 κύτταρα απέτυχαν να εξασθενεί την ανάπτυξη των κυττάρων (Σχήμα 1 Ε), ενώ δεν παρατηρήθηκε εξασθένιση της ανάπτυξης των κυττάρων σε κύτταρα ΝΟΙ-Η1299 NSCLC (Σχήμα S5 ), όπως αποδείχθηκε σε προηγούμενη έκθεση [23]. Σε αντίθεση με Wiggins

et al.

Τα οποία απέδειξαν ότι επαναλαμβανόμενες επιμόλυνσης και μακροχρόνια επώαση του miR-34a μειώνει NCI-H226 NSCLC καρκινικών κυττάρων βιωσιμότητα [23], δεν καταφέραμε να παρατηρήσουμε την επίδραση των επαναλαμβανόμενων επιμόλυνση του miR-34a σχετικά με τη μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων σε κύτταρα NCI-N592 (Σχήμα 1 F).

(Α) έκφραση του miR-34a στα κύτταρα NCI-N592 και τα κύτταρα NCI-H82 επιμολυσμένα με πρόδρομο miR-34a ή αναστολέα. Η τιμή Ct δέλτα-δέλτα βαθμονομήθηκε με την δέλτα Ct τιμή του miR34a σε κύτταρα επιμολυσμένα με τον έλεγχο πρόδρομο ή αναστολέας Mir, αντίστοιχα. (Β) Η κατανομή κυτταρικού κύκλου του NCI-H82 κυττάρων επιμολυσμένων με τον έλεγχο του miR πρόδρομο, πρόδρομος miR-34a, τον έλεγχο αναστολέας miR, και ο αναστολέας του miR-34a. (Γ και Δ) δοκιμασία ανάπτυξης κυττάρων του NCI-H146 (C) και κύτταρα επιμολυσμένα με αναστολέα miR-34a ή έλεγχος αναστολέα miR NCI-N592 (D). (Ε) προσδιορισμό της ανάπτυξης των κυττάρων των κυττάρων NCI-H82 επιμολυσμένα με πρόδρομο miR-34a ή τον έλεγχο πρόδρομων miR. (F) Κυτταρική βιωσιμότητα των κυττάρων NCI-N592 μετά από επαναλαμβανόμενη επιμόλυνση του ελέγχου των πρόδρομων miR ή πρόδρομος miR-34a. Τα κύτταρα μετρήθηκαν και επιμολύνθηκαν εκ νέου κάθε τρεις ημέρες. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση. ρ-τιμές υπολογίστηκαν σύμφωνα με τη βιωσιμότητα των κυττάρων 5 ημέρες μετά τη διαμόλυνση με την εξαίρεση του προδρόμου microRNA σε NCI-N592 κύτταρο, η οποία υπολογίζεται σύμφωνα με τον αριθμό των κυττάρων που μετρήθηκαν 9 ημέρες μετά την πρώτη διαμόλυνση.

Η

έκφραση microRNA δεν επηρεάζει την ευαισθησία των ναρκωτικών των SCLC κυττάρων

Εμείς δοκιμάστηκε για πρώτη φορά τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης microRNA και την ευαισθησία των 14 SCLC κυτταρικές σειρές με σισπλατίνη και ετοποσίδη. Δεν αποτελεί έκπληξη, η ευαισθησία των SCLC κυττάρων σε ετοποσίδη συσχετίζεται με την ευαισθησία σε σισπλατίνη (συντελεστής συσχέτισης = 0.74, ρ = 0.004). Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση των 7 microRNAs δεν συνδέθηκε με χημειοευαισθησία των SCLC κυττάρων είτε παράγοντα (Πίνακας 3).

