Αφηρημένο

Η συνοδός GRP78 μοριακό /ΣΣΕ αποτελεί βασικό ρυθμιστή της πρωτεΐνης αναδίπλωση στο ενδοπλασματικό δίκτυο, και διαδραματίζει καθοριστικό ρόλο στην επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και χημειοαντίσταση. Η αναστολή της λειτουργίας της έχει ως εκ τούτου ήταν μια σημαντική στρατηγική για την αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων του όγκου στη θεραπεία του καρκίνου. Προηγούμενες προσπάθειες για την επίτευξη αυτού του στόχου έχουν χρησιμοποιήσει πεπτίδια που δεσμεύονται με GRP78 /ΒίΡ συζευγμένο σε προ-φάρμακα ή αλληλουχίες κυτταρικού θανάτου που επάγει. Εδώ, περιγράφουμε ένα πεπτίδιο το οποίο επάγει το θάνατο των κυττάρων του όγκου του προστάτη, χωρίς την ανάγκη οποιωνδήποτε σύζευξη αλληλουχιών. Αυτό το πεπτίδιο είναι μια ακολουθία που προέρχεται από το cochaperone Bag-1. Δείξαμε ότι αυτή η αλληλουχία αλληλεπιδρά με και αναστέλλει τη δράση της αναδίπλωσης GRP78 /ΒίΡ. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι ρυθμίζει την ξεδιπλωμένη απόκριση πρωτεΐνης σε ER στρες με αποτέλεσμα PARP και κασπάσης-4 διάσπαση. Ο καρκίνος του προστάτη που εκφράζουν σταθερά αυτό το πεπτίδιο παρουσίασαν μειωμένη ανάπτυξη και αυξημένη απόπτωση σε

in vivo

μοντέλα ξενομοσχεύματος όγκου. Οι υποκαταστάσεις αμινοξέων που κατέστρεψε δέσμευσης του Bag-1 πεπτιδίου προς GRP78 /ΒίΡ ή προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της GRP78 σε κίνδυνο την ανασταλτική δράση αυτού του πεπτιδίου. Ως εκ τούτου, αυτή η αλληλουχία αντιπροσωπεύει ένα πεπτίδιο επικεφαλής υποψήφιος για την αντινεοπλασματική θεραπεία

Παράθεση:. Maddalo D, Neeb Α, Jehle Κ, Schmitz Κ, Muhle-Goll C, Shatkina L, et al. (2012) μία πεπτιδική μη συζευγμένο GRP78 /ΣΣΕ Ligand διαμορφώνει το ανοιγμένο Response πρωτεΐνη και προκαλεί τον καρκίνο του προστάτη κυτταρικό θάνατο. PLoS ONE 7 (10): e45690. doi: 10.1371 /journal.pone.0045690

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 20η Ιανουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 23 Αυγούστου 2012? Δημοσιεύθηκε: 1η Οκτωβρίου, 2012

Copyright: © Maddalo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από την Ένωση για τη Διεθνή Έρευνα του Καρκίνου, Ηνωμένο Βασίλειο? το γερμανικό Ίδρυμα Επιστημών, η PRIMA 6ο πρόγραμμα πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Ένωσης, και τα κεφάλαια εκκίνησης από το Τεχνολογικό Ινστιτούτο της Καρλσρούης. Danilo Maddalo ήταν ο αποδέκτης της Marie Curie ερευνητική υποτροφία CANCURE στο 6ο πρόγραμμα πλαίσιο της Ευρωπαϊκής Ένωσης. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Η γλυκόζη ρυθμίζεται πρωτεΐνη GRP78 (επίσης γνωστό ως ΒίΡ, immunoglobuling πρωτεΐνη δέσμευσης βαριάς αλυσίδας) είναι ένα μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών θερμικού σοκ και παίζει σημαντικό ρόλο στη διατήρηση της κυτταρικής ομοιόστασης [1]. Είναι ο βασικός ρυθμιστής της απόκρισης εκτυλίχθηκε πρωτεΐνης (UPR), ένα μονοπάτι ενεργοποιείται κατά την συσσώρευση του ξετυλίγεται πεπτιδίων κατά τη διάρκεια αγχωτικών καταστάσεων, όπως θερμικό σοκ, οξέωση, θρεπτικών πείνα και υποξία [2].

GRP78 ρυθμίζει το UPR με τη δέσμευση των πρωτεϊνών του αισθητήρα διαμεμβρανικές PERK (PKR-όπως ενδοπλασματικό δίκτυο-κάτοικος κινάση), ATF6 (παράγοντα ενεργοποίησης μεταγραφής 6) και IRE1α (ινοσιτόλη-απαιτώντας ένζυμο α) (που επισκοπείται στο [3]) που οδηγεί από τη μία πλευρά σε αυξημένη μεταγραφή μοριακών συνοδών όπως η ίδια GRP78, GRP94 και πρωτεΐνη-δισουλφίδιο ισομεράση (PDI) [4], [5] και από την άλλη πλευρά για να κλείσει την πρωτεϊνική σύνθεση με φωσφορυλίωση της άλφα υπομονάδας του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης eIF2α [6]. Ως συνέπεια αυτών των δύο επιδράσεων, τα κύτταρα να ξεπεράσουν είναι υπερφορτωμένο με παρεκκλίνουσα πεπτίδια και επιβιώνουν [7]. Ωστόσο, η παρατεταμένη eIF2α φωσφορυλίωση ενεργοποιεί τον παράγοντα μεταγραφής ATF4 [8], [9] που οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα του παράγοντα CHOP προ-αποπτωτικά (C /EBP ομόλογη πρωτεΐνη) [10], [11]. Η ενεργοποίηση των ER-μεσολάβηση στρες αποτελέσματα απόπτωση σε διάσπαση caspsase 4, ένα ER-στρες ειδικό κασπάσης, και του PARP (πολυ (ADP) ριβοσώματος πολυμεράσης) [12], [13].