Η

επόμενο αξιολογηθεί κατά πόσο η υπερέκφραση ή προς τα κάτω ρύθμιση του miR-34a σε SCLC κύτταρα θα επηρεάσει ευαισθησία χημειοθεραπεία, ως έκφραση miR-34a αναφέρθηκε ότι σχετίζεται με αντίσταση χημειοθεραπεία σε ένα καρκίνο του προστάτη κυτταρική γραμμή [25]. κύτταρα NCI-H82, το οποίο φέρει μια σιωπηλή TP53 μετάλλαξη (Πίνακας S4) επιμολύνθηκαν με τον έλεγχο του miR πρόδρομο, πρόδρομος miR-34a, τον έλεγχο αναστολέας miR και αναστολέας miR-34a, και στη συνέχεια θεραπεία με σισπλατίνη ή ετοποσίδη. IC

50 τιμές κατά την κατεργασία σισπλατίνη ήταν 0,9 ± 0,02 μΜ, 1,19 ± 0,3 μΜ, 0,83 ± 0,15 μΜ, και 0,79 ± 0,13 μΜ, αντίστοιχα (ρ = 0,1 με μονόδρομη ANOVA) (Σχήμα 2Α και Β). Το IC

50 τιμές κατά την κατεργασία ετοποσίδης ήταν 0.28 ± 0.05 μΜ, 0.31 ± 0.04 μΜ, 0.54 ± 0.40 μΜ, και 0,58 ± 0,07 μΜ, αντίστοιχα (ρ = 0,24) (Σχήμα 2C και D). Για GLC4 κύτταρα, τα οποία φέρουν μετάλλαξη K132E στο γονίδιο TP53 (Πίνακας S4), το IC

50 τιμές κατά την αγωγή με σισπλατίνη ήταν 3,03 ± 0,87 μΜ, 2,56 ± 0,85 μΜ, 1,87 ± 0,30 μΜ, και 1,92 ± 0,61 μΜ, αντίστοιχα (ρ = 0,14) (Σχήμα S6a)? το IC

50 τιμές κατά την κατεργασία ετοποσίδης ήταν 0.19 ± 0.03 μΜ, 0.28 ± 0.01 μΜ, 0.20 ± 0.03 μΜ, και 0,19 ± 0,06 μΜ, αντίστοιχα (ρ = 0,08) (Σχήμα S6B). Συνοπτικά, παροδική υπερέκφραση ή προς τα κάτω ρύθμιση του miR-34a σε SCLC κύτταρα δεν επηρέασε την ευαισθησία στη σισπλατίνη ή η ετοποσίδη, ανεξάρτητα από την κατάσταση ΤΡ53.

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα ολιγονουκλεοτίδια. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση των προσδιορισμών εις τριπλούν.

Η

Η έκφραση των γονιδίων στόχων miR-34a διαφέρουν μεταξύ των κυτταρικών σειρών καρκίνου του

Αξιολογήσαμε την έκφραση του επιλεγμένου στόχου-γονίδια miR-34a σε κυτταρικές σειρές SCLC και NSCLC. Γονίδια που επιλέχθηκαν ήταν ΚΟΑ [8], MAP2K1 [26], BCL2 [21], και AXL [27]. Παρατηρήσαμε μια αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ miR-34a και ο-ΜΕΤ αλλά όχι bcl-2 έκφραση σε 5 κυτταρικές γραμμές SCLC (Σχήμα S7A και Β). Παρά τη σχετικά χαμηλότερη έκφραση του miR-34a σε SCLC κυτταρικές σειρές (Σχήμα S1), εμείς δεν παρατηρούμε συγκριτικά υψηλότερη έκφραση ο-ΜΕΤ σε SCLC κυτταρικές σειρές από ό, τι σε κυτταρικές σειρές NSCLC (Σχήμα S7A). Παρατηρήσαμε ωστόσο μειωμένη πρωτεΐνη έκφραση του cMet σε Α549 και κυτταρικές γραμμές ΝΟΙ-Η1299 NSCLC επιμολυσμένα με πρόδρομο miR-34a (Σχήμα 3Α). Δεδομένου ότι η έκφραση cMet σε NCI-H82 ήταν μη ανιχνεύσιμη, έκτοπη έκφραση των προδρόμων miR-34a ή ελέγχου δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση cMet, όπως αναμενόταν. Μία μείωση της έκφρασης της πρωτεΐνης bcl-2 παρατηρήθηκε σε κύτταρα NCI-N592 επιμολυσμένα με πρόδρομο miR-34a (Σχήμα 3Α). Επειδή μόνο το MAP2K1 αλλά όχι το γονίδιο MAP2K2 είναι ο στόχος του miR-34a, δεν είχαμε ανιχνεύσει μειωμένη έκφραση της πρωτεΐνης του ΜΕΚ1 /2 σε κύτταρα επιμολυσμένα με πρόδρομο miR-34a? Αυτό είναι προφανώς λόγω απολυθέντες ρόλους των MAP2K1 και 2. Διαμόλυνση miR-34a πρόδρομο ρυθμίζεται προς τα κάτω την έκφραση του mRNA του γονιδίου AXL σε Α549 και κύτταρα ΝΟΙ-Η1299 NSCLC κατά περισσότερο από 70% (μεταβολή του δέλτα Ct περισσότερο από 1,7), ενώ η έκφραση του mRNA του γονιδίου AXL σε κύτταρα NCI-H82 και ΝΟΙ-N592 SCLC ήταν πολύ χαμηλή για να ανιχνευθούν με πραγματικού χρόνου PCR δοκιμασία (Σχήμα 3Β). Συνοπτικά, αποδείξαμε ότι η έκτοπη έκφραση του miR-34a θα μπορούσε να ρυθμίζουν προς τα κάτω στόχος-γονίδια miR-34a σε κύτταρα που εκφράζουν τους στόχους.

(Α) πρωτεΐνη έκφραση των στόχων miR-34a σε καρκινικές κυτταρικές σειρές διαμολυσμένους με πρόδρομος ελέγχου (C) ή πρόδρομο miR-34a (Μ). έκφρασης (Β) mRNA του γονιδίου AXL σε καρκινικά κύτταρα επιμολυσμένα με πρόδρομο έλεγχο ή πρόδρομος miR-34a. RNA συλλέχθηκε 24 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η έκφραση του γονιδίου στα κύτταρα NCI-H82 και NCI-N592 ήταν μη ανιχνεύσιμες (UD).

Η

Συζήτηση

Εδώ δείξαμε την έκφραση των 7 γνωστών σχετίζονται με τον καρκίνο microRNAs στο SCLC όγκους και κυτταρικές σειρές όπως επίσης και σε NSCLC κυτταρικές γραμμές. Παρατηρήσαμε ότι η έκφραση αυτών των microRNAs ήταν άσχετη με κλινικά χαρακτηριστικά και την έκβαση του SCLC ασθενών. Έκφραση αυτών των microRNAs ήταν άσχετη με την ευαισθησία των SCLC κυττάρων με σισπλατίνη ή ετοποσίδη. Επιπλέον, η υπερέκφραση ή προς τα κάτω ρύθμιση του miR-34a δεν επηρέασε τη βιωσιμότητα SCLC κυττάρων ή ευαισθησία στη σισπλατίνη και ετοποσίδη. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η έκφραση των γονιδίων στόχων miR-34a μπορεί να διαφέρουν μεταξύ των SCLC και NSCLC κυτταρικές σειρές.

Αν και microRNAs έχουν μελετηθεί ευρέως σε διάφορους τύπους καρκίνου, υπάρχουν μόνο λίγες δημοσιεύσεις αντιμετώπιση του ρόλου των microRNA στην η κακοήθης συμπεριφορά του SCLC [20], [28], [29], [30]. Miko

et al.

Σύγκριση έκφραση microRNA μεταξύ SCLC κυτταρικές γραμμές και χωρίς-όγκο πνευμονικό ιστό από ασθενείς με χρόνια αποφρακτική πνευμονοπάθεια [28]. Du

et al.

Σύγκριση του προτύπου έκφρασης microRNA μεταξύ 9 SCLC και 7 NSCLC κυτταρικές σειρές, και ένα μεσοθηλίωμα κυτταρική σειρά [20], και Guo

et al.

Σε σύγκριση με SCLC κυτταρική γραμμή, ΝΟΙ-Η69, με δοξορουβικίνη ανθεκτική υπο-γραμμή [30]. Ranade

et al

ανέφερε η μόνη μελέτη που χρησιμοποίησε SCLC δειγμάτων όγκου [29].? 16 microRNAs μελετήθηκαν για ανάλυση επιβίωσης σε 25 ασθενείς, και miR-92a-2 * αναγνωρίστηκε ως πιθανός προγνωστικός παράγοντας.