GRP78 υπερεκφράζεται σε διάφορους τύπους όγκων όπως του προστάτη [14], του μαστού [15], [16] και του παχέος εντέρου και η έκφρασή του συσχετίζεται συχνά με πτωχή πρόγνωση [17], [18], [19]. Ωστόσο GRP78 ρύθμιση προς τα κάτω με siRNA αυξάνει απόπτωση και ευαισθητοποιεί τα κύτταρα σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα [20], [21]. Σε γενικές γραμμές τα μετασχηματισμένα κύτταρα ρυθμίζουν προς τα πάνω GRP78 επίπεδο [15] για να επιβιώσουν τις αντίξοες συνθήκες στο μικροπεριβάλλον του όγκου [22], [23], [24]. Διάφοροι θεραπευτικοί παράγοντες έχουν επομένως ως στόχο την UPR ή κατά GRP78 /ΒίΡ να περιορίσει την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων [25], [26], αλλά πραγματικά εκλεκτικοί αναστολείς έχουν ακόμη προσδιοριστεί [15]. Σε μια αναζήτηση για περαιτέρω αναστολείς της GRP78 /ΣΣΕ που θα μπορούσε να έχει θεραπευτική σημασία, έχουμε χρησιμοποιήσει τις πληροφορίες σχετικά με τη ρύθμιση του ER στρες με την cochaperone Bag-1 [27] για να προσδιορίσει μια ακολουθία από Bag-1 η οποία δεσμεύει και αναστέλλει την δράση της GRP78 /ΣΣΕ.

τσάντα-1 είναι μια τετραμελή οικογένεια πολυπεπτιδίων (Bag-1L, -1M, -1 και -1δ) με πολυλειτουργικό τομείς που αλληλεπιδρά με και ρυθμίζει τις δραστηριότητες των διαφόρων κυτταρικών πρωτεϊνών [ ,,,0],28]. Αυτές οι πρωτεΐνες έχουν αποκλίνουσες ακολουθίες Ν-τερματικό αλλά ένα κοινό κεντρικό ουμπικουϊτίνης-όπως τομέα που σχηματίζει ένα σύνδεσμο για την HSC /Hsp70 στην πρωτεασώματος [29] και μια διατηρημένη περιοχή δέσμευσης Ο-τερματικό Hsp70 (αλλιώς γνωστή ως περιοχή BAG) που δεσμεύεται να Hsp70 /Hsc70 και λειτουργεί ως παράγοντας ανταλλαγή νουκλεοτιδίων [30], [31]. Bag-1 έχει επίσης δειχθεί να ρυθμίζει ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) που προκαλείται από στρες απόπτωση [27] και να δεσμεύει GADD34, ένα συστατικό του στρες ER [32], αλλά λεπτομέρειες της δράσης της δεν είναι γνωστός.

στην ανακοίνωση αυτή θα δείξουμε ότι Bag-1 συνδέεται με GRP78 /ΣΣΕ μέσω ενός πεπτιδίου επικαλυπτόμενες ουβικιτίνης-όπως τομέα του. Δείχνουμε επίσης ότι η GRP78 /ΒίΡ πεπτίδιο που δεσμεύεται από Bag-1 αναστέλλει τη δράση της GRP78 /ΒίΡ και παρεμβαίνει με την UPR οδηγεί στην επαγωγή της απόπτωσης. Έχουμε περιοριστεί αυτό το πεπτίδιο και προσδιόρισε ένα πυρήνα μοτίβο επτά αμινοξέων που εμφανίζεται απαραίτητη για δέσμευση με GRP78 /ΒίΡ και για την αρνητική ρύθμιση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη. Αυτή η βασική αλληλουχία θα μπορούσε να είναι το σημείο εκκίνησης των μελλοντικών θεραπευτικών κατευθύνεται προς την αναστολή της GRP78 /δράσης ΣΣΕ και του UPR.

Υλικά και Μέθοδοι

Cell Culture

Ανθρώπινο καλοήθη προστατικής υπερπλασίας κυτταρική γραμμή ΒΡΗ-1 καλλιεργήθηκε σε Dulbeccos τροποποιημένο μέσο Eagles (ϋΜΕΜ) συμπληρωμένο με γλουταμίνη. PC3 και DU145 κύτταρα επίσης καλλιεργήθηκαν σε DMEM χωρίς γλουταμίνη 22Rv.1, LNCaP και κυττάρων PNT-2 καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640. Όλα τα ανωτέρω μέσα καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. κύτταρα RWPE-1 καλλιεργήθηκαν σε μέσο ελεύθερο ορού κερατινοκυττάρων. Όλα τα μέσα καλλιέργειας διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα 5% CO

2.

Αντισώματα

Goat μονοκλωνικό αντίσωμα GRP78 (Ν20), πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι Bag-1 (C-16), eIF2α και φωσφο-PERK αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology, Χαϊδελβέργη, Γερμανία. Πολυκλωνικός αντι-GRP78 (ab21685), αντι-GCN2 (ab37674), αντι-PERK (ab65142), αντι-φωσφο-IRE1α (ab124945) αντισώματα, μονοκλωνικά αντι-phopsho-GCN2 (ab75836) αντίσωμα και μονοκλωνικό ποντικού αντι-β ακτίνης αντίσωμα (ab8226) αγοράστηκαν από την Abcam, Cambridge, UK. αντίσωμα ποντικού έναντι ΗΑ-ετικέτα (HA.11 κλώνος 16B12) αγοράστηκε από την Covance, Μόναχο, Γερμανία. μονοκλωνικό αντίσωμα αρουραίου έναντι ΗΑ (3F10) αγοράστηκε από την Roche, Mannheim, Γερμανία. Αντισώματα έναντι IRE1α, φωσφο-eIF2α CHOP, PARP και ATF4 αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology, Frankfurt am Main, Γερμανία. Αντι-ATF6 αντίσωμα αγοράστηκε από Imgenex, Αμβούργο, Γερμανία. Κασπάσης 4 αντίσωμα αγοράστηκε από την MBL, Μόναχο, Γερμανία.