Αν και η έκφραση των 7 microRNAs στη μελέτη μας αξιολογήθηκε σε πολλούς τύπους καρκίνου

in vitro

,

in vivo

, και σε δείγματα όγκων, που δεν έχουν αξιολογηθεί πριν σε σχέση με την επιβίωση των ασθενών με μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. Αν και η μελέτη μας είναι αναδρομική και η ομάδα των ασθενών είναι μικρό, αυτό είναι μακράν το μεγαλύτερο SCLC ομάδα των ασθενών και τη συλλογή των κυτταρικών σειρών SCLC διερεύνηση έκφραση microRNA σε αυτόν τον τύπο του όγκου. Σύμφωνα με την προηγούμενη έκθεσή μας, μια ανάλυση posthoc ενός μεγάλου προοπτική τυχαιοποιημένη μελέτη σε NSCLC [18], η έκφραση των 7 microRNAs δεν ήταν προγνωστικό ούτε αυτοί συσχετίζονται με την έκβαση της θεραπείας σε ασθενείς με SCLC. Δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι microRNAs, εκτός από τις 7 microRNAs που παρουσιάζονται εδώ μπορεί να είναι σημαντική για την SCLC, και ως εκ τούτου, περαιτέρω μελέτες μπορεί να επιβληθεί σε SCLC να αξιολογήσει την προγνωστική αξία των microRNAs δεν περιλαμβάνονται σε αυτή τη μελέτη.

ΜΙΚ 34α είναι ένα ευρέως μελετηθεί ογκοκατασταλτικό microRNA που μεσολαβεί απόπτωση, διακοπή του κυτταρικού κύκλου, την αναστολή του πολλαπλασιασμού, γήρανση, και την αναστολή της εισβολής και της μετανάστευσης σε διάφορους τύπους καρκίνου (ανασκόπηση από Hermeking

κ.ά.

. [31]). Το ογκοκατασταλτικό αποτέλεσμα του miR-34a σε καρκινικά κύτταρα, ωστόσο, μπορεί να είναι ο τύπος του όγκου ειδικό? λαμβάνοντας υπόψη ότι η miR-34a ρυθμίζει προς τα κάτω την ανάπτυξη των IMR-90 ινοβλαστών [8], καθώς και αρκετές κυτταρικές σειρές NSCLC [23], Li

et al.

έδειξε ότι η υπερέκφραση του miR-34a έχει ούτε επηρεάζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, διανομή του κυτταρικού κύκλου, ούτε απόπτωσης σε ένα κυτταρικής σειράς ηπατοκυτταρικού καρκινώματος [32], και Pang

et al.

απέδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-34a δεν έχει καμία επίδραση επί του πολλαπλασιασμού των κυτταρικών γραμμών καρκίνου του τραχήλου της μήτρας Hela και SiHa, καθώς και χοριοκαρκινώματος κυτταρική σειρά JAR [33]. miR-34a είναι μία άμεση μεταγραφική στόχος της ρ53 [8], και έχουν μεταλλάξεις του γονιδίου ΤΡ53 έχουν βρεθεί σε πάνω από το 75% του SCLC δείγματα [16]. Μια τάση που ευνοεί χαμηλότερη έκφραση του miR-34a σε SCLC κυτταρικές σειρές σε σύγκριση με τον όγκο χωρίς πνευμονικού ιστού έχει παρατηρηθεί στο παρελθόν [28]. Σε συμφωνία με την εύρεση μας ότι η έκτοπη έκφραση του miR-34a δεν ρυθμίζουν προς τα κάτω την ανάπτυξη των κυττάρων ή να επάγει G1 σύλληψη, η έκφραση του miR-34a δεν σχετίζεται με την κατάσταση της νόσου (Πίνακας S1) και την εξέλιξη (Πίνακας 2) από τους ασθενείς με SCLC. Περιέργως, όλες οι SCLC κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν στη μελέτη αυτή εκφράζεται χαμηλό επίπεδο cMet και ΑχΙ, δύο γονίδια στόχους miR-34a. Είναι εύλογο ότι η επίδραση καταστολή της ανάπτυξης του miR-34a μπορεί να είναι ιστών και συγκεκριμένες ασθένειες, υπαγορεύεται πιθανώς από το επίπεδο του εγγενούς έκφρασης miR-34a-στόχο γονίδιο στο οποίο τα κύτταρα με χαμηλά επίπεδα έκφρασης στόχου-γονιδίου miR-34a, όπως SCLC κύτταρα, μπορεί να καταστήσει miR-34a λειτουργικά ανίκανοι.

Εν κατακλείδι, η έκφραση των 7 σχετίζονται με τον καρκίνο microRNAs δεν συσχετίζεται με την κλινική έκβαση των ασθενών SCLC. έκφραση του miR-34a επίσης δεν σχετίζονται με κακοήθη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων SCLC και έτσι είναι απίθανο να είναι ένας υποψήφιος θεραπευτικός στόχος για την ασθένεια αυτή.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση

Ασθενείς και δεοντολογίας

Τριάντα ένα φορμόλη σταθερό, παραφίνη-ενσωματωμένες (FFPE) δείγματα όγκων από ασθενείς που είχαν συμπεριληφθεί σε μία μελέτη φάσης III της ομάδας North-Holland Ογκολογίας [22] ελήφθησαν από το Ιατρικό Κέντρο του Πανεπιστημίου VU, του Άμστερνταμ, Ολλανδία , μετά από έγκριση του Διοικητικού συμβουλίου αναθεώρηση [22] Θεσμικές. Γραπτή πληροφορημένες συγκαταθέσεις ελήφθησαν από όλους τους συμμετέχοντες.

Οι κυτταρικές σειρές

Μια ομάδα από 14 SCLC και 26 κυτταρικές σειρές NSCLC μελετήθηκαν και παρατίθενται στον Υλικά S1. Όλες οι κυτταρικές σειρές καρκίνου διατηρήθηκαν σε RPMI-1640, συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS), με την εξαίρεση του NCI-H792 το οποίο διατηρήθηκε σε ϋΜΕΜ συμπληρωμένο με 10% FBS. Το γονίδιο TP53 μετάλλαξη σε κυτταρικές σειρές προσδιορίστηκε από την αναζήτηση στο χώρο p53 web (https://p53.free.fr/), η βάση δεδομένων IARC TP53 (https://www-p53.iarc.fr/), και η κοσμική βάση δεδομένων (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/).

RNA εξόρυξη

το συνολικό RNA εξήχθη από δείγματα FFPE χρησιμοποιώντας την απομόνωση RecoverAll Σύνολο νουκλεϊκών οξέων kit (Ambion, Austin, ΤΧ) και το συνολικό RNA από κυτταρικές γραμμές εκχυλίζεται με αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (qRT-PCR)

η έκφραση των ώριμων miRNAs, συμπεριλαμβανομένων των miR-21, miR-29b, miR-34a /b /c, miR-155, και αφήστε-7α, αξιολογήθηκε με ανάλυση qRT-PCR όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18] . RNU6B snRNA χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο. Κάθε δοκιμασία microRNA πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν. Έκφραση των microRNAs αναφέρθηκε ως δέλτα τιμή Ct (Ct αξία των RNU6B – Ct τιμή του στόχου microRNA). Ορίσαμε τις ομάδες των όγκων ή κυττάρων με υψηλή ή χαμηλή έκφραση με βάση την μέση τιμή έκφρασης του κάθε microRNA.

Η έκφραση του γονιδίου AXL διεξήχθη με τη χρήση ανιχνεύσεως Taqman έκφρασης γονιδίου (Applied Biosystems) και αναφέρθηκε ως δέλτα τιμή Ct. γονίδιο GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ενδογενής έλεγχος.

Η επιμόλυνση των microRNA προδρόμου ή αναστολείς

πρόδρομος miR-34a και αναστολέα, καθώς και Cy3-επισημασμένο ελέγχου προδρόμου miR και αναστολέα αγοράστηκαν από Ambion. Η επιμόλυνση του miR-προδρόμου ή αναστολέα διεξήχθη χρησιμοποιώντας siPORT ™

NeoFX

™ Transfection Agent (Ambion) ακολουθώντας τις συστάσεις του κατασκευαστή σε τελική συγκέντρωση ολιγονουκλεοτιδίου 30 ηΜ.