φορέων έκφρασης και πλασμίδια

Ο φορέας έκφρασης pcDNA3.1-HA-Bag-1 κωδικοποίηση τσάντα-1 έχει περιγραφεί προηγουμένως από [ ,,,0],33]. Το κατασκεύασμα που κωδικοποιεί Bag-1Δ68mer (Bag-1 δεν έχει τα αμινοξέα 202 έως 269) δημιουργήθηκε με αντικατάσταση του Sac II-Xba Ι του Bag-1 cDNA σε ένα κατασκεύασμα pcDNA3-Bag-1. Η κατασκευή pcDNA3-ΗΑ Bag-1 πεπτίδιο (τσάντες1-L 202 – 269), Ν-τερματικό (Bag-1L 202 έως 241), C-τερματικό (Bag-1L 241-269), 19-mer (Bag-1L 202 -220), ΔUbi (Bag-1L 220-269) και 19-mer μεταλλαγμένο (Bag-1L 202-220) πεπτίδια δημιουργήθηκαν με ενίσχυση PCR με μια ακολουθία ΗΑ. Ως μάρτυρας, εισαγάγαμε την ακολουθία ΗΑ σε φορέα pcDNA3 για να δημιουργήσει το κενό φορέα έκφρασης pcDNA3.1-ΗΑ. pcDNA3.1 Bag-1ΔC47 (Bag-1 χωρίς τα τελευταία 47 αμινοξέα) κλωνοποιήθηκε εντός των θέσεων Bam HI-XhoI του φορέα pcDNA3.1-ΗΑ μετά από ενίσχυση PCR χρησιμοποιώντας pcDNA3.1-HA Bag-1 ως μήτρα. Για τα πειράματα GST-pull-down, pGEX4T.1-Bag-1 ακολουθία 68mer, pGEX4T.1-Ν-τερματικό πεπτίδιο, pGEX4T.1-C-τελικό πεπτίδιο, pGEX4T.1 τσάντα-1Δ Ubi, pGEX4T.1-19mer και pGEX4T.1-19mer μεταλλάκτες δημιουργήθηκαν με σύντηξη προϊόντα PCR ενίσχυση του αντίστοιχου αλληλουχία Bag-1L σε πλαίσιο με GST στον φορέα pGEX4T.1. πλασμίδια GST που κωδικοποιούν για GST-συντηγμένο GRP78, GRP78-ΑΤΡάσης (GRP78 1-408), GRP78-SBD (GRP78 409 – 651) και Bag-1 ισομορφών δημιουργήθηκαν με PCR και κλωνοποιήθηκαν σε pGEX4T.1 μετά την πέψη BamHI-XhoI. Το πλασμίδιο pCMV6-GRP78 [34] αγοράστηκε από ΟηΟεηε Technologies (Darmstadt, Γερμανία).

κυττάρων Η επιμόλυνση, siRNA Knock-down και κηλίδωση Western

Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά, σταθερή επιμόλυνση διεξήχθη σε 22Rv.1 ή κυττάρων με 10 μg πλασμιδικού DNA με τη χρήση Fugene 6 1 ΒΡΗ-™ (Roche Diagnostics Mannheim, Germany) σταθερά επιμολυσμένα 22Rv.1 κύτταρα επελέγησαν με 0,8 mg /ml ενώ ΒΡΗ-1 κυττάρων κλώνοι επιλέχθηκαν με 1,2 mg /ml G418. LNCaP, PC3, DU145, PNT-2 και RWPE-1 κυτταρικοί κλώνοι επιλέχθηκαν με 1 mg /ml G418. Ειδικά μειορρύθμιση της έκφρασης GRP78 επετεύχθη με επιμόλυνση siRNA-δίπολα (GRP78:5′-GGAGCGCAUUGAUACUAGATT-3 ‘) δύο φορές σε 72 ώρες χρησιμοποιώντας HiPerfect ™ (Qiagen Hilden, Germany). siRNA κατά GFP (5’-GGCUACGUCCAGGAGCGCACC-3 ‘) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Η ανάλυση στυπώματος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [35].

συνανοσοκαθίζησης

22Rv.1 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για μελέτες αλληλεπίδρασης ενδογενούς Bag-1 και GRP78 /ΒίΡ, ενώ για το

in vivo

αλληλεπίδραση του Bag-1 πεπτιδίου και GRP78 /ΒίΡ, κύτταρα ΗΕΚ-293 μορφομετατράπηκαν με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί το ΗΑ-tagged Bag-1 πεπτίδιο. Εικοσιτέσσερις ώρες πριν από το πείραμα, τα κύτταρα σε αμφότερες τις περιπτώσεις πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 20 mM διθειοδις (προπιονικό ηλεκτριμιδυλεστέρα) (DSP) σε PBS για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η αντίδραση διεκόπη με 20 mM Tris και τα κύτταρα υπέστησαν λύση σε 50 mM Tris-HCl ρΗ 7,4, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.4% ΝΡ40 και 1% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης. Ανοσοκαταβύθιση GRP78 /ΒίΡ διεξήχθη όλη τη νύχτα στους 4 ° C με αντι-GRP78 αντίσωμα συζευγμένο σε σεφαρόζη Α σφαιρίδια (Abcam, ab21685). Η σύνδεση του ενδογενούς Bag-1 ή ΗΑ-πεπτιδίου προσδιορίστηκε με κηλίδωση Western χρησιμοποιώντας μια τσάντα-1 ή ένα ειδικό αντίσωμα ΗΑ.

Έκφραση πρωτεϊνών και Προετοιμασία δείγματος

Μια ΤΕΒ πρωτεάσης διασπώνται GB1 -συνενωμένου Bag-1 πεπτίδιο που εκφράζεται στο

Escherichia coli

στέλεχος BL21 (DE3) pLys Σ ομοιόμορφη επισήμανση με

15N για φασματοσκοπία NMR επιτεύχθηκε με την ανάπτυξη των βακτηρίων σε ελάχιστο μέσο συμπληρωμένο με 0,5 g /l

15NH

4Cl. Η GB1-His

6-tagged πρωτεΐνη καθαρίστηκε σε μία στήλη Νί-ΝΤΑ (Qiagen, Hilden, Γερμανία), στη συνέχεια υπέστη πέψη με ανασυνδυασμένη πρωτεάση ΤΕν και πέρασε πάνω από μια δεύτερη στήλη Νί-ΝΤΑ για να απομακρυνθεί τόσο την ετικέτα σύντηξης και το

6-tagged πρωτεάσης του. Τέλος, το ρυθμιστικό πρωτεΐνη αλλάχθηκε σε 20 mM φωσφορικό κάλιο, 100 mM NaCl, ρΗ 6.8. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης εκτιμήθηκε με σύγκριση της έντασης ενός φάσματος 1D NMR με εκείνη της ουσίας αναφοράς (DSS, 2,2-διμεθυλο-2-silapentane-5-σουλφονικό οξύ).