Η κυτταρική ανάπτυξη ανάλυση

για να προσδιοριστεί η επίδραση της διαμολύνσεως επί της κυτταρικής ανάπτυξης, 5.000-10.000 κύτταρα επιμολυσμένα με την υποδεικνυόμενη πρόδρομο microRNA ή αναστολέας απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Η κυτταρική ανάπτυξη προσδιορίστηκε με Δοκιμασία CellTiter 96 AQueousOne Λύση κυτταρικού πολλαπλασιασμού (Promega Corp. Madison, WI) κάθε 24 ώρες για 5 διαδοχικές ημέρες. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται σαν την οπτική πυκνότητα (τιμή OD) απορρόφηση στα 490 nm.

Επαναληπτική transfectin του N592 κυττάρου

100.000 κύτταρα NCI-N592 SCLC απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και επιμολύνθηκαν με miR -34a πρόδρομος ή έλεγχο των προδρόμων ουσιών. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, μετρήθηκαν, και επιμολύνονται και πάλι με τις αντίστοιχες miRNAs κάθε 72 ώρες.

αναλύσεις αναστολής της ανάπτυξης

Η σισπλατίνη και ετοποσίδη ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΙ). 10,000 κύτταρα σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων επίπεδου πυθμένα πλάκες, επιμολυσμένα με πρόδρομο ενδεικνυόμενο ή αναστολέας microRNAs, καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες πριν από την προσθήκη διαφόρων συγκεντρώσεων σισπλατίνης και ετοποσίδη, και επωάστηκε για επιπλέον 72 ώρες. Τα κυτταροτοξικά αποτελέσματα της σισπλατίνης και ετοποσίδη προσδιορίστηκαν με Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού CellTiter 96 AQueousOne Solution Cell. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Το ποσοστό της βιωσιμότητας των κυττάρων προσδιορίστηκε με διαίρεση των τιμών απορρόφησης των κατεργασμένων κυττάρων με εκείνα των μη επεξεργασμένων κυττάρων, και η συγκέντρωση της σισπλατίνης ή ετοποσίδης σαν αποτέλεσμα 50% αναστολή ανάπτυξης (IC

50) προσδιορίστηκε.

Ανοσοϊστοχημεία μελέτη

Η ανοσοϊστοχημεία μελέτη της p53 και bcl-2 σε SCLC όγκοι έγιναν και έχουν αναφερθεί στο παρελθόν [22].

κηλίδας Western

κύτταρα NCI-N592 και Α549 επιμολυσμένα με πρόδρομο miR-34a ή ελέγχου πρόδρομος επωάστηκαν για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, παρασκευάστηκαν προϊόντα λύσης, και στύπωμα Western διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [34]. Αντισώματα ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich (ακτίνη), Santa Cruz Biotechnology Inc (c-Met), Cell Signaling Technology (ΜΕΚ1 /2), και Dako (BCL-2). Οι εντάσεις του ο-ΜΕΤ και bcl-2 αξιολογήθηκαν με χρήση λογισμικού GeneTools (SynGene), κανονικοποιημένη από την ένταση της ακτίνης, και βαθμονομημένη με το επίπεδο έκφρασης σε Α549 και NCI-H146 κυττάρων, αντίστοιχα.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση με κυτταρομετρία ροής

48 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με ψυχρό PBS, μονιμοποιήθηκαν με ψυχρή αιθανόλη 70% σε PBS για τουλάχιστον 24 ώρες, και σημάνθηκαν με ιωδιούχο προπίδιο πριν από την μέτρηση των κυττάρων. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα μετρήθηκαν σε FACScalibur χρησιμοποιώντας το λογισμικό Pro Cellquest (Becton Dickinson and Company, Frankin Lakes, NJ). κλάσματα του κυτταρικού κύκλου αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό v3.0 ΜΟϋΡΙΤ.

In situ υβριδισμού

των microRNAs

In situ υβριδισμού

του miR-34b έχει πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Πυρηνικός U6 RNA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας.

Η στατιστική ανάλυση

Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση SPSS έκδοση 17.0 (SPSS, Chicago, IL). Η επιβίωση υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Kaplan-Meier. Η σύγκριση της επιβίωσης μεταξύ των διαφορετικών ομάδων προσδιορίστηκε με την δοκιμασία log-rank. Οι διαφορές στην έκφραση μεταξύ των ομάδων microRNA αναλύθηκαν με τη δοκιμή Rank Sum-Wilcoxon. Η συσχέτιση μεταξύ της ευαισθησίας των ναρκωτικών και της έκφρασης microRNA αναλύθηκε με Spearman rank συσχέτιση. Σύγκριση της ευαισθησίας φαρμάκου του κύτταρα επιμολυσμένα με διάφορα ολιγονουκλεοτίδια διεξήχθη με μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης (one-way ANOVA). Όλες οι p-τιμές ήταν δύο-πλευρών και p-τιμές μικρότερες από 0,05 θεωρήθηκαν σημαντικές.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Έκφραση των microRNAs στο SCLC έναντι σε κυτταρικές σειρές NSCLC. Μια δέλτα Ct αξία των -15 δείχνει ότι η έκφραση του microRNA στην κυψέλη είναι πολύ χαμηλή για να ανιχνευθεί

doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

in situ υβριδισμού

των microRNAs σε SCLC όγκου. Πυρηνικός U6 RNA και miR-34b ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα βιοτινυλ τυραμιδίου που βασίζεται με Vector NovaRed ως υπόστρωμα (καφέ). Δείγματα για αγωνίζομαι αρνητικό μάρτυρα και miR-34b ήταν συν-χρώση με αιματοξυλίνη Mayer του (μπλε)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Συσχέτιση της έκφρασης της p53 και (Α) miR-34a, (Β) miR-34b, και (Γ) miR-34c, και (Δ) συσχέτιση της έκφρασης του miR-34a και bcl-2. Η έκφραση του p53 και bcl-2 παρουσιάστηκαν ως ποσοστό των χρωματισμένων κυττάρων με ανοσοϊστοχημεία. συντελεστής συσχέτισης (r) και τιμή-p προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο Spearman

doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

NCI-H82 κυττάρων επιμολυσμένα με (Α) Cy3-επισημασμένο αναστολέα microRNA και (Β) Cy3-επισημασμένο πρόδρομο microRNA.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s004

(ΔΕΘ)

Εικόνα S5.

δοκιμασία κυτταρική ανάπτυξη των κυττάρων NCI-Η1299 NSCLC επιμολυσμένα με miR-34a ή έλεγχο των προδρόμων ουσιών. Οι ράβδοι σφάλματος αναφέρονται σε τυπικές αποκλίσεις

doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s005

(ΔΕΘ)

Εικόνα S6. ανάλυση αναστολής

ανάπτυξη των κυττάρων GLC4 αγωγή με (Α) σισπλατίνη και (Β) ετοποσίδης. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα υποδεικνυόμενα ολιγονουκλεοτίδια. Οι μπάρες σφάλματος δείχνουν την τυπική απόκλιση των δοκιμασιών εις τριπλούν

doi:. 10.1371 /journal.pone.0021300.s006

(ΔΕΘ)

Εικόνα S7.

Πρωτεΐνη έκφραση του c-ΜΕΤ και bcl-2 σε 5 SCLC και 3 κυτταρικές σειρές NSCLC. (Β) Συσχέτιση μεταξύ miR-34a και την έκφραση ο-ΜΕΤ, καθώς και bcl-2 σε 5 γραμμές κυττάρων SCLC.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s007

(ΔΕΘ)

Πίνακα S1.

Τα microRNAs και κλινικές covariables.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s008

(DOC)

Πίνακας S2.

Επίδραση της κλινικής covariables στην επιβίωση χωρίς εξέλιξη της νόσου (PFS).

doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s009

(DOC)

Πίνακα S3.

Επίδραση της έκφρασης microRNA στην επιβίωση χωρίς εξέλιξη (PFS, εβδομάδες) σε ασθενείς με SCLC στρωματοποιημένη με περιορισμένη νόσο ή εκτεταμένη νόσο.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s010

(DOC)

Πίνακας S4. κατάσταση

TP53 και την έκφραση του miR-34a σε κυτταρικές σειρές SCLC.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s011

(DOC)

Υλικά S1. κυτταρικές σειρές

Καρκίνου.

doi: 10.1371 /journal.pone.0021300.s012

(DOC)