Η GST-HA-tagged Ν-τερματικά και Ο-τερματικά πεπτίδια που παράγονται χρησιμοποιώντας τυπικό πρωτόκολλο. Το τμήμα GST ήταν αποσχίζεται με πέψη με θρομβίνη, ανάλογα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών (Roche, Mannheim, Germany). Το προκύπτον παρασκεύασμα ακατέργαστο πεπτίδιο καθαρίστηκε περαιτέρω με HPLC ανάστροφης φάσης (στήλη C18? 250 χ 10 mm, η Grace) με μια γραμμική κλίση νερού /ακετονιτριλίου. Η ταυτότητα και η καθαρότητα των συλλεγέντων κλασμάτων αναλύθηκαν με MALDI-TOF φασματομετρία μάζας (Bruker Autoflex III). Το ρΗ εξουδετερώθηκε πριν από τη λυοφιλοποίηση. Το πεπτίδιο διαλύθηκε σε 20 mM KPO

4, ρΗ 6.8. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης υπολογίστηκε από την οπτική πυκνότητα στα 275 nm με τη χρήση της απορροφητικότητας των τυροσινών στο ΗΑ-tag.

CD Φασματοσκοπία

Το CD φάσματα των πεπτιδίων καταγράφηκαν σε ένα Jasco J- 810 φασματοπολαριμέτρου (Jasco Co., Tokyo, Japan) στους 20 ° C, χρησιμοποιώντας ένα κάτοχο κυττάρων νερού με θερμοστάτη. Οι συγκεντρώσεις των Bag-1, Ν-τερματικά και Ο-τερματικά πεπτίδια ήταν 17 μΜ, 12 μΜ και 11 μΜ, αντίστοιχα. Τα φάσματα CD είναι οι μέσοι όροι από τρία σαρώσεις σε ένα ρυθμό σάρωσης 10 nm min

-1, 4 s χρόνο απόκρισης και 1 nm εύρος ζώνης, και ήταν smoothened δια της μεθόδου προσαρμοστικής εξομάλυνσης που είναι μέρος του λογισμικού Jasco Spectra Ανάλυση . Η συμβολή ρυθμιστικό αφαιρέθηκε.

Πειράματα NMR

Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης για το πείραμα NMR ήταν 0,5 mM. Για τη βαθμονόμηση χημική μετατόπιση και να συγκρίνει τις σχετικές εντάσεις σήματος, 0.2 mM DSS (2,2 διμεθυλο-2-silpentane-5-σουλφονικό οξύ) προστέθηκε.

φάσματα 15N-HSQC αποκτήθηκαν στους 23 ° C σε 600 φασματόμετρο Bruker Avance II (Bruker, Καρλσρούη) εξοπλισμένο με μια ευρυζωνική τριπλής κεφαλής του ανιχνευτή συντονισμού με 4 σαρώσεις ανά βήμα και συνολικά 128 αυξήσεων στην έμμεση διάσταση. Τα δεδομένα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με NMRPIPE [36] και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας VIEW NMR.

Πόλωση φθορισμού Δοκιμασίες

δοκιμασίες πόλωσης φθορισμού διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας αναγνώστη άπειρη F-200 (Tecan) με διέγερση στα 490 nm και εκπομπής στα 535 nm.

ξενομοσχεύματος όγκου Σπουδών

Όλα τα ζωικά πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τα ευρωπαϊκά και γερμανικά νομικούς κανονισμούς. Για την παραγωγή των μοντέλων ξενομοσχεύματος 5 × 10

6 LNCaP κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε ένα διάλυμα 50% Matrigel® (BD Bioscience, Heidelberg, Germany) σε PBS ή 5 × 10

6 22Rv.1 κύτταρα σε 100 μΙ PBS εγχύθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές 6-8 εβδομάδων αθυμικά γυμνά ποντίκια. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο κάθε εβδομάδα. Οι όγκοι που προέρχονται από την έγχυση σταθερών κλώνων που υπερεκφράζουν το πεπτίδιο Bag-1 αναλύθηκαν σε περίοδο 9 εβδομάδων ενώ οι όγκοι από κύτταρα επιμολυσμένα με τον κενό φορέα έκφρασης ή την έκφραση του Ν-τερματικού, το C-τερματικό και το ΔΝ-πεπτιδίου αναλύθηκαν πάνω από 5 εβδομάδες. Το μέγεθος του όγκου αξιολογήθηκε μετρώντας τρεις κάθετες διαμέτρους σύμφωνα με τον τύπο: V = (1/6) [π] (d1d2d3), όπου π είναι ένας μαθηματική σταθερά και D1, D2 και D3 παριστάνουν τις τρεις χωρικές διαστάσεις (πλάτος, βάθος και ύψος ). Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αυχενική εξάρθρωση και οι όγκοι αφαιρέθηκαν για περαιτέρω ανάλυση.

Πειράματα

GST-pull-down

Η έκφραση των πρωτεϊνών σύντηξης GST για πειράματα GST-pull-down πραγματοποιήθηκαν ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [37].

Ανοσοϊστοχημεία

οι ιστοί σταθεροποιήθηκαν σε 10% φορμαλίνη για 16 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου, αποθηκεύεται σε αιθανόλη (50%), βυθίσθηκαν σε παραφίνη, τεμαχίστηκαν και πάχους 5 μm με μια Leica RM 2155 μικροτ μου. Τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν μέσω δεοξυουριδίνη τριφωσφορική-βιοτίνης nick τέλος επισήμανση (TUNEL) δοκιμασίας τερματικό δεοξυνουκλεοτιδυλοτρανσφεράσης μεσολάβηση χρησιμοποιώντας την κατακερματισμού του DNA ApopTag® υπεροξειδάση

in situ

κιτ ανίχνευσης απόπτωσης (Millipore, Schwalbach, Γερμανία).

βιωσιμότητας κυττάρων δοκιμασία

CellTiter-Blue® κιτ δοκιμασίας κυτταρικής βιωσιμότητας (Promega) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό της βιωσιμότητας των κυττάρων. Εν συντομία 22Rv.1 κύτταρα που υπερεκφράζουν σταθερά το πεπτίδιο Bag-1 σπάρθηκαν σε πλάκα 96 φρεατίων δύο (4.500 κύτταρα /φρεάτιο) και οι μετρήσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Μία πλάκα αναλύθηκε κατά την ημέρα 0 και την άλλη πλάκα, 2 ημέρες αργότερα. Τρεις ώρες μετά την σπορά, 20 μΙ χρωστικής προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο που περιέχει 100 μΐ μέσου καλλιέργειας και επωάζονται για 4 ώρες στους 37 ° C. Ο φθορισμός μετρήθηκε με την πλάκα ανάγνωσης φθορόμετρο Fluostar Optima (2001, BMG Labtechnology, έκδοση λογισμικού 1,10 με μηδέν) και παρουσιάζονται ως ο λόγος της τιμής στο μήκος κύματος διέγερσης (560 nm) πάνω από το μήκος κύματος εκπομπής (590 nm). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε από τη διαφορά μεταξύ της έντασης φθορισμού στο τελικό χρονικό σημείο και την τιμή που λαμβάνεται κατά την ημέρα της σποράς των κυττάρων (ημέρα 0).

In vivo

Αναδίπλωση Δοκιμασία

σε δοκιμασία vivo αναδίπλωσης διεξήχθη ουσιαστικά σύμφωνα με την μέθοδο που περιγράφεται από [38]. ΗΕΚ-293 σε ένα πιάτο -confluent 70% 10 cm τα οποία επιμολύνθηκαν με κατασκευή β-ακτίνης-φωτιά fly λουσιφεράσης (2 μg), pcMV6-GRP78 (3 μg), Bag-1 ή Bag-1 πεπτιδίων σε pcDNA3.1-HA (6 μg) και το κατασκεύασμα λουσιφεράσης Renilla (0.5 μg) για τον έλεγχο της ίσης διαμόλυνση. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση τα κύτταρα χωρίστηκαν σε δύο και επωάζονται σε ρυθμιστικό θερμικού σοκ (MOPS 20 mM και κυκλοεξιμίδιο 20 μg /ml) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Το ήμισυ των επιμολυσμένων κυττάρων ήταν θερμικό σοκ για 30 λεπτά στους 45 ° C και αφέθηκαν να ανανήψουν στους 37 ° C για 30 λεπτά. Το άλλο μισό είχε αφεθεί χωρίς θεραπεία και χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες. Στο τέλος των πειραμάτων, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, λύθηκαν και η δραστικότητα της λουσιφεράσης μετρήθηκε. Η δραστικότητα που μετρήθηκε για τη μη θερμικό σοκ κυττάρων ορίστηκε ως 100% του αναδιπλωμένου λουσιφεράσης και οι μετρήσεις δραστηριότητας του θερμικό σοκ κύτταρα εκφράστηκαν σε σχέση αυτήν την τιμή.

Στατιστική Ανάλυση

Εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά υπολογισμοί της στατιστικής σημαντικότητας σε αυτό το έργο εκτελέστηκε σύμφωνα με την δοκιμασία t του Student.

Αποτελέσματα

Τσάντες-1 αλληλεπιδρά με GRP78 /ΣΣΕ

Όπως Bag-1 έχει αναφερθεί ότι μεσολαβεί ER-στρες και να αλληλεπιδρούν με ένα από τα συστατικά του [27], [32] το UPS, διερευνήσαμε εάν δεσμεύεται επίσης να GRP78 /ΒίΡ, μία βασική συνιστώσα στην οδό ER στρες. Έχουμε καθορίζεται πρώτα αν Bag-1 αλληλεπιδρά με GRP78 /ΣΣΕ σε μία δοκιμασία pull-down GST χρησιμοποιώντας λύμα από 22Rv.1 κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας ένα GRP78 /ΒίΡ ειδικό αντίσωμα έδειξε ότι όλα τα μέλη της Bag-1 οικογένεια πρωτεϊνών αλληλεπίδρασε με GRP78 /ΒίΡ (Σχήμα 1Α).

In vivo

αλληλεπίδραση καταδείχθηκε επίσης σε μία δοκιμασία συν-ανοσοκατακρήμνισης με τον οποίο Bag-1 δείχθηκε να συνδέεται προς GRP78 /ΒίΡ σε 22Rv.1 κύτταρα (Εικόνα 1Β). Επιπλέον, θα μπορούσαμε να δείξουμε ένα περιπυρηνική εντοπισμό των Bag-1 και GRP78 /ΣΣΕ σε μια δοκιμασία ανοσοφθορισμού χρησιμοποιώντας 22Rv.1 κύτταρα (Σχήμα 1Γ) υπονοώντας μια ER εντοπισμό των Bag-1. Η διαπίστωση αυτή επιβεβαιώθηκε σε ένα άλλο πείραμα ανοσοφθορισμού όπου θα μπορούσαμε να δείξουμε συνεντόπισης τσάντα-1 με ένα ER tracker (Σχήμα S1).

Για τον προσδιορισμό του τομέα της GRP78 /ΣΣΕ εμπλέκονται στη δέσμευση της να Bag-1, που κατασκευές μεταχειρισμένα GST-σύντηξη των δύο κύριες περιοχές της GRP78 /ΣΣΕ (το ΑΤΡ και το υπόστρωμα πεδίο σύνδεσης-SBD) (Σχήμα 1D) σε πειράματα pull-down με τα κύτταρα ΗΕΚ-293 που υπερεκφράζουν Bag-1. Ανάλυση κηλίδας Western έδειξε ότι Bag-1 αλληλεπιδρά όχι μόνο με το πλήρες GRP78 μήκος /ΣΣΕ αλλά και με ΑΤΡ και SBD του (Σχήμα 1 Ε). Όπως Bag-1 αναφέρεται ότι δεσμεύονται με την περιοχή δέσμευσης ΑΤΡ της μοριακής συνοδού Hsp70 /Hsp 70 [39] και GRP78 /ΒίΡ ανήκει σε αυτή την οικογένεια των συνοδών [40], το εύρημα μας ότι η SBD του GRP78 /ΒίΡ δεσμεύεται επίσης από Bag-1 είναι μάλλον ενδιαφέρουσα και προσδιορίζει μια νέα θέση αλληλεπίδραση Bag-1 στην οικογένεια μοριακών συνοδών. Ως εκ τούτου, χρησιμοποίησε το SBD της GRP78 /ΣΣΕ σε περαιτέρω χαρακτηρισμό της αλληλεπίδρασης των GRP78 /ΣΣΕ με Bag-1.

Α. Η τσάντα-1 οικογένεια πρωτεϊνών δεσμεύει GRP78 /ΣΣΕ. δοκιμασία pull-down GST Διεξήχθη επώαση 5 μg από κάθε GST-συντηγμένο Bag-1 πρωτεϊνών με 400 μα κυτταρικού λύματος 22Rv.1. Κηλίδωση Western με ένα συγκεκριμένο antibodiy κατά GRP78 /ΒίΡ χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει την δέσμευση και ένα αντίσωμα αντι-GST χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το ποσό του βακτηριακά καθαρισμένη πρωτεΐνη χρησιμοποιείται στη δοκιμασία. Β Bag-1 και GRP78 αλληλεπιδρούν

in vivo

. GRP78 ανοσοκαταβυθίστηκε με ένα /ΒίΡ αντίσωμα αντι-GRP78 ή IgG ως έλεγχο σε 22Rv.1 κύτταρα. Κηλίδωση Western με αντι-Bag-1 και αντι-GRP78 αντίσωμα διεξήχθη για να προσδιοριστεί η αλληλεπίδραση GRP78-Bag-1. Γ Bag-1 και GRP78 /ΣΣΕ παρουσιάζουν περιπυρηνική colocalization. Ομοεστιακή μικροσκοπικές αναλύσεις διεξήχθησαν σε 22Rv.1 κύτταρα που έχουν παραφορμαλδεΰδη-σταθεροποιήθηκαν και χρωματίσθηκαν με ένα αντίσωμα Bag-1 για την ανίχνευση Bag-1 (πράσινο κανάλι) και /ειδικού αντισώματος ΒίΡ GRP78 να ανιχνεύσει GRP78 /ΒίΡ (κόκκινο κανάλι) . Η χρώση πορτοκαλί στη συγχώνευση των δύο καναλιών υποδεικνύει το βαθμό συν-εντοπισμό των δύο πρωτεϊνών. Όλες οι εικόνες (40Χ) αποκτήθηκαν με μια Leica TCS SPE συνεστιακό μικροσκόπιο (Leica Microsystems? Κλίμακα μπάρες δείχνουν 25 μm). Δ Σχηματική απεικόνιση των τομέων της GRP78. Ε Bag-1 δεσμεύεται σε πολλαπλές τοποθεσίες για GRP78. GST-γκρεμίζουν προσδιορισμός που εκτελείται επώαση 500 μg λύμα των κυττάρων ΗΕΚ-293 επιμολυσμένα με ένα ΗΑ-tagged Bag-1 και 10 μg ΟδΤ-συντηγμένη GRP78 πλήρους μήκους και τομέα του ΑΤΡάσης και υπόστρωμα πρόσδεσης (SBD). Η ανάλυση στυπώματος Western εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας αντίσωμα ΗΑ για την ανίχνευση της Bag-1-tagged πρωτείνης. Εμφανίζεται είναι Coomassie blue χρώση των βακτηριακώς καθαρισμένων πρωτεϊνών GST για να αποδειχθεί ίση φόρτωση των πρωτεϊνών GST.

Η

GST-pull down αναλύσεις έγιναν με τη SBD του GRP78 /ΒίΡ και προϊόν λύσεως κυττάρων ΗΕΚ293 που εκφράζει την άγριου τύπου Bag-1, Bag-1ΔC47, ένα C-τελικό μετάλλαγμα εξάλειψης ή Bag-1Δ68mer, μια εσωτερική μετάλλαξη διαγραφής. Οι μελέτες αυτές προσδιορίζονται μια εσωτερική αλληλουχία 68 αμινοξέων ως στόχος της αλληλεπίδρασης του Bag-1 με GRP78 /ΒίΡ (Σχήματα 2Α και Β). Η διαγραφή αυτής της αλληλουχίας (Bag-1Δ68mer) εξάλειψε την αλληλεπίδραση των Bag-1 με GRP78 /ΒίΡ (Σχήμα 2Β λωρίδα 11), ενώ η έκφραση της αλληλουχίας 68 αμινοξέων και μόνο έδειξε ότι απαιτείται πράγματι για τη δέσμευση του SBD του GRP78 /ΒίΡ ( Σχήμα 2Β λωρίδα 12). Αυτό το εύρημα επιβεβαιώθηκε περαιτέρω σε ένα

in vivo

πείραμα συνανοσοκαθίζησης όπου ένα ΗΑ-tagged Bag-1 πεπτίδιο που εκφράζεται σε κύτταρα ΗΕΚ 293 αλληλεπίδρασε με ενδογενή GRP78 /ΒίΡ πρωτεΐνη (Σχήμα 2C λωρίδα 3).

Α. Σχηματική απεικόνιση της Bag-1 και μεταλλάξεων διαγραφής της που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό των αλληλουχιών που απαιτούνται για τη δέσμευση του SBD του GRP78 /ΒίΡ. Απεικονίζονται σε μπλε και κόκκινο είναι τα ουμπικουϊτίνης-όπως τομέα και τον τομέα BAG αντίστοιχα. B. Ταυτοποίηση του πεπτιδίου Bag-1 σύνδεση με GRP78 /ΣΣΕ. GST-γκρεμίζουν προσδιορισμός που εκτελείται επώαση 500 μg προϊόντα λύσης από κύτταρα ΗΕΚ-293 επιμολυσμένα με τα υποδεικνυόμενα κατασκευάσματα Bag-1 και 10 μg της GST-GRP78 (SBD) ή GST ως έλεγχος. Η ανάλυση στυπώματος Western με ένα αντίσωμα ΗΑ να ανιχνευθούν τα μεταλλάγματα Bag-1 παρουσιάζεται. μπλε βαφή Coomassie πραγματοποιήθηκε για να καταδειχθεί ίση φόρτωση των πρωτεϊνών σύντηξης GST. C. Η τσάντα-1 68 αμινοξέων πεπτίδιο δεσμεύεται

in vivo

να GRP78. Τα κύτταρα ΗΕΚ 293 συν-επιμολύνθηκαν με pcDNA-ΗΑ-tagged Bag-1 πεπτίδιο. Τα επιμολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 mM διθειοδις (ηλεκτριμιδυλπροπιονικό) για σταυρωτή σύνδεση των πρωτεϊνών και τα κυτταρολύματα ανοσοκατακρημνίστηκαν με αντίσωμα αντι-ΗΑ IgG ή ως έλεγχος, που ακολουθείται από κηλίδωση Western με ένα αντίσωμα αντι-GRP78 /ΒίΡ. Δ Το πεπτίδιο 68 αμινοξέων Bag-1 αναστέλλει GRP78 δραστηριότητα αναδίπλωση /ΣΣΕ.

In vivo

λουσιφεράσης αναδίπλωσης δοκιμασία πραγματοποιήθηκε σε κύτταρα ΗΕΚ-293 διαμολυνθέντα σε 70% συρροή με κατασκεύασμα λουσιφεράσης μύγα 2 μg β-ακτίνης-φωτιά, 3 μg pcDNA3 άδειο φορέα σαν έλεγχο ή pCMV6-GRP78 /Bip, 6 μg του υποδεικνυόμενου κατασκευάσματος λουσιφεράσης Renilla pcDNA3.1-Bag-1 ή μεταλλαγμένες κατασκευές και 0,5 μg για τον προσδιορισμό της αποτελεσματικότητας της επιμόλυνσης. Τα επιμολυσμένα κύτταρα χωρίστηκαν σε δύο. Το ένα ήμισυ αφεθεί χωρίς θεραπεία και το άλλο μισό είχε θερμικό σοκ στους 45 ° C για 30 λεπτά. Στη συνέχεια μετρήθηκε η δραστικότητα λουσιφεράσης. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό της αναδίπλωσης δραστικότητα σε σχέση με μη-θερμικό σοκ κύτταρα και παρουσιάζονται ως ιστογράμματα του μέσου όρου των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SEM. * P & lt?. 0.05

Η

Α. UPR διαμόρφωσης κατά Bag-1 πεπτίδιο υπερέκφραση. Συγκεντρωτικά κλώνοι κυττάρων 22Rv.1 επιμολυσμένα με pcDNA3.1-HA-Bag-1 πεπτίδιο οξύ 68 αμινοξέα ή ένα άδειο φορέα έκφρασης υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 300 ηΜ θαψιγαργίνη (TG) για τα υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western, χρησιμοποιώντας τα υποδεικνυόμενα αντισώματα ή φωσφο-ειδικά αντισώματα. B. Η τσάντα-1 πεπτίδιο ευαισθητοποιεί τα κύτταρα 22Rv.1 να ER-στρες που προκαλείται απόπτωση. Συγκεντρωτικά κλώνοι 22Rv.1 επιμολυσμένα με το πεπτίδιο Bag-1 ή τον κενό φορέα έκφρασης υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θαψιγαργίνη (TG) ή γλυκόζη-πεινασμένο (GS) για 24 ώρες. Τα κύτταρα λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας αντι-PARP και κασπάσης 4 ειδικά αντισώματα. Αντι-ΗΑ αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για να ανιχνεύσει το πεπτίδιο ΗΑ-Bag-1. αντίσωμα αντι-β-ακτίνης χρησιμοποιήθηκε για να καταδείξει ίση φόρτωση των δειγμάτων πρωτεΐνης. Γ GRP78 αρνητική ρύθμιση αυξάνει την διάσπαση PARP. Συγκεντρωτικά κλώνοι 22Rv.1 εκφράζουν ΗΑ-tagged Bag-1 πεπτίδιο ή ένα άδειο φορέα έκφρασης επιμολύνθηκαν με GRP78 /ΒίΡ siRNA ή ελέγχου GFP siRNA. Τα κύτταρα λύθηκαν και στύπωμα Western διεξήχθη με αντι-PARP, αντι-GRP78 και αντισώματα αντι-ΗΑ. β-ακτίνης αντίσωμα χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το επίπεδο της πρωτεΐνης φορτώθηκαν στο πήκτωμα.

Η

Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η GRP78 /ΒίΡ συνεργάζεται με PDI σε αναδίπλωση μετουσιωμένες πρωτεΐνες

in vitro

[ ,,,0],41], [42]. Για να προσδιορίσετε αν GRP78 /ΣΣΕ έχει επίσης τη δυνατότητα να διπλώσει μετουσιωμένες πρωτεΐνες

in vivo

, υιοθετήσαμε μια αναδίπλωση δοκιμασία που χρησιμοποιήθηκε στο παρελθόν για τον προσδιορισμό της δραστηριότητας συνοδός της Hsp70

in vivo

[43] Σε αυτό το προσδιορισμό, κύτταρα ΗΕΚ-293 μορφομετατράπηκαν με ένα πλασμίδιο που κωδικοποιεί ένα γονίδιο λουσιφεράσης και ένα πλασμίδιο έκφρασης για GRP78 /ΒίΡ. Τα κύτταρα εν συντομία σε θερμικό σοκ και στη συνέχεια η δράση της λουσιφεράσης των επιμολυσμένων κυττάρων που εκφράζουν GRP78 /ΒίΡ συγκρίθηκε με εκείνη των κυττάρων που εκφράζουν μη-GRP78 /ΒίΡ. Αυτή η μελέτη έδειξε ότι η υπερέκφραση του GRP78 /ΒίΡ σημαντικά ενισχυμένη δραστικότητα λουσιφεράσης μετά τη θερμικού σοκ (Εικόνα 2D) αποδεικνύοντας την ικανότητα του GRP78 /ΒίΡ να αναδιπλωθεί μετουσιωμένο λουσιφεράσης

in vivo

. Εάν τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με επιπρόσθετα Bag-1 ή το 68 αμινοξέων Bag-1 πεπτίδιο που προσδένεται GRP78 /ΒίΡ, τη δραστηριότητα αναδίπλωση GRP78 /ΒίΡ μειώθηκε στο επίπεδο αναφοράς (Σχήμα 2D). Αυτό δεν ήταν η περίπτωση όταν Σακούλα 1Δ68mer που δεν δεσμεύει GRP78 /ΣΣΕ συνμετήχθη. Οι μελέτες αυτές αποδεικνύουν ότι το πεπτίδιο Bag-1 αλληλεπιδρά με την δραστικότητα αναδίπλωση του GRP78 /ΒίΡ. Ωστόσο, το πεπτίδιο Bag-1 δεν είχε καμία επίδραση στη δραστικότητα ΑΤΡάσης της GRP78 /ΣΣΕ αν Bag-1 αυξάνεται αυτή την ενζυματική δραστηριότητα (Εικόνες S2A και S2B). Αυτό δείχνει ότι το πεπτίδιο λειτουργίες Bag-1 διαφορετικά από πλήρους μήκους Bag-1. Ως εκ τούτου, ξεκίνησε τον χαρακτηρισμό του πεπτιδίου αυτού ως συνδέτης για GRP78 /ΒίΡ για μελλοντική θεραπευτική χρήση.

A. Σταθεροί κλώνοι των 22Rv.1 κύτταρα δείχνουν μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων

in vitro

. Σταθεροί κλώνοι σπάρθηκαν σε 96 φρεατίων πλάκα και ο αριθμός των κυττάρων σε κάθε φρεάτιο εκτιμήθηκε με μέτρηση της αναλογίας μεταξύ του μήκους κύματος διέγερσης και εκπομπής 560/590 nm χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό πολλαπλασιασμού CellTiter-Μπλε ™. Τα ιστογράμματα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή από τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα ± SD (* ρ & lt? 0,05). B. Προσδιορισμός του επιπέδου της Bag-1 εκφράζεται στα 22Rv.1 κλώνους. Κυτταρικά εκχυλίσματα από 22v.1 σταθερών κλώνων υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Ένα αντίσωμα αντι-ΗΑ χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση του πεπτιδίου και ένα αντι-β-ακτίνης αντίσωμα για την ίση έλεγχος φόρτωσης. CD. Το πεπτίδιο Bag-1 μειώνει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του προστάτη 22Rv.1

in vivo

. Ηλικίας έξι εβδομάδων αθυμικά γυμνά ποντίκια ενέθηκαν υποδορίως σε αμφότερες τις πλευρές με 5 × 10

6 κύτταρα κάθε σταθερός κλώνος. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε μία φορά την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ένα παχύμετρο και εκφράζεται ως όγκος του όγκου σε mm

3. Δεικνύονται (Γ) οι όγκοι του όγκου των κλώνων επιμολυσμένα με κενό φορέα έκφρασης και (D) κλώνους που εκφράζουν το πεπτίδιο Bag-1. Κάθε σημείο αντιπροσωπεύει την μέση ένταση και τυπική απόκλιση τουλάχιστον 5 έως 10 όγκους. Ε Ξενομοσχεύματα σταθερών κλώνων που εκφράζουν την τσάντα-1 πεπτίδιο δείχνουν αυξημένη απόπτωση. τομές πέντε μικρομέτρων του μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη, εγκλεισμένους σε παραφίνη ιστούς όγκων υποβλήθηκαν σε ανοσοϊστοχημεία. Οι πυρήνες βάφονται μπλε-μωβ με αιματοξυλίνη ενώ τα αποπτωτικά κύτταρα ανιχνεύθηκαν με τη δοκιμασία TUNEL βάφονται καφέ. Εκπρόσωπος τμήματα ξένων μοσχευμάτων που λαμβάνονται από κάθε 22Rv.1 σταθερό κλώνο αποκτήθηκαν με ένα μικροσκόπιο Axioscop (Zeiss). V: σημαίνει άδειο φορέα που εκφράζει τον κλώνο και P:. Πεπτίδιο που εκφράζει τον κλώνο

Η

Αξιοποίηση ενός Bag-1 πεπτιδίου να επάγει απόπτωση και μείωση του καρκίνου του προστάτη ανάπτυξη κυττάρων

Κατά τη διάρκεια της ER στρες, εκτυλίχθηκε πεπτίδια συσσωρεύονται στο ER και GRP78 /ΣΣΕ διαδραματίζει καίριο ρόλο για τη ρύθμιση της ικανότητας αναδίπλωσης πρωτεϊνών, ενεργοποιώντας τρεις οδούς σηματοδότησης (PERK, IRE1α και ATF6) [44], [45]. PERK υφίσταται αυτοφωσφορυλίωση οδηγεί στην φωσφορυλίωση της αλφα υπομονάδας της eIF2 και τη σύνθεση πρωτεϊνών απενεργοποίησης. Η φωσφορυλιωμένη eIF2α ενισχύει επιλεκτικά μετάφραση του παράγοντα μεταγραφής ATF4 που αυξάνει UPR έκφραση του γονιδίου-στόχου όπως GRP78 /ΒίΡ [44], [45] και IRE1α επίσης αυτοφωσφορυλιωμένης οδηγεί στην ενεργοποίηση της συνθέσεως συνοδού μέσω ενεργοποίησης Xbp1. ATF6 διασπάται πρωτεολυτικά να λάβουν μέρος στην προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης των γονιδίων στόχων UPR [44], [45]. Ωστόσο απόπτωση επάγεται εάν ομοιόστασης δεν μπορεί να καθοριστεί [46]. Ως εκ τούτου, καθορίζεται αν η σύνδεση του Bag-1 πεπτίδιο να GRP78 /ΣΣΕ, το βασικό συστατικό του ER στρες, επηρεάζει τα μονοπάτια σηματοδότησης του UPR.

Α. Σχηματικό διάγραμμα της Bag-1 πεπτιδίου και μεταλλάγματα διαγραφής του. Η περιοχή ουβικιτίνης-όπως αναπαρίσταται στο μπλε και του τομέα BAG με κόκκινο χρώμα. Οι αριθμοί αναφέρονται στις θέσεις αμινοξέων των διαφόρων τομέων. Τα υπολείμματα αμινοξέων αριθμούνται ακολουθώντας την αρίθμηση για τσάντα-1L. Β πρόβλεψη της δευτεροταγούς δομής του πεπτιδίου Bag-1, που δείχνει μία Ν-τερματική β-φουρκέτας από την ubiquitin-όπως τομέα (μπλε) και ένα Ο-τερματικό α-έλικα από τον τομέα BAG (κόκκινο). Γ ομαλοποιημένου φάσματα κυκλικού διχρωισμού των πεπτιδίων Bag-1. 30 μΜ του πεπτιδίου Bag-1 μετρήθηκαν σε 20 mM KHPO

4, ρΗ 6.8 (μαύρη γραμμή). α-ελικοειδή περιεχόμενό του εκτιμήθηκε ότι είναι περίπου 25% κατά αποσυνέλιξη των φασμάτων (κόκκινη γραμμή). 12 μΜ του Ν διάρκειας πεπτίδιο (πράσινη γραμμή) και 11 μΜ C-term (μπλε γραμμή) μετρήθηκαν κάτω από τις ίδιες συνθήκες. Δ

1

15N-HSQC NMR φάσμα της

15N-επισημασμένο Bag-1 πεπτίδιο (202-269) σε 20 χιλιοστά KHPO

4 ρυθμιστικό, ρΗ 6,8, στους 23 ° C. Το στενό φασματικό διασπορά δείχνει ότι το πεπτίδιο δεν παρουσιάζει ένα διπλωμένο σφαιρική δομή. Η H

δ και H

ε σήματα πλευρική αλυσίδα ασπαραγίνης και γλουταμίνης συνδέονται με λεπτές γραμμές. Ε Η Ν-τερματική περιοχή του πεπτιδίου Bag-1 είναι σημαντική για τη δέσμευση GRP78. 400 μα κυτταρικού λύματος 22Rv.1 επωάστηκαν με σφαιρίδια γλουταθειόνης-αγαρόζης που μεταφέρουν 15 μg GST-Ν-όρος πεπτίδιο (διαδρομή 2), GST-C-term πεπτίδιο (διαδρομή 3), GST-ΔUbi πεπτίδιο (διαδρομή 4), GST * P & lt? 0,05